循环肿瘤DNA的检测方法（中篇）

循环肿瘤DNA的检测方法（中篇）

ctDNA仅占cfDNA的0，％~5%,且不同癌种、不同病程的肿瘤患

者ctDNA在血浆中含量差异较大。因此,需要超敏感方法来检测

ctDNA携带的特征信息（包括突变.重排.拷贝数异常、甲基化

等）。中篇将介绍ctDNA的各种分析方法。

“■台

5.ctDNA的分析方法

循环cfDNA主要由源自正常细胞的种系DNA组成存在于癌症患

者中的ctDNA相对较少且高度可变。因此，传统DNA分析方法（如

Sanger测序,焦磷酸测序）的灵敏度不足以检测癌症患者血浆ctDNA中

的体细胞突变。

目前ctDNA的分析方法主要有三种:以ARMS为代表的定量PCR

技术；以ddPCR为代表的数字PCR技术;基于下一代测序（NGS）的高

通量检测技术。近年来也出现了核酸质谱技术和EFIRM技术。

5.1ARMS技术

ARMS全称amplificationrefractorymutationsystem（扩增受阻突

变体系）,又称等位基因特异性扩增法,是一种在PCR基础上发展起来

用于检测DNA中各种点突变的新方法。其基本原理是,如果引物的3'

端碱基与模板碱基不互补,则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此

根据已知点突变设计引物,使3,端碱基分别与突变和正常的模板碱基互

补,从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。ARMS技术结合

电泳或荧光定量PCR方法进行检测,前者利用凝胶电泳技术检测扩增

带,从而实现结果分析,后者指ARMS技术结合探针对扩增产物进行检

测,在荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测。目前

采用电泳分析仍是主流，结合定量PCR的还较少。

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G/Ghomv/ygixeA/AhomozygexeG/Abeierozygoie

四引物ARMS-PCR方法的示意图(该方法基于具有两组引物的

PCR反应,通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。一组内部引物对于对突变和

野生型等位基因是特异性的，并且它们彼此相对设计，另一组外部引物

用于在PCR反应中产生对照条带。两个外部引物和内部一外部引物可

以相互反应并产生不同长度的产物，它们可以在凝胶电泳中分离。)

资料来源：IranJPublicHealth44(3):380-7,2015,宽华投研团队

整理

ARMS技术具有成本低、简便快速、特异性好、技术普及度高等

特点，非常适合医院广泛开展。ARMS技术已成为目前欧盟及中国

CFDA批准用于临床的血液检测方法，同时获得专家共识的推荐。然而

ARMS技术检测灵敏度有限(检测限度为1%),单次只能检测单个基

因且只能用于检测已知突变,在一定程度上限制其应用。

艾德生物基于ARMS技术开发了升级版Super-ARMS,其保留了

ARMS技术简便快速,特异性好,技术普及度高等特点,非常适合医院广

泛开展，同时进一步提高检测灵敏度(0.0L0.2%),满足血液ctDNA

检测的要求,更适合作为血液ctDNA检测的临床普及技术。

5.2数字PCR技术

qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实

时监控反应过程。每扩增一条DNA链,就有荧光染料分子结合到双链

DNA上或有荧光分子从探针上释放,实现荧光信号的累积。由于荧光

积累与PCR产物形成完全同步,可通过软件对荧光积累信息进行分析

和计算,获得待测样品模板的初始浓度。但是,qPCR只能够通过标准

曲线和标准品进行相对定量,无法做到精准绝对定量。

D,Fkiocopbore.O_

PolymeraseQuencher.

qPCR示意图（使用基因特异性引物，通过掺入双链DNA特异性

染料或通过聚合酶5:3'外切核酸酶活性释放TaqManFRET（荧光共

振能量转移）探针检测靶标的初始浓度。）

资料来源：Na.Re.Genet.201.Ma.l7;17（6）:333-51,宽华投研团

队整理

20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR（digitalPCR,dPCR）的概

念,与qPCR不同的是,数字PCR可以不需要对照标准样品和标准曲线

来实现绝对定量分析。数字PCR一般包括两部分内容，即PCR扩增和

荧光信号分析。数字PCR通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不

同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子（DNA模板）,

在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反

应单元的荧光信号进行统计学分析。

根据反应单元类型不同，数字PCR分为三类：微反应室/孔板、微

流控芯片和微滴数字PCR系统。目前通过数字PCR方法进行ctDNA

分析的主要技术有和

ddPCRBEAMingo

5.2.1ddPCR

全称（微滴数字）该技术属于

ddPCRdropletdigitalPCRPCROBio­

Rad公司,可实现绝对定量和稀有等位基因的检测,其工作原理为:首先

将血浆中分离出的DNA分割成一个个的小微滴,置于不同的微孔中，

便于形成多个独立、平行的反应；随后对微孔中的DNA同时进行

PCR扩增。在扩增时通过特定的化学试剂和染料探针标记其中的阳性

分子,即ctDNA,检测到ctDNA会有信号累积；最后对每个孔的信号

累积情况进行计算和定量分析,即可计算出原始样品中ctDNA的含

量。该技术灵敏度高达0.001%,能够检测到血液中痕量的ctDNA,可

有效适用于肿瘤的早期筛查，但是不能检测未知突变,且不能高通量。

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ddPCR检测ctDNA示意图

资料来源:银河证券,宽华投研团队整理

522BEAMing

该方法基于小珠(Bead)、孚I浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、

磁性(Magnetic)这四个主要组分来构建,所以被称作为BEAMing。

BEAMing结合了数字PCR以及流式技术,通过磁珠克隆DNA。利用

特异性PCR引物扩增目标突变区后,与磁珠(磁珠上固定有特异的

PCR引物)混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后,利用不同

颜色的荧光探针结合磁珠上的PCR产物,发出红色或绿色荧光。使用

流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。BEAMing技术具有较高的

灵敏度(0.01%)，但是这项技术只能检测已知突变,且成本较高。同

时,它的操作也较复杂,通量低。

BEAMing=beads,amplification,emulsion,magneticd

BEAMing技术（步骤1:链霉亲和素包被的磁珠与生物素标记的

寡核昔酸结合。步骤2:含水混合物（包含PCR所需的所有成分.结

合引物的磁珠和模板DNA）与油/洗涤剂混合物一起搅拌以产生微乳

液；含水隔室（灰色油层中的白色圆圈）含有平均少于一个模板分子

和少于一个珠子；红色和绿色模板代表两个模板分子，其序列相差一个

或多个核甘酸。步骤3:如常规PCR中那样对微乳液进行温度循环；如

果DNA模板和磁珠一起存在于单个水性隔室中，则磁珠结合的寡核苛

酸作为扩增的引物；连接到磁珠的红色和绿色直线代表来自两种不同

模板的延伸产品。步骤4:破坏乳液,用磁铁纯化磁珠。步骤5:变性后，

将磁珠与能区分不同种类模板序列的寡核昔酸（杂交探针）一起温育；

然后使用荧光标记的抗体标记结合的杂交探针，这使得在适当的激光激

发后含有PCR产物的磁珠为红色或绿色。步骤6:流式细胞术用于计数

红色和绿色磁珠。）

资料来源：PNASJuly22,2003100（15）,宽华投研团队整理

5.3NGS技术

数字PCR技术,具有极高的敏感性,可绝对定量；但该方法操作复

杂，一次仅能检测少数突变位点，且不能检测融合变异。为了提高检测

通量和效率,以NGS为核心的测序技术被广泛应用于ctDNA的下游分

析,范围从全基因组或全外显子组测序到有限基因组的靶向测序。NGS

可实现对多基因核酸片段进行高通量平行深度测序，能够同步检测多个

基因、不同形式（如突变、拷贝数改变和基因融合）及未知突变，在预

后和疗效判断的时候，多基因的参与可能对预后效果产生非常大的影响。

5.3.1NGS技术的原理

NGS是最近十多年诞生的DNA测序技术,它能同时对几十万到几百万

个DNA分子进行平行测定,与传统的一代测序技术相比,具有高通

量、高敏感性等优势,因此也称为高通量测序技术，是对传统Sanger

测序革命性的改变。

NGS的测序步骤主要有（1）文库构建，构建文库时需要将DNA随机

片段化并在两头加上特定的接头（adaptor）;（2）文库分子大规模

平行克隆扩增，使用桥式扩增或者乳液PCR方法,对文库中的DNA片

段进行克隆扩增,以产生足够拷贝数量的测序模板；（3）测序，目前

NGS测序平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenome

Analyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem,其中Illumina公司

的测序平台占主导地位。Roche/454FLX平台采用焦磷酸测序原理，

在第二代中读长最高,但仪器昂贵,难于处理重复和同种碱基多聚物区

域；SOLID平台应用连接法测序,测序通量和准确性高,试剂成本低，

但仪器昂贵,测序运行时间长,读长短,数据分析困难。Solexa技术采

用可逆链终止物和合成测序法,测序通量高,需要样品量少其简单、快

速、自动化,其但仪器高贵,用于数据删节和分析的费用很高。

❶LibrarypreparationDNA

Clonalamplificationfragmentation

e・andinvitro

Cyclicarraysequencing"I

oadaptorigation

emulsionPCRbridgePCR

菜米h;恤就』山I

资料来源:公开资料,宽华投研团队整理

5.3.2非靶向测序

非靶向测序根据检测范围分为全外显子测序(WES)和全基因组测

序(WGS)。目前已有技术平台应用全基因组测序方法来分析ctDNA,

该方法能够在不事先知道肿瘤中可能存在的畸变的情况下鉴定肿瘤特

异性的改变。因此，可以利用这些方法从头发现治疗抗性的基因变化,

并鉴定癌症患者中新的可操作靶标。但是全基因组测序检测灵敏度较

低(5-10%),而且成本高、检测周期长、数据分析难度较大，难以在

临床上应用。

5.3.3靶向深度测序

为了在保证检测准确性和测序深度的基础上降低价格，目前越来越

多的新技术先对ctDNA目的片段进行富集再将富集后的目的序列进

行深度测序，这种方法称为靶向深度测序。与全基因组测序以及全外显

子测序相比，靶向测序能够获得更深的覆盖度和更高的数据准确性,提

高了对目的区域的检测效率。同时缩短了检测周期，降低了测序成本,

适合对大量样本进行分析。

靶向测序技术可通过PCR或杂交捕获对目的片段进行富集。基于PCR

的靶向测序技术是针对目的基因设计几十对甚至上百对PCR弓|物,利

用PCR扩增富集。基于杂交捕获的靶向测序技术是针对目的基因设计

探针,通过杂交捕获的方法富集。

由于NGS的实验流程技术较为复杂,在文库构建、目的片段富集及测

序过程中不可避免的会引入一些扩增和测序的错误,这些错误称为背景

噪音,而ctDNA检测往往突变频率较低,受到背景噪音干扰较大,来自

ctDNA样本中的低频突变往往淹没在背景噪音之中,造成假阴性或假

阳性结果，这就限制了ctDNA检测的灵敏度和特异性。因此目前基于

NGS的靶向测序技术都致力于降低背景噪音，提高ctDNA检测的灵敏

度和特异性,大多数技术通过分子条形码(barcode)的策略。分子条形

码又称分子标签(UniqueMolecularindentifier,UMI),它的原理就是

给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列,经文库构建及PCR

扩增后一起进行测序。这样,根据不同的标签序列就可以区分不同来源

的DNA模板,分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假

阳性突变,哪些是患者真正携带的突变,从而改善检测的局限性,提高测

序的准确性。最初使用的条形码策略是追踪单链DNA的单链标签,目

前大多使用的策略是追踪双链DNA的双链标签。尽管双链标签比单

链标签能实现更好的错误抑制,但是效率相对较低,因此对于临床上数

量有限的cfDNA不是最佳的。

Next-generationsequencingwithmolecularbarcodes

WildtypeMutantWildtype

MolecularEachDNAmolecule

barcodetagstaggedwithbarcode

Redundantsequencing;true

mutationsrepresentedinall

readswithgivenbarcode

使用分子条形码策略的NGS方法

资料来源:NEnglJMed2018;379:1754-65,宽华投研团队整理

除了使用分子条形码,一些错误抑制算法和富集特定长度的ctDNA

片段(ctDNA片段通常比健康细胞释放的cfDNA片段小)也被用来

降低背景噪音,改善ctDNA检测的敏感度。

目前通过靶向深度测序方法进行ctDNA检测的主要技术有标记扩增深

度测序(TAM-Seq),安全测序系统(Safe-seqS),癌症个休化深度测序

(CAPP-Seq),集成数字错误抑制方法(iDES),靶向错误矫正测序(TEC-

Seq)等。

TAM-Seq基本原理是设计特异性引物对目标区域进行循环预扩增,产

生大小200bp以下末端重叠覆盖整个区域的扩增子(预扩增)，接着

通过单重PCR选择性扩增带突变的扩增子区(标签扩增)，从而排除

非特异性产物,最后在回收的产物上加接头和特异性条形码(barcode),

进一步通过单端测序得到最终结果。该方法主要特点是测序通量图、

测序时间和成本显著降低，但检测敏感度有待提高（＞2%）。

DNA（diluteordegraded）

I

Preamplification

Single-plexPCR

BarcodingPCR

三

三

二

=三

­三

=一

TAM-Seq流程（红星代表携带突变的DNA分子）

资料来源:SciTranslMed4,136ra68（2012）,宽华投研团队整理

Safe-seqS该方法包括两个基本步骤：第一步为每个待分析的DNA

模板分子分配独特的标示物（UID,或称条形码）；第二步对每个UID

标记的模板进行扩增,从而产生具有相同序列的许多子分子（定义为

UID家族）。如果用于扩增的模板分子中预先存在突变，则该突变应该

存在于含有该UID的每个子代分子中(除非任何后续的复制或测序错

误)。至少95%的家庭成员具有相同突变的UID家族被称为〃超级突

变体〃。原始模板中没有发生的突变，例如复制或测序错误,不会产生

超级突变体。Safe-seqS改善了大规模平行测序的准确性,能用于鉴定

DNA模板中的稀有突变,发现PCR或测序过程中产生的错误。UID标

记的模板的扩增效率对该方法的成功至关重要，但临床样品含有降低该

步骤效率的抑制剂,需要优化以解决这一问题。

WTMutant

■

UIDAssignmentI

Amplification

*

Redundant

Sequencing

Safe-SeqS流程

资料来源:PNAS.201Ju.7.108(23).9530-9535z宽华投研团队整理

CAPP-Seq该方法的关键是联合数据库检索和多阶段生物信息学方法,

来设计一个由生物素化的寡核昔酸绢成的"筛选器〃，靶向肿瘤的突变

区域直接应用于待测的循环DNA,来识别肿瘤相关的基因突变,从而

直接进行ctDNA的定量测定。这个筛选器是从肿瘤基因突变数据库

（COSMIC）等来源中,纳入可能的驱动基因中反复出现突变的外显

子,再对肿瘤基因图谱库（TCGA）的407名非小细胞肺癌（NSCLC）

患者的全外显子测序数据,运用迭代算法找到最大量的错义突变,而使

筛选器长度最小化。筛选器长度约为包含了个反复出现

125kbz139

的突变基因中的521个外显子及12个内含子,平均能够识别4个单核

甘酸突变。CAPP-Seq有效的把测序区段浓缩到整个基因组大小的

0.004%,使得后续超高深度测序得以实现,其对ctDNA检测结果灵敏

度高,特异性强且经济可行。

Generateselectorprobtsetforcancer

spec市cmutations

★

Quantifypatientspecific

•来mutationsfromctDNA

X•

CAPP-Seq流程

资料来源:维基百科,宽华投研团队整理

iDESCAPP-seq技术的检测极限是0.02%,不过许多测序片段都有错

误。为了解决这些错误,研究人员对CAPP-seq进行了优化,开发了

iDES。该方法使用分子条形码和〃背景抛光〃两种技术策略能获得有

效的cfDNA,大大降低了本底噪音。这两种方案能分别使CAPP-seq

敏感性提升3倍,而结合后提升15倍。

iDES使用的分子条形码策略综合了单链条形码和双链条形码的各自优

势。原始DNA双链分子的每条链使用四个条形码标记。单链条形码

为〃索引读取〃的一部分进行测序因此称为〃索弓1〃条形码。双链条

形码作为插入DNA片段主要读数的一部分进行测序,因此称为〃插

入〃条形码。在测序之后,互补的插入条形码可匹配,从而重新构建出

原始的双链DNA分子。

PCR

Maptoreferencegenome

Singlestrandrecovery

M(+)strandsampleDNA

■(-)strandsampleDNA

■Sequencingadapter

Realbiologicalmutation

/n八八

iDES分子条形码的设计策略

资料来源:Nat.Biotechnol.34.547-55.(2016),宽华投研团队整理

杂交捕获过程中的氧化损伤会产生大量反复发生的背景错误，最常

见的是G-T的颠换,也有少量C-T和G-A的错误。仅使用分子条形

码策略，这些背景错误的发生率仍较高。为了减少基于杂交捕获的测序

技术产生的背景错误，研究人员设计一种称为〃背景抛光〃的计算方法。

iDES将这种计算方法与分子条形码策略结合起来，使错误率减少了15

倍。

iDES能够检测到频率低至0.004%的突变,敏感性和特异性较其他方法

得到了改善。在热点等位基因上实现了与数字PCR或基于PCR的测

序方法类似的灵敏度，但可以同时询问数百到数千个额外的基因组位

置,而不会影响灵敏度或特异性。

TEC-seq该方法基于对基因组的多个区域的靶向捕获和DNA片段的

深度测序（~30,000刈。除了深度测序以外,该方法还对测序流程做出

了一系列改进来提高检测的灵敏度。其中包括：优化测序库的生成和

靶向片段的捕获通过加入少量外源条形码最大化独特ctDNA在测序

库中的呈现可能,以及在后期分析时过滤掉测序错误和其它原因导致的

基因变异。TEC-seq检测有望用于无症状的患者进行癌症早期筛查，但

鉴于可能潜在检测到的不同肿瘤,需要成像和其他诊断手段来完成任何

阳性ctDNA分析,以适当鉴别起源肿瘤。

Cell-freeDNA

Oligonucleotidebarcodes

Cell-freeDNAlibrary

Redundantsequencing

Sequencereconciliation

Alignmenttoreferencegenome

TEC-seq流程（从血液中提取cfDNA,并通过连接含有少量双索

引条形码适配子的池转化为基因组文库。捕获所得到的cfDNA文库并

进行冗余测序以产生每个DNA片段的多重拷贝。重复片段之间的序列

调节鉴定出具有相同起始和终止位置以及外源条形码的相同DNA分子

中存在的改变。使用包含相同冗余变化的多个不同分子的参照基因组

进行比对以鉴别真正的改变)

资料来源：SciTranslMed4,136ra68(2012),宽华投研团队整理

5.4核酸质谱技术

20世纪80年代出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-

TOFMS)打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统，使得核酸、

蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究。由此其奠基人田中耕一

和约翰贝内特芬恩于2002年获得诺贝尔化学奖,FDA于2014年批准

MALDI-TOFMS可用于临床核酸检测。MALDITOF质谱通过将待测

样本转换成高速运动的离子,根据不同离子拥有不同的质荷比(m/z),来

对待测样本进行分离和检测，可用于ctDNA的SNP、突变、甲基化及

拷贝数差异等多项检测与分析。

Agena是采用飞行质谱技术进行核酸检测最知名的公司目前已经与

多家公司合作,对公司的MassARRAY®系统、DNA检测应用和产品

进行大力推广。MassARRAY®系统将飞行质谱的特性和多重基因检测

完美的组合在一起,一次检测多达40-50个基因位点,单位成本低廉，

这是其在临床应用的核心竞争力。

PCR扩增：

上游引物，10merlag

[C/G]

5'____________3'

3'-

GenomicDNAIG/C]

下游引物，lOmer