PCR实验室基因扩增检验人员培训试题及答案

PCR实验室基因扩增检验人员培训试题及答案一、单项选择题（每题2分，共40分）1.以下关于PCR技术基本原理的描述，错误的是：A.通过变性-退火-延伸循环实现DNA扩增B.Taq酶在延伸阶段催化dNTP聚合C.引物与模板的结合发生在变性阶段D.扩增产物长度由引物在模板上的结合位置决定2.临床基因扩增检验实验室的核心工作区域不包括：A.试剂准备区B.样本处理区C.扩增产物分析区D.清洁消毒区3.为防止扩增产物污染，实验室各区的气流方向应遵循：A.试剂准备区→样本处理区→扩增区→产物分析区（正压递减）B.产物分析区→扩增区→样本处理区→试剂准备区（正压递减）C.试剂准备区←样本处理区←扩增区←产物分析区（负压递增）D.无特殊要求，保持通风即可4.以下哪种物质可有效破坏DNA，用于实验室台面污染清除？A.75%乙醇B.10%次氯酸钠C.生理盐水D.去离子水5.实时荧光定量PCR（qPCR）中，Ct值的定义是：A.荧光信号达到设定阈值时的循环数B.扩增产物达到平台期的循环数C.引物二聚体出现的循环数D.模板初始浓度的对数6.关于PCR引物设计的基本原则，错误的是：A.引物长度通常为18-25个核苷酸B.引物GC含量应控制在40%-60%C.引物3’端避免连续相同碱基（如AAA）D.引物5’端必须与模板严格互补7.临床样本（如咽拭子）进行核酸提取时，以下操作错误的是：A.样本处理前需进行离心，去除杂质B.提取过程中需戴双层手套并及时更换C.不同样本的提取试剂可共用同一支移液器D.提取完成后需对操作台面进行紫外线消毒8.实验室质量控制中，“阴性对照”的作用是：A.验证扩增反应体系的有效性B.检测是否存在交叉污染C.评估样本核酸提取效率D.确定扩增产物的特异性9.以下哪种情况会导致qPCR结果出现“假阴性”？A.扩增区与产物分析区未严格分隔B.样本核酸提取过程中被蛋白酶K污染C.引物与模板结合区域发生突变D.荧光探针标记的报告基团降解10.实验室生物安全管理中，关于医疗废物处理的要求，错误的是：A.一次性吸头、离心管需放入专用黄色医疗废物袋B.被血液污染的实验服应高压灭菌后再清洗C.废弃的扩增产物可直接倒入普通垃圾桶D.医疗废物需由有资质的单位统一回收处理11.关于PCR实验室人员防护装备的使用，正确的是：A.进入试剂准备区需佩戴N95口罩B.样本处理区必须穿戴防水围裙C.扩增区操作时可佩戴普通一次性手套D.所有区域均需穿着专用实验服，不得穿出实验室12.以下哪项是判断PCR扩增效率是否合格的标准？A.标准曲线斜率在-3.1至-3.6之间，R²≥0.98B.熔解曲线出现单一峰，峰高≥500RFUC.阴性对照Ct值≤30D.阳性对照Ct值≥4013.进行HBV-DNA定量检测时，若样本Ct值为38（检测下限为Ct=40），应报告为：A.低于检测下限B.阳性（具体数值）C.临界值，需重复检测D.污染导致的假阳性14.实验室发生样本管破裂、内容物泄漏时，应首先：A.立即用纸巾擦拭B.关闭生物安全柜，喷洒10%次氯酸钠静置15分钟C.通知上级主管D.更换手套继续操作15.关于反转录PCR（RT-PCR）的描述，正确的是：A.仅需DNA聚合酶参与反应B.模板为RNA，需先反转录为cDNAC.无需设置内参基因D.扩增产物长度通常超过500bp16.以下哪种因素不会影响核酸提取效率？A.样本保存时间（超过48小时未冷冻）B.裂解液与样本的比例（1:1）C.磁珠吸附核酸时的温度（4℃）D.洗脱缓冲液的pH值（7.5）17.实验室日常监测中，空气洁净度检测应采用：A.沉降菌法（平板暴露法）B.肉眼观察法C.温湿度记录仪D.紫外灯辐照强度检测仪18.进行室内质量控制时，连续5次检测同一浓度质控品，结果均偏高20%，可能的原因是：A.质控品过期B.移液器校准不准确C.扩增仪温度均匀性差D.以上均可能19.关于PCR实验室记录的管理要求，错误的是：A.实验原始记录需手写，不得涂改B.电子记录需备份至专用服务器，保存期≥2年C.样本接收记录应包括编号、类型、采集时间D.设备维护记录需注明故障原因及处理措施20.以下哪种情况属于“严重违反实验室操作规范”？A.在样本处理区接听手机B.扩增产物分析区使用与试剂准备区相同的移液器C.忘记记录某管样本的提取时间D.实验结束后未关闭紫外灯二、判断题（每题1分，共10分。正确打“√”，错误打“×”）1.PCR实验室各区域可共用同一套实验服，只需每日清洗即可。（）2.为提高效率，可在样本处理区同时进行多份不同患者样本的核酸提取。（）3.阳性对照应使用已知高浓度的扩增产物，以确保显色明显。（）4.紫外灯消毒的有效距离为1米以内，照射时间应≥30分钟。（）5.若qPCR熔解曲线出现双峰，说明扩增产物存在非特异性扩增或引物二聚体。（）6.核酸提取过程中，离心管未盖紧导致液体飞溅属于一般操作失误，无需记录。（）7.实验室空调系统应设置为“内循环”模式，避免外界空气干扰。（）8.检测HIV核酸时，样本处理需在生物安全柜中进行，且生物安全柜等级至少为Ⅱ级。（）9.校准后的移液器可终身使用，无需定期复检。（）10.若某批次试剂的阴性对照出现扩增曲线（Ct=35），说明该批次试剂被污染，需停用并排查原因。（）三、简答题（每题8分，共40分）1.简述PCR实验室“四区两缓”的功能分区及气流控制要求。2.列举5种PCR实验中常见的污染类型，并说明对应的预防措施。3.阐述实时荧光定量PCR结果判读的基本流程（包括阳性、阴性、灰区样本的处理原则）。4.核酸提取质量对PCR检测结果的影响主要体现在哪些方面？如何评估提取质量？5.实验室发生扩增产物污染（如多个阴性对照出现阳性结果）时，应如何进行系统性排查？四、案例分析题（共10分）某实验室开展新型冠状病毒核酸检测时，出现以下情况：-当天检测的50份样本中，10份样本Ct值在38-40之间（检测下限为Ct=40）；-阴性对照（无模板水）Ct值为36；-阳性对照（浓度为1000拷贝/μL）Ct值为25（预期Ct值为22-24）。请分析可能的原因，并提出改进措施。参考答案一、单项选择题1.C2.D3.A4.B5.A6.D7.C8.B9.C10.C11.D12.A13.C14.B15.B16.B17.A18.D19.A20.B二、判断题1.×2.×3.×4.√5.√6.×7.×8.√9.×10.√三、简答题1.答：PCR实验室“四区两缓”指试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区4个核心功能区，以及试剂准备区与样本处理区之间、样本处理区与扩增区之间的2个缓冲间。各区域功能如下：-试剂准备区：用于扩增试剂的配制、分装和保存，需避免任何核酸污染；-样本处理区：用于样本的接收、登记、前处理（如离心、灭活）及核酸提取；-扩增区：用于PCR反应体系的配制（将提取的核酸加入反应管）及扩增反应；-产物分析区：用于扩增产物的检测（如琼脂糖凝胶电泳、荧光信号读取）。气流控制要求：各区保持严格的压力梯度，从清洁区到污染区压力递减（试剂准备区为正压最高，产物分析区为负压最低），避免污染扩散。缓冲间可设置为双向压力过渡区域，防止区与区之间空气交叉。2.答：常见污染类型及预防措施：（1）扩增产物污染：最常见，因气溶胶扩散导致。预防措施：严格分区操作，产物分析区使用专用移液器；扩增后避免开启反应管；定期用紫外线/次氯酸钠处理实验室环境。（2）交叉污染（样本间污染）：因移液器、离心管等共用导致。预防措施：样本处理时使用带滤芯吸头；不同样本处理时更换手套；提取试剂分装后单次使用。（3）试剂污染：扩增试剂（如Taq酶、dNTP）被核酸模板污染。预防措施：试剂配制在专用区域进行；使用前检测试剂空白对照；试剂分装后标注日期，避免反复冻融。（4）内源性污染：样本中存在抑制物（如血红蛋白、肝素）。预防措施：优化核酸提取方法（如增加洗涤步骤）；使用含抑制物去除功能的提取试剂盒；检测内参基因评估提取质量。（5）环境残留污染：实验室台面、仪器表面残留核酸。预防措施：每日实验后用10%次氯酸钠擦拭台面；扩增仪内部用75%乙醇清洁；定期进行环境核酸残留检测（如用阴性水模拟操作后扩增）。3.答：实时荧光定量PCR结果判读流程：（1）首先确认阴性对照（无模板水）无扩增（无Ct值或Ct>40），阳性对照Ct值在预期范围内（如20-30），内参基因（如β-actin）Ct值一致（变异系数≤5%），表明反应体系无污染且有效。（2）样本判读：-阳性：样本Ct值≤检测下限（如Ct≤40），且熔解曲线为单一峰（探针法无需熔解曲线）；-阴性：样本无Ct值或Ct>检测下限，且内参基因扩增正常（排除样本抑制）；-灰区（如Ct值在检测下限±1范围内）：需重复检测，若重复结果仍为灰区，结合临床症状或其他检测方法综合判断。（3）异常结果处理：若阴性对照阳性，需排查污染来源（环境、试剂、操作）；若阳性对照Ct值偏离预期，需检查试剂效期、扩增仪温度准确性；若内参基因未扩增，提示样本提取失败或存在抑制物，需重新提取。4.答：核酸提取质量对PCR结果的影响：（1）核酸浓度过低：可能导致假阴性（Ct值偏高或无扩增）；（2）核酸纯度不足（如残留蛋白质、盐离子）：抑制Taq酶活性，导致扩增效率降低；（3）核酸降解（如RNA样本被RNA酶污染）：影响长片段扩增或定量准确性；（4）交叉污染：提取过程中样本间混样，导致假阳性。评估提取质量的方法：（1）紫外分光光度法：检测OD260/OD280（DNA应在1.8-2.0，RNA应在1.9-2.1），OD260/OD230（应>2.0）；（2）荧光定量法（如Qubit）：准确测定核酸浓度；（3）内参基因扩增：检测样本中持家基因（如GAPDH）的Ct值，若Ct值异常（如>30），提示提取失败；（4）凝胶电泳：观察DNA/RNA条带完整性（如RNA的28S、18S条带比例应为2:1）。5.答：扩增产物污染的系统性排查步骤：（1）确认污染范围：检查近期所有实验的阴性对照，若连续多日阴性对照阳性，提示环境污染；若仅某一批次试剂的阴性对照阳性，可能为试剂污染。（2）环境排查：-表面污染：用湿润棉签擦拭台面、移液器、离心机等，浸泡于无核酸酶水中，进行PCR扩增检测；-空气污染：在各区域放置开放的阴性水试管（模拟操作），孵育后扩增检测；-设备污染：重点检查扩增仪（反应孔残留）、生物安全柜（滤网）。（3）试剂排查：更换新批次的引物、探针、酶等试剂，重新检测阴性对照；若更换后阴性对照正常，说明原试剂被污染。（4）操作排查：回顾实验记录，检查是否有违反分区操作（如将产物分析区物品带入试剂区）、未使用带滤芯吸头、扩增后开启反应管等行为。（5）处理措施：-环境消毒：用10%次氯酸钠擦拭污染区域，紫外线照射4小时以上；-设备维护：扩增仪反应孔用酒精棉片深度清洁，生物安全柜更换滤网；-试剂处理：污染试剂废弃，新试剂使用前做空白对照检测；-人员培训：强化分区操作规范，强调避免扩增产物暴露。四、案例分析题答：可能原因分析：（1）阴性对照Ct=36：提示存在扩增产物污染（如气溶胶扩散至样本处理区或试剂准备区；移液器未分区使用，将产物区污染带入反应体系）。（2）阳性对照Ct=25（预期22-24）：可能是阳性对照浓度不准确（如稀释错误）、扩增仪温度偏差（退火/延伸温度过高导致扩增效率降低）、试剂效期临近（Taq酶活性下降）。（3）10份样本Ct=38-40：可能是样本核酸浓度接近检测下限（真实低拷贝），或因污染导致假阳性（需结合重复检测判断）；也可能是提取过程中核酸损失（如磁珠吸附不充分）。改进措施：（1）立即停用当前批次试剂，更换新批次试剂并做