pcr上岗证培训试题和答案

pcr上岗证培训试题和答案一、单项选择题（每题2分，共40分）1.聚合酶链式反应（PCR）技术的基本原理模仿的是以下哪种生物过程？A.原核生物DNA复制B.真核生物RNA转录C.病毒逆转录D.噬菌体DNA整合答案：A解析：PCR技术通过高温变性、低温退火、适温延伸的循环过程，模拟了生物体内DNA半保留复制的基本原理，核心是依赖DNA聚合酶的链式扩增反应。2.以下哪种酶是常规PCR反应中最关键的酶？A.逆转录酶（RT）B.TaqDNA聚合酶C.限制性内切酶D.DNA连接酶答案：B解析：TaqDNA聚合酶具有热稳定性，能在95℃高温下保持活性，是PCR循环中延伸步骤的核心酶。逆转录酶用于RT-PCR，其他酶不直接参与扩增。3.PCR反应体系中，dNTP的主要作用是？A.提供反应缓冲环境B.作为DNA合成的原料C.稳定引物与模板结合D.激活聚合酶活性答案：B解析：dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）是DNA链延伸的基本原料，在聚合酶作用下，其α-磷酸基团与前一个核苷酸的3'-OH形成磷酸二酯键，完成链的延长。4.实时荧光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenI染料的作用机制是？A.特异性结合双链DNA小沟区B.与引物5'端荧光基团发生FRETC.嵌入双链DNA碱基对之间D.标记探针3'端淬灭基团答案：C解析：SYBRGreenI是一种非特异性荧光染料，通过嵌入双链DNA的碱基对之间发出荧光，荧光强度与扩增产物量成正比，可用于实时监测扩增过程。5.PCR实验室分区中，以下哪个区域必须设置为负压环境？A.试剂准备区B.样本处理区C.扩增区D.产物分析区答案：B解析：样本处理区（核酸提取区）是最易产生气溶胶污染的区域，需设置为负压（相对于其他区域），防止含核酸的气溶胶扩散到其他清洁区。6.进行PCR实验时，若引物设计存在严重二聚体，最可能导致的结果是？A.扩增产物量显著增加B.非特异性扩增条带C.Ct值提前D.熔解曲线出现单峰答案：B解析：引物二聚体是引物自身或引物之间互补配对形成的小片段，会与目标模板竞争聚合酶和dNTP，导致非特异性扩增，电泳时出现多条杂带。7.以下哪种措施不能有效预防PCR实验室的交叉污染？A.不同区域使用专用移液器B.扩增产物离心后再开盖C.每日用75%乙醇擦拭实验台面D.样本处理区使用带滤芯吸头答案：C解析：75%乙醇主要用于杀灭细菌等微生物，对DNA/RNA无降解作用。预防核酸污染需使用含1%次氯酸钠的溶液或DNA酶清除剂，乙醇无法有效去除残留核酸。8.某qPCR实验中，阴性对照出现明显扩增曲线（Ct值＜35），最可能的原因是？A.引物浓度过低B.模板量过高C.试剂被污染D.退火温度过高答案：C解析：阴性对照应无扩增，若出现Ct值，说明反应体系（如引物、dNTP、水等）或操作过程中引入了目标核酸污染，需排查试剂来源和操作规范。9.逆转录PCR（RT-PCR）中，逆转录反应的关键温度参数是？A.95℃变性B.55℃退火C.42℃延伸D.72℃终延伸答案：C解析：逆转录酶（如M-MLV）的最适反应温度通常为42℃左右，在此温度下，引物与RNA模板结合，酶催化合成cDNA第一条链。10.PCR扩增效率（E）的计算公式是？A.E=10^(-1/斜率)-1B.E=斜率×10-1C.E=10^(斜率)-1D.E=1/斜率×10-1答案：A解析：通过标准曲线法计算扩增效率时，斜率（S）与效率的关系为E=10^(-1/S)-1，理想效率为1（即100%），对应斜率约为-3.32。11.以下哪种情况会导致PCR产物出现“smearedband”（拖尾条带）？A.模板浓度过低B.dNTP浓度过高C.退火温度过高D.引物浓度过低答案：B解析：dNTP浓度过高会增加聚合酶的错误掺入率，导致非特异性扩增产物长度不一，电泳时呈现拖尾。模板过低可能无条带，退火温度过高可能无扩增，引物过低可能扩增效率下降。12.生物安全柜的主要作用是？A.保持实验环境恒温B.防止实验人员接触感染性物质C.提高PCR扩增效率D.减少气溶胶对环境的污染答案：B解析：生物安全柜通过定向气流和高效过滤器（HEPA），既保护实验样本免受外界污染（一级防护），又防止实验人员接触有害气溶胶（二级防护），属于生物安全防护设备。13.qPCR实验中，内参基因（如GAPDH）的主要作用是？A.验证引物特异性B.校正样本上样量差异C.提高扩增灵敏度D.指示反应体系污染答案：B解析：内参基因是样本中稳定表达的基因，用于校正不同样本间的核酸提取效率、上样量差异，确保目标基因表达量的相对定量准确。14.PCR实验室“单一流向”原则是指？A.人员从清洁区到污染区单向移动B.试剂从扩增区向样本处理区移动C.废弃物从样本处理区向试剂准备区移动D.仪器设备在各区域间自由调配答案：A解析：为避免交叉污染，人员、物品需严格遵循“试剂准备区→样本处理区→扩增区→产物分析区”的单向流动，禁止逆向移动。15.以下哪种物质可用于灭活RNA酶？A.DEPC水（焦碳酸二乙酯处理水）B.75%乙醇C.生理盐水D.双蒸水答案：A解析：DEPC是RNA酶的强抑制剂，通过与RNA酶的组氨酸残基结合使其失活，常用于配制RNA实验用的缓冲液和水。乙醇无法有效灭活RNA酶。16.某PCR实验电泳结果显示“无目标条带，但阳性对照正常”，最可能的原因是？A.引物设计错误B.热循环仪温度不准确C.样本核酸降解D.dNTP浓度过高答案：C解析：阳性对照正常说明反应体系和仪器无问题，样本无条带可能是核酸提取失败（如裂解不充分）或提取后保存不当导致降解。17.实时荧光定量PCR中，“Ct值”的定义是？A.荧光信号达到基线时的循环数B.荧光信号超过阈值时的循环数C.扩增曲线平台期的荧光强度D.熔解曲线的峰值温度答案：B解析：Ct（CycleThreshold）值指荧光信号强度超过设定阈值（通常为基线标准差的10倍）时所对应的循环次数，与初始模板量呈对数负相关。18.以下哪种PCR技术可用于单核苷酸多态性（SNP）检测？A.多重PCRB.巢式PCRC.等位基因特异性PCR（AS-PCR）D.反向PCR答案：C解析：AS-PCR通过设计特异性引物（3'端与SNP位点匹配），利用Taq酶对3'端错配的敏感性，选择性扩增目标等位基因，从而检测SNP。19.PCR实验室中，紫外线消毒的最佳波长是？A.254nmB.365nmC.405nmD.546nm答案：A解析：254nm紫外线可破坏DNA/RNA的嘧啶二聚体，有效降解残留核酸，是实验室台面、空气消毒的常用波长。20.进行核酸提取时，若样本为全血，常用的抗凝剂是？A.肝素B.EDTAC.枸橼酸钠D.草酸钾答案：B解析：肝素会抑制Taq酶活性，影响后续PCR扩增；EDTA通过螯合Mg²+抗凝，对PCR无抑制，是核酸提取的首选抗凝剂。二、多项选择题（每题3分，共30分，多选、少选、错选均不得分）1.PCR实验室的“四区”包括以下哪些？A.试剂准备区B.样本处理区C.扩增区D.产物分析区答案：ABCD解析：PCR实验室需严格分区为试剂准备区（配制反应体系）、样本处理区（核酸提取）、扩增区（PCR扩增）、产物分析区（电泳或qPCR分析），四区独立，避免交叉污染。2.影响PCR特异性的主要因素包括？A.引物设计B.退火温度C.Mg²+浓度D.循环次数答案：ABC解析：引物特异性（是否与非目标序列结合）、退火温度（过低易非特异性结合）、Mg²+浓度（过高增加酶活性导致错配）直接影响扩增特异性；循环次数主要影响产物量，不直接影响特异性。3.以下哪些操作符合PCR实验室生物安全规范？A.样本处理时佩戴N95口罩B.扩增产物在生物安全柜内开盖C.实验后用次氯酸钠溶液消毒台面D.废弃的离心管直接投入普通垃圾桶答案：ABC解析：样本处理（尤其感染性样本）需佩戴N95口罩防护；扩增产物含大量目标核酸，需在生物安全柜内操作防止气溶胶扩散；次氯酸钠可降解核酸，用于消毒；废弃的含核酸物品需高压灭菌后按医疗废物处理，不可直接丢弃。4.实时荧光定量PCR的定量方法包括？A.绝对定量B.相对定量C.内标法D.外标法答案：ABCD解析：绝对定量通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，计算样本拷贝数；相对定量以管家基因校正，比较目标基因表达差异；内标法（样本内加入已知量参照）和外标法（标准品与样本分开扩增）均为常用策略。5.核酸提取过程中，常用的裂解液成分包括？A.蛋白酶KB.十二烷基硫酸钠（SDS）C.三羟甲基氨基甲烷（Tris）D.乙二胺四乙酸（EDTA）答案：ABCD解析：蛋白酶K降解蛋白质，释放核酸；SDS破坏细胞膜和核膜；Tris维持pH稳定；EDTA螯合Mg²+，抑制核酸酶活性，均为裂解液常见成分。6.以下哪些情况可能导致qPCR熔解曲线出现双峰？A.引物二聚体B.扩增产物存在两种不同长度的片段C.模板存在SNP位点D.荧光染料浓度过高答案：ABC解析：熔解曲线反映双链DNA解链温度（Tm值），引物二聚体（短片段，Tm低）、不同长度产物（不同Tm）、SNP导致的序列差异（Tm变化）均会产生双峰；染料浓度不影响Tm值。7.PCR反应体系中，Mg²+的作用包括？A.激活TaqDNA聚合酶B.稳定引物与模板的结合C.影响dNTP的解离D.抑制非特异性扩增答案：ABC解析：Mg²+是Taq酶的辅因子，参与酶活性中心形成；可中和DNA磷酸基团的负电荷，稳定引物-模板复合物；dNTP、引物等带负电荷的成分会与Mg²+结合，因此Mg²+浓度直接影响游离Mg²+水平，进而影响扩增效率和特异性（过高可能增加非特异性）。8.以下哪些措施可提高PCR扩增效率？A.优化引物浓度B.增加模板量（超过10^6拷贝）C.调整退火温度至引物Tm值附近D.使用热启动Taq酶答案：ACD解析：引物浓度过低或过高均会影响效率；模板量过高可能导致抑制剂积累或非特异性扩增；退火温度接近引物Tm值（通常Tm-5℃）可提高结合效率；热启动酶通过抑制低温下的非特异性扩增，提高目标产物得率。9.核酸提取质量的评估方法包括？A.紫外分光光度法测A260/A280比值B.琼脂糖凝胶电泳观察条带完整性C.qPCR检测内参基因Ct值D.肉眼观察提取液颜色答案：ABC解析：A260/A280比值（1.8-2.0为DNA纯，2.0-2.2为RNA纯）评估纯度；电泳观察条带（如基因组DNA的高分子量条带、RNA的28S/18S条带）评估完整性；qPCR内参Ct值可反映提取效率；颜色无法准确评估质量。10.PCR实验室的人员防护装备（PPE）应包括？A.一次性手套B.实验室白大衣C.护目镜D.鞋套答案：ABCD解析：手套防止直接接触样本；白大衣隔离实验服与便服；护目镜防护气溶胶溅入眼睛；鞋套避免鞋底污染实验室环境，均为基本防护装备。三、判断题（每题1分，共10分，正确打“√”，错误打“×”）1.PCR实验中，不同区域的移液器可以交叉使用，只要用酒精消毒即可。（）答案：×解析：移液器可能残留核酸，不同区域的移液器需专用，禁止交叉使用，酒精无法有效去除核酸污染。2.实时荧光定量PCR的结果分析中，Ct值越小，说明初始模板量越少。（）答案：×解析：Ct值与初始模板量呈对数负相关，Ct值越小，初始模板量越多。3.核酸提取时，离心步骤的主要目的是沉淀蛋白质和细胞碎片，保留核酸在上清中。（）答案：√解析：裂解后，离心可分离核酸（溶解于上清）与蛋白质、细胞碎片（沉淀），实现初步纯化。4.为节省时间，PCR反应结束后可直接在扩增区进行产物电泳检测。（）答案：×解析：产物分析区需独立于扩增区，避免扩增产物（高浓度核酸）污染其他区域，需严格遵循单一流向。5.TaqDNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性，因此有校正功能。（）答案：×解析：Taq酶无3'→5'外切酶活性（无校正功能），Pfu酶等具有此活性，可减少扩增错误。6.进行RT-PCR时，若样本为RNA，需先进行逆转录反应生成cDNA，再进行PCR扩增。（）答案：√解析：RT-PCR的流程是RNA→cDNA（逆转录）→cDNA的PCR扩增，需两步反应（或一步法合并）。7.实验室紫外线消毒时间应至少30分钟，且需在无人状态下进行。（）答案：√解析：紫外线穿透力弱，需直接照射30分钟以上才能有效消毒；紫外线对人体有害，消毒时人员需离开。8.引物设计时，GC含量应控制在40%-60%，避免连续3个以上G或C碱基。（）答案：√解析：GC含量过高易形成二级结构，过低影响引物与模板结合；连续G/C可能导致引物二聚体或非特异性结合。9.为提高灵敏度，PCR反应体系中dNTP浓度越高越好。（）答案：×解析：dNTP浓度过高会增加成本，且可能导致聚合酶错误掺入，降低扩增特异性。10.生物安全柜使用完毕后，应立即关闭电源，无需继续运行。（）答案：×解析：生物安全柜使用后需继续运行10-15分钟，确保内部残留气溶胶被过滤，再关闭电源。四、简答题（每题5分，共20分）1.简述PCR反应的三个基本步骤及其温度范围。答案：PCR反应包括三个基本步骤：（1）变性：94-98℃，使双链DNA解链为单链；（2）退火：50-65℃（通常为引物Tm值-5℃），引物与单链模板特异性结合；（3）延伸：72℃（Taq酶最适温度），Taq酶以dNTP为原料，从引物3'端延伸合成新的DNA链。2.列举PCR实验室质量控制的主要措施（至少5项）。答案：（1）分区管理：严格划分四区，遵循单一流向；（2）试剂控制：使用经验证的试剂盒，定期检测试剂空白；（3）人员培训：操作前需通过考核，规范穿戴PPE；（4）阳性/阴性对照：每批实验设置阳性（已知阳性样本）、阴性（无模板水）对照；（5）仪器校准：定期校准热循环仪（温度准确性）、移液器（吸样量）；（6）环境监测：每日记录实验室温湿度，定期检测环境核酸污染（如用空白对照扩增）。3.说明qPCR中“标准曲线法”的操作流程及目的。答案：操作流程：（1）制备已知浓度的标准品（如质粒DNA、体外转录RNA），进行10倍梯度稀释（如10^7至10^2拷贝/μL）；（2）对每个梯度标准品进行qPCR扩增，记录Ct值；（3）以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；（4）根据样本的Ct值，从标准曲线上查得对应的模板浓度。目的：通过标准曲线计算样本中目标核酸的绝对拷贝数（绝对定量），或验证扩增效率（斜率反映效率，R²反映线性关系）。4.分析PCR扩增失败（无目标条带）的可能原因及解决方法（至少5项）。答案：可能原因及解决方法：（1）模板问题：核酸降解（提取后保存不当）→优化提取方法，使用RNase/DNase抑制剂；模板量过低→增加模板量或减少稀释倍数；（2）引物问题：引物设计错误（如跨内含子设计不当）→重新设计引物，BLAST验证特异性；引物降解（保存不当）→分装保存，避免反复冻融；（3）反应体系问题：Mg²+浓度过低→调整Mg²+浓度（通常1.5-2.5mmol/L）；dNTP浓度过低→检查dNTP浓度，确保新鲜配制；（4）仪器问题：热循环仪温度不准确（如变性温度不足）→用温度验证仪校准仪器；（5）酶问题：Taq酶失活（反复冻融）→分装保存，使用新鲜酶；酶量不足→适当增加酶浓度；（6）污染问题：反应体系被抑制剂污染（如肝素、EDTA过量）→优化提取步骤，去除抑制剂。五、案例分析题（10分）某临床实验室进行新冠病毒核酸检测时，出现以下情况：-阳性对照（已知阳性样本）Ct值为28（正常范围25-30）；-阴性对照（无模板水）Ct值为32；-部分患者样本Ct值为38（实验室设定的阳性阈值为Ct≤40）。请分析