2025年层析技术试题及答案

2025年层析技术试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.以下哪种层析技术的分离机制基于溶质分子大小差异？A.离子交换层析B.凝胶过滤层析C.亲和层析D.反相高效液相色谱2.在高效液相色谱（HPLC）中，若需分离强极性化合物，通常优先选择的固定相是？A.C18烷基键合相B.氨基键合相C.氰基键合相D.硅胶基质未键合相3.衡量层析柱分离效率的关键参数是？A.保留时间（tR）B.分离度（Rs）C.理论塔板数（N）D.容量因子（k）4.亲和层析中，用于特异性结合目标蛋白的配基通常固定于？A.流动相B.固定相载体表面C.检测器D.进样系统5.气相色谱（GC）与液相色谱（LC）的主要区别在于？A.流动相状态B.固定相类型C.检测器原理D.分离机制6.在离子交换层析中，若目标蛋白的等电点（pI）为7.5，缓冲液pH为8.0，此时蛋白带？A.正电荷B.负电荷C.电中性D.电荷状态不确定7.超高效液相色谱（UHPLC）相比传统HPLC的核心改进是？A.提高检测灵敏度B.减小固定相颗粒粒径（<2μm）C.增加色谱柱长度D.优化流动相梯度程序8.凝胶渗透层析（GPC）主要用于分离？A.小分子有机物B.生物大分子（如聚合物）C.无机离子D.挥发性气体9.毛细管电泳（CE）与毛细管电色谱（CEC）的根本区别是？A.分离驱动力不同（电场vs压力）B.固定相使用方式C.检测技术D.样品预处理要求10.在薄层层析（TLC）中，比移值（Rf）的计算公式为？A.溶质迁移距离/溶剂前沿迁移距离B.溶剂前沿迁移距离/溶质迁移距离C.溶质迁移距离/固定相长度D.固定相长度/溶质迁移距离二、简答题（每题8分，共40分）1.简述分配层析与吸附层析的分离机制差异，并各举一例典型应用。2.高效液相色谱中，流动相的选择需考虑哪些关键因素？请列举3项并说明其影响。3.凝胶过滤层析（分子排阻层析）的分离范围由哪些参数决定？如何通过实验确定某样品的最佳分离条件？4.亲和层析的洗脱策略通常分为特异性洗脱和非特异性洗脱，二者的原理及优缺点分别是什么？5.气相色谱中，程序升温技术的作用是什么？与恒温分析相比，其适用场景有何不同？三、论述题（每题15分，共30分）1.以反相高效液相色谱（RP-HPLC）为例，论述其分离极性化合物的关键参数优化策略，包括固定相选择、流动相组成（有机相比例、pH）、流速及柱温的影响机制。2.二维层析（2D-LC）是当前层析技术的重要发展方向。请阐述其基本原理、常用的正交分离模式组合（如第一维与第二维的选择），并说明其相比一维层析的优势及应用场景（如复杂生物样品分析）。四、案例分析题（20分）某实验室需从大肠杆菌发酵液中纯化重组人胰岛素（分子量约5800Da，等电点5.3），目标纯度≥95%。现有设备包括：离子交换层析柱（DEAE-纤维素，阴离子交换）、疏水相互作用层析柱（Phenyl-Sepharose）、凝胶过滤层析柱（SephadexG-50，分离范围1000-50000Da）、HPLC系统（C18柱）。请设计一套纯化方案，要求：（1）列出主要步骤及对应的层析技术；（2）说明每一步的原理及条件（如缓冲液pH、盐浓度）；（3）分析可能遇到的问题（如杂蛋白干扰、目标蛋白变性）及解决措施。答案一、单项选择题1.B2.B3.C4.B5.A6.B7.B8.B9.A10.A二、简答题1.分配层析基于溶质在固定相和流动相之间的分配系数差异，固定相为液体（如键合在载体上的水或有机溶剂），例如液-液分配色谱分离氨基酸；吸附层析基于溶质在固定相表面的吸附能力差异，固定相为固体吸附剂（如硅胶、氧化铝），例如薄层色谱分离植物色素。2.关键因素包括：①极性：需与固定相极性匹配（如反相色谱用极性流动相）；②pH：影响溶质解离状态（如分离弱酸/碱时调节pH控制保留）；③离子强度：离子抑制色谱中通过盐浓度调节带电溶质的保留；④黏度：影响柱压（如高比例有机溶剂降低黏度，适合UHPLC）。3.分离范围由凝胶的排阻极限（完全排阻的最小分子量）和渗透极限（完全渗透的最大分子量）决定，与凝胶孔径分布相关。实验确定方法：用已知分子量的标准品（如不同分子量的右旋糖酐）进行层析，绘制洗脱体积-分子量标准曲线，确定目标样品分子量是否在分离范围内；调整上样量（不超过柱床体积的3-5%）和流速（0.1-0.5mL/min）以优化分离。4.特异性洗脱利用目标蛋白与配基的特异性结合位点，加入竞争性配体（如酶的底物类似物）或改变条件（如pH）使复合物解离，优点是选择性高、目标蛋白活性保留好，缺点是需针对配基设计洗脱剂；非特异性洗脱通过改变pH、离子强度或有机溶剂破坏非共价键（如氢键、疏水作用），优点是通用、操作简单，缺点是可能导致蛋白变性或杂蛋白共洗脱。5.程序升温技术通过逐步升高柱温，使不同沸点的组分在最佳温度下洗脱，作用是：①缩短分析时间（高沸点组分快速流出）；②改善分离度（低沸点组分在低温下分离，高沸点在高温下）。适用场景：复杂样品（如石油馏分、环境污染物）中组分沸点范围宽（>100℃）时，恒温分析易导致低沸点峰重叠或高沸点峰展宽。三、论述题1.RP-HPLC分离极性化合物的关键参数优化策略：固定相选择：极性化合物在反相柱上保留弱，需选择极性修饰的固定相（如极性嵌入C18柱，或短链C8柱），或增加碳载量提高保留；避免使用高碳载量长链C18（可能导致保留过弱）。流动相组成：①有机相比例：降低有机相（如甲醇/乙腈）比例（如30%→10%）可增加极性化合物的保留，但需平衡分析时间；②pH：若化合物为弱酸（如羧酸，pKa=3-5），调节流动相pH<pKa（如pH2-3）使其保持分子态，增加疏水性保留；若为弱碱（如胺类，pKa=7-9），调节pH>pKa（如pH8-9）使其解离度降低，减少与硅胶残留硅羟基的作用（拖尾）。流速：降低流速（如1.0mL/min→0.5mL/min）可增加传质时间，提高分离度，但延长分析时间；需在分离度与效率间平衡。柱温：升高柱温（如30℃→40℃）可降低流动相黏度，提高传质速率，同时可能改变溶质的解离状态（如弱酸碱的pKa随温度变化），需通过实验优化（如用不同柱温测试保留时间和峰形）。2.二维层析（2D-LC）基本原理：将第一维色谱（1D）的部分或全部流出物切入第二维色谱（2D）进行再分离，利用两种不同的分离机制（正交性）提高整体峰容量。常用正交模式组合包括：①第一维反相（RP）+第二维离子交换（IEC）：基于疏水和电荷差异分离复杂蛋白样品；②第一维尺寸排阻（SEC）+第二维亲水作用（HILIC）：分离多糖或寡糖（基于大小和极性）；③第一维正相（NP）+第二维反相（RP）：分离脂质（基于极性和疏水差异）。优势：一维色谱峰容量有限（通常100-200），二维峰容量为1D×2D（如200×200=40000），显著提高复杂样品（如血清、细胞裂解液）中痕量组分的检出能力；可解决一维分离中强保留组分与弱保留组分的重叠问题。应用场景：蛋白质组学（如胰酶消化后的肽段分离）、代谢组学（如血浆中数百种代谢物分析）、中药成分分析（如黄酮、生物碱、多糖的多类成分分离）。四、案例分析题纯化方案设计：（1）主要步骤及层析技术：①预处理：发酵液离心（10000g，4℃，20min）去除菌体，上清用0.22μm滤膜过滤除杂；②捕获阶段：阴离子交换层析（DEAE-纤维素）；③中度纯化：疏水相互作用层析（Phenyl-Sepharose）；④精细纯化：凝胶过滤层析（SephadexG-50）；⑤验证：HPLC（C18柱）分析纯度。（2）各步骤原理及条件：①阴离子交换层析：重组胰岛素pI=5.3，缓冲液pH=7.0（>pI），蛋白带负电，可与DEAE（带正电）结合；杂蛋白中pI>7.0的带正电，不吸附直接流出。缓冲液：20mMTris-HCl，pH7.0；洗脱：0-1MNaCl线性梯度（胰岛素带电量较低，在低盐浓度下洗脱）。②疏水相互作用层析：经离子交换后，样品含高盐（NaCl），加入硫酸铵至1.5M（增强疏水作用），胰岛素表面疏水区域与Phenyl-Sepharose结合；杂蛋白（如极性强的宿主蛋白）不吸附流出。缓冲液：20mM磷酸盐，pH7.0+1.5M(NH4)2SO4；洗脱：递减硫酸铵梯度（1.5M→0M），胰岛素在低盐下洗脱。③凝胶过滤层析：SephadexG-50分离范围1000-50000Da，胰岛素分子量5800Da，可进入凝胶孔，而大分子杂蛋白（如聚合体）被排阻先流出，小分子（如盐、肽段）后流出。缓冲液：20mMPBS，pH7.4；流速0.3mL/min，上样量≤2%柱体积。（3）可能问题及解决：①杂蛋白干扰：离子交换中若pI接近的杂蛋白共吸附，可降低上样量或优化pH（如pH6.5，减少胰岛素负电荷，与DEAE结合更弱，提前洗脱）；疏水层析中若胰岛素