《生物制药工艺》课件-项目七：制剂技术与疫苗制备

甲醛脱毒法生产白喉疫苗《生物制药工艺》湖北生物科技职业学院导入：什么是白喉？白喉，一种可怕的传染病，曾给十九世纪末期的人类史投上了巨大的阴霾。它是一种由白喉棒状杆菌引起的急性呼吸道传染病。白喉棒状杆菌从呼吸道侵入后，首先在鼻咽部粘膜表面生长繁殖，同时释放外毒素（主要的致病物质），从而引起粘膜的上皮细胞坏死，周围的组织细胞产生炎症。它的传染源是唯一的——白喉患者或带菌者，主要通过飞沫进行传播。湖北生物科技职业学院Text6导入：什么是白喉疫苗？白喉疫苗即白喉类毒素，是一种用于预防白喉病的自动免疫制剂，是由产毒力高的白喉棒状杆菌的培养滤液经甲醛脱毒后精制而成。1923年，法国细菌学家Romon等用稀甲醛处理白喉毒素获得类毒素，成为白喉预防史上划时代的预防制剂，并在各国推广使用。1948年研究人员开发出了针对白喉、破伤风和百日咳的三联疫苗，而这种联合疫苗的开发也是历史上最伟大的挽救人类生命的公共卫生事件之一。湖北生物科技职业学院生产工艺：甲醛脱毒法生产白喉疫苗准备菌种培养基菌种培养精制白喉毒素制备白喉类毒素湖北生物科技职业学院生产过程：第一步菌种及培养基准备1、菌种选择：产毒高、免疫力强，PW8菌株是国际上产毒最著名的菌种菌种保存：冻干法。2、培养基选择：胰酶牛肉消化液培养基。尽量减少对人体引起过敏反应的物质，不应含有可以引起人体毒性反应的物质。湖北生物科技职业学院生产过程：第二步菌种培养产毒培养条件：1、温度：34~35℃2、生长最适PH：7.0~7.6，产毒最适PH：7.6~7.8。3、碳源：麦芽糖，稳定PH。4、氮源和生长因子：1%谷氨酸或谷氨酰胺5、需氧：足够的空气6、培养时间：50h左右深层培养湖北生物科技职业学院生产过程：第三步白喉毒素的精制请注意：用于精制的毒素或类毒素可多批混合，但不得超过5批。白喉毒素滤液滤液0.5%NaHCO323%~27%硫酸铵、活性炭17%~20%硫酸铵沉淀溶液溶液精制白喉毒素0.01%硫柳汞除菌过滤溶解透析法硫酸铵、活性炭二段盐析法湖北生物科技职业学院生产过程：第四步白喉类毒素的制造将上述精制白喉毒素进行适当稀释后，培养物滤液加0.5%~0.6%甲醛，调PH至7.5~7.6，于37~39℃脱毒30天，为防止毒性逆转，加深脱毒20天。亦可加入适量赖氨酸后再加甲醛脱毒，可提高脱毒效率。精制白喉毒素白喉类毒素0.5%~0.6%甲醛甲醛脱毒湖北生物科技职业学院扩展知识：百白破疫苗百日咳、白喉、破伤风混合疫苗简称百白破疫苗，它是由百日咳疫苗、精制白喉和破伤风类毒素按适量比例配制而成，用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病。目前使用的有吸附百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒素混合疫苗（吸附百白破，DTP疫苗）和吸附无细胞百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒类混合疫苗（吸附无细胞百白破，DTaP疫苗）。湖北生物科技职业学院扩展知识：百白破疫苗无细胞百白破疫苗（DTaP疫苗）是二十世纪八十年代初由日本科学家研制，降低了人体不良反应，而且免疫率高达92%，人类向消灭白喉又前进了一步。湖北生物科技职业学院想一想：甲醛脱毒法生产白喉疫苗主要有哪几个步骤？准备菌种培养基菌种培养精制白喉毒素制备白喉类毒素课后思考题：为什么精制毒素可以加适量赖氨酸后再加甲醛脱毒？赖氨酸起到的作用还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产工艺《生物制药工艺》湖北生物科技职业学院细胞因子疫苗13多肽酶制剂导入：冻干粉针与生物药物抗体血浆湖北生物科技职业学院冻干粉针制备——还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产工艺一、冷冻干燥的原理二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产工艺主要内容湖北生物科技职业学院15导入：注射用冷冻干燥制品将药物制成无菌水溶液，分装后通过冷冻干燥法制得的粉末，称为注射用冷冻干燥制品，俗称冻干粉针。适用于：在水中稳定，但加热即失效、难以干燥的药物。湖北生物科技职业学院导入：注射用冷冻干燥制品（1）优点：①可避免药品因高热而分解变质；②所得产品质地疏松，加水后迅速溶解；③含水量低，一般在1～3%范围内；④不易氧化，有利于产品长期贮存；⑤产生污染的机会相对小；⑥剂量准确、外观优良。（2）缺点：溶剂的选择受限，需要特殊设备、成本较高。

湖北生物科技职业学院Text6还原型谷胱甘肽为白色冻干粉末由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成导入：还原型谷胱甘肽保护肝脏解毒美容湖北生物科技职业学院一、冷冻干燥的原理０点即冰水气三相平衡点610.5Ｐａ降低压力升高温度湖北生物科技职业学院二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺灌装再干燥升华干燥药液安瓿或小瓶预冻封口质检成品湖北生物科技职业学院1.药液配制过滤及灌装二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺无菌容器甘露醇12.00g叶酸0.20g还原型谷胱甘肽30.00g溶解无菌注射用水10％氢氧化钠调节ＰＨpH值至5.0～6.5无菌注射用水定容２００ｍｌ过滤

0.22μm微孔滤膜

无菌条件

液面深度１－２ｃｍ灌装半加塞湖北生物科技职业学院２.冷冻干燥二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺预冻升华干燥再干燥湖北生物科技职业学院二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺－（１）预冻常压环境低于共熔点１０－２０℃湖北生物科技职业学院１．速冻法方法：在产品进箱之前，先把冻干箱温度降到-45℃以下，再将制品装入箱内，急速冷冻。特点：冰晶细微，产品疏松易溶，引起蛋白变性的几率小，对酶制剂、活菌、活病毒的保存有利。２．慢冻法方法：每分钟下降１℃的速度进行冷冻。特点：结晶粗，冻干效率高。二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺－（１）预冻湖北生物科技职业学院二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺－（２）升华干燥常压环境湖北生物科技职业学院二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺－（２）升华干燥１．一次升华法方法：处理好的制品溶液先在干燥箱内预冻至低共熔点以下10～20℃，同时将冷凝器温度下降至-45℃以下，启动真空泵，通过搁置板下的加热系统缓缓加温，温度逐渐升高至约-20℃，基本除尽水分，再转入干燥阶段。适用范围；适用于共熔点-10℃～-20℃的制品，装量厚度在10～15mm的情况。湖北生物科技职业学院二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺－（２）升华干燥２．反复预冻升华法方法：先速冻到-45℃左右，然后将制品升温如此反复处理，使制品晶体结构改变，制品表层外壳由致密变为疏松，有利于水分升华。适用范围：共熔点较低，结构复杂粘稠液体，如蜂蜜、王浆等产品。湖北生物科技职业学院二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺－（３）再干燥常压环境缓慢恢复室温减压环境湖北生物科技职业学院二、还原型谷胱甘肽冻干粉针的生产制备工艺分装再干燥升华干燥药液安瓿或小瓶预冻封口质检成品半合成法生产叠氮胸苷《生物制药工艺》湖北生物科技职业学院导入：艾滋病与抗癌治疗艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的免疫细胞死亡而产生的综合症,是一种高死亡率的病毒感染性疾病。能有效治疗和防治艾滋病的药物屈指可数,且价格高企,其中使用最多最广的是齐多夫定又名叠氮胸苷。湖北生物科技职业学院导入：叠氮胸苷（商品名齐多夫定）商品名：齐多夫定、克度、立妥威齐多夫定为抗病毒药，用于艾滋病或与艾滋病有关的综合症患者及免疫缺陷病毒(HIV)感染的治疗。能有效治疗和防治艾滋病的药物屈指可数,且价格高企。叠氮胸苷（AZT）是世界上第一个用于治疗艾滋病的新药，是胸苷的类似物，商品名为Refrovir即齐多夫定，1987年于英国上市。是第一个由美国FDA认证的抗艾滋药物，也是目前公认的预防和治疗艾滋病感染的重要有效的化疗药物，可减轻或缓解艾滋病相关症状，减缓疾病进展，延长艾滋病患者生存期。湖北生物科技职业学院导入：叠氮胸苷（商品名齐多夫定）叠氮胸苷（AZT），商品名齐多夫定，化学名称是3’-叠氮-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷。分子式为C10H13N15O4，相对分子量为267.244。湖北生物科技职业学院理化性质：叠氮胸苷叠氮胸苷湖北生物科技职业学院理化性质：叠氮胸苷与胸苷的区别叠氮胸苷胸苷湖北生物科技职业学院作用机理：叠氮胸苷抗HIV原理

AZT主要在体内经磷酸化后生成3’-叠氮-2’-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与DNA的生成，使DNA不能继续复制，从而阻止病毒的繁殖。视频截取时间0:02:26-0:02:41湖北生物科技职业学院作用机理：叠氮胸苷抗HIV原理①在体外对HIV-Ⅰ有抑制作用，进入HIV感染的细胞内，先由宿主细胞内的胸苷激酶，胸苷酸激酶及核苷二磷酸激酶磷酸化，生成5’磷酸化AZT(AZTTP)。齐多夫定(AZT)AZTTP湖北生物科技职业学院作用机理：叠氮胸苷抗HIV原理②生成的AZTTP可竞争性抑制病毒逆转录酶对三磷酸胸苷(TTP)的利用，使DNA链中止增长而阻碍病毒繁殖。AZTTP对病毒的逆转录酶的亲合性比对正常细胞DNA聚合酶强约100倍，因此具高选择性的抗病毒作用。③吸收迅速，口服生物利用度约为60%~70%。④主要毒性为骨髓抑制，表现为贫血。5’磷酸化AZT(AZTTP)HIVDNA复制阻断HIV逆转录酶抑制

AZT呈白色至淡黄色粉末或针状结晶，无臭；易溶于乙醇，难溶于水，其水溶液pH为6.0，遇光分解，避光在30℃下可保存2年。湖北生物科技职业学院理化性质：叠氮胸苷抗HIV原理湖北生物科技职业学院提取原理：半合成法AZT合成是以β-胸苷为原料，经5'-羟基保护、酯化后用氢氧化钠溶液处理制得2,3'-脱水-5'-O-（三苯甲基）胸苷，再经叠氮化和脱保护反应得到AZT，总收率达70%。该法原料来源方便，工艺简化易行。湖北生物科技职业学院制备方法：AZT合成过程胸苷三苯基保护磺化水解再磺化叠氮化再水解制备步骤：六步反应法湖北生物科技职业学院23331胸苷三苯基保护磺化水解534再磺化叠氮化将胸苷的5’-OH和三苯基氯甲烷反应生成(E)5’-三苯基甲氧基-3’-OH-胸苷。将上一步产物与甲磺酰氯反应生成(E)5’-三苯基甲氧基-3’-甲磺酰基-胸苷。将第一次磺化物进行碱性水解得(Z)5’-三苯基甲氧基-3’-OH-胸苷。将上一步水解物与甲磺酰氯反应