氨气中毒造成育肥猪肾脏损伤和炎症反应的研究

摘要：氨气是养殖过程中常见的有害气体，主要由畜禽粪便、饲料残渣等有机物分解产生。在实际养殖生产中，受饲养密度过高、通风系统设计缺陷等因素影响，氨气浓度超标现象普遍存在。高浓度氨气会影响猪的健康，对机体器官造成损伤，对比其他器官现针对肾脏损伤的系统性研究仍显不足。为了探究氨气造成猪肾脏损伤的分子机制，本试验以18周龄母猪为动物研究模型，将24头母猪分为氨气组和对照组。在第30天杀死母猪，并收集肾脏组织。采用H&E染色、免疫组化等方法对氨气影响下的猪肾脏组织损伤和炎症发生情况进行检查，结果发现氨气暴露将诱导育肥猪肾脏炎性细胞因子IL-2、IL-8、IL-12和IFN-γ的升高，发生炎症反应和组织损伤。关键词：氨气；肾脏；炎症Abstract:Ammoniaisacommonharmfulgasinthebreedingprocess,whichismainlyproducedbythedecompositionoforganicmattersuchaslivestockandpoultrymanureandfeedresidues.Intheactualaquacultureproduction,thephenomenonofexcessiveammoniaconcentrationiscommonduetofactorssuchashighfeedingdensityanddefectsinthedesignofventilationsystem.Highconcentrationsofammoniacandamagethehealthofpigsandcausedamagetobodyorgans,andsystematicresearchonkidneydamagecomparedwithotherorgansisstillinsufficient.Inordertoexplorethemolecularmechanismofammoniacausingkidneydamageinpigs,24sowsweredividedintoammoniagroupandcontrolgroupusing18-week-oldsowsasananimalresearchmodel.Sowsarekilledonday30andkidneytissueiscollected.H&Estaining,immunohistochemistryandothermethodswereusedtoexaminethedamageandinflammationofpigkidneytissueundertheinfluenceofammonia,andtheresultsshowedthatammoniaexposurewouldinducetheincreaseofinflammatorycytokinesIL-2,IL-8,IL-12andIFN-γinthekidneyoffatteningpigs,andtheinflammatoryresponseandtissuedamageoccurred.Keywords:ammonia;kidney;inflammation

导论氨气是一种显著刺激性的无色气体，在集约化畜禽养殖的环境中被认为是一种典型的有害气体。不仅影响空气环境质量，还会对动物健康构成威胁。猪舍中氨气的生成机制主要可以分为两种途径：第一种途径由猪体内产生。饲料中的蛋白质一部分被肠道蛋白酶水解成氨基酸，吸收到上皮细胞内经联合脱氨基作用下生成氨REF_Ref195787338\r\h[1]，另一部分未被消化吸收的经肠粘膜微生物介导的脱氨脱羧作用产生并排出体外。此外，某些肠道微生物还具有合成尿素酶的能力，能直接催化体内的尿素水解生成氨和二氧化碳排出体外REF_Ref195787435\r\h[2]。第二种途径来自圈舍中含氮化合物的降解，是舍内氨气最主要的来源。猪的排泄物中60-80%的氮以尿氮形式、20-40%以粪氮形式存在。脲酶广泛存在于猪舍地板、粪坑、墙壁表面以及大肠杆菌等各种兼性厌氧菌中，催化效率极高。当尿液与其接触时，脲酶促进尿素快速水解产生氨气，可使尿素水解速度提高1014倍，氨气在几小时会内大量释放REF_Ref195787529\r\h[3]。粪便中的有机氮可经蛋白酶解后发酵产生氨气，但分解速率缓慢且产氨量低，并非主要来源。在现代化生猪养殖过程中，舍内空气质量对生猪健康及养殖经济效益具有显著影响。依据我国畜禽场环境质量标准要求，猪舍内氨气不得超过25mg/m3REF_Ref195787563\r\h[4]。然而在实际生产中，许多猪舍尤其在冬季封闭式猪舍因环境调控措施不足氨气浓度往往超标。监测数据显示封闭式育肥舍内氨气浓度可达30.36-32.63mg/m³。随着养殖规模逐步扩大、饲养密度持续提升，粪尿堆积量呈现急剧上升，据统计，每头育肥猪平均氨排放水平在107.18-424.42mg/h范围内，估算出万头猪场在日常运营过程中每日的氮排放量可达105kgREF_Ref195787581\r\h[5]，且部分养殖场通风系统存在缺陷舍内空气流通不畅，常常导致猪舍内氨气浓度超标，对生猪的健康状况及其福利保障产生了负面的影响。氨气作为养殖过程中的危害性气体之一，常常会对养殖业生产造成不利的影响，导致畜禽出现打喷嚏、流涎、食欲不振和昏昏欲睡等临床症状。当环境中不良因子达到动物体最低感知阈值时，系统性代谢适应机制就会被激活，通过消耗体内的能量和氨基酸储备以减轻不良环境带来的损害；如果长时间处于恶劣环境或刺激超出了自我调节能力范围，将导致代谢异常、器官损伤等情况REF_Ref195787612\r\h[6]，在一定程度上抑制畜禽的生长性能，并对畜产品质量造成负面影响REF_Ref195787664\r\h[7]。氨气中毒时，猪会出现咳嗽、气喘、呼吸困难等症状，还可能伴有气管炎、肺炎等炎症，甚至因呼吸衰竭而死亡，心脏功能受到影响，严重时可引发心力衰竭REF_Ref195787695\r\h[8]。氨气极易溶于水，大量吸入后其分子将迅速与黏膜上的水反应生成氨水。氨水具有一定的腐蚀性，能刺激机体出现呼吸道黏膜充血、间质水肿及炎性细胞浸润等病理反应，影响肺正常的生理功能，有报道显示，猪舍环境中氨气含量的上升与生长育肥猪的死亡率及肺炎支原体感染率存在显著正相关性REF_Ref195787724\r\h[9]。氨气吸入机体后，血氨浓度过高还会增加猪肝脏的解毒负荷，肝脏需要消耗更多的能量来对氨气进行一系列的解毒转化，长期处于高浓度氨气的高负荷状态下将导致肝细胞受损。此外，长期暴露于高浓度氨气环境中还会导致胸腺及卵巢等其他组织的损伤REF_Ref195787752\r\h[10]。氨气具有高度的水溶性。当大量吸入时，它会迅速对呼吸道粘膜产生湿润作用，产生碱性氨。这种溶液具有强烈的杀虫性，并直接化学刺激粘膜，诱发粘膜阻塞、间质性水肿和炎性细胞浸润等病理反应。肾脏作为主要排泄器官，在排出废物，调节水分平衡、维持电解质及酸碱稳定、保障机体内环境稳态方面等发挥了重要的作用。因其高血流、浓缩蓄积、代谢活跃的生理特点，是机体易遭受应激源损害的重要器官之一。有研究发现，PM2.5暴露可诱发鼠肾小管上皮细胞出现局部水肿及间质炎性细胞浸润，严重时可以观察到肾小管排列不规则、上皮细胞脱落、管腔中偶见蛋白管型REF_Ref195787778\r\h[11]。WitkowskaREF_Ref195787804\r\h[12]等报道，氨气浓度过高可导致鸡出现肾损伤，肾小管充血、上皮细胞变性及坏死、白细胞浸润及肾小球发炎。炎症是机体对有害刺激产生的一种抗病反应。当受到外部刺激时，免疫细胞通过膜表面的受体识别病原体，免疫系统会迅速启动炎症反应来保护机体的正常运行。细胞因子是由炎性细胞在应答外界刺激时合成并释放的具有多效生物调节功能的蛋白分子，在免疫调控中发挥核心作用。白细胞介素-2（IL-2）由T细胞或者T细胞系产出，在促进T细胞增殖分化及维持正常功能上发挥重要作用。干扰素-γ（INF-γ）由NK细胞和T淋巴细胞生成，能增强机体的杀菌能力并促进免疫应答；白细胞介素-8（IL-8）由巨噬细胞和上皮细胞合成，具有很强的趋化作用，通过诱导杀菌效应及调控细胞损伤机制实现免疫防御功能。白细胞介素-12（IL-12）能刺激T细胞和自然杀伤细胞，促进IFN-γ分泌，增强免疫反应。各种应激源刺激会干扰IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子的正常分泌REF_Ref195787970\r\h[13]，影响免疫功能引发炎症REF_Ref195788112\r\h[14-REF_Ref195788118\r\h15]。有研究发现，H₂S暴露导致鸡气管组织中IL-8的mRNA和蛋白水平明显升高，表明其在该炎症模型中起核心作用REF_Ref195788267\r\h[16]。大弹涂鱼受氨氮胁迫下，肝脏中IL-1、IL-6和IL-8基因转录水平持续升高，推测过度炎性反应可能是引发鱼类氨中毒死亡的重要机制之一REF_Ref195788293\r\h[17]。还有研究发现，当环境氨气浓度升高时，血清学检测显示IL-1β、IL-6、IL-10和INF-γ等促炎因子含量数值上呈上升趋势，而IL-2含量数值上呈下降趋势REF_Ref195788302\r\h[18]。此外，还有发现氨氮暴露会诱导河豚肝脏中TNF-α、IL-6和IL-12的mRNA表达水平升高，引起炎症反应REF_Ref195788398\r\h[19]。当环境中氨气浓度超过20mL/L时，会刺激猪黏膜诱发各种炎症反应REF_Ref195788431\r\h[20]。在正常机体内，细胞因子都保持在相对稳定的平衡状态，但遭受刺激后，外来应激会影响相关免疫细胞的功能，导致这种平衡状态被破坏。在炎症的不同阶段，细胞因子水平呈现出一定水平的变化REF_Ref195788456\r\h[21]。通过监测这些变化，可以探究炎症损伤在这些疾病中的损伤机制。本研究通过建立育肥猪的氨气中毒模型，观察肾脏组织形态学变化，测定细胞因子IL-2、IL-8、IL-12和IFN-γ的表达水平，旨在阐明畜禽舍有害气体致育肥猪肾脏损伤的分子机制。本研究拟为探究氨气的毒性作用提供新的思路，为防治育肥猪氨气中毒提供理论依据，有助于改善集约化生产中育肥猪的健康状况。

材料与方法2.1动物实验将24只18周龄、体重60kg三元杂交（大白×杜洛克×民猪）的后备母猪按照完全随机的原则分为对照组、氨气组，每组4个重复，每个重复3头育肥猪。动物饲养在环境控制室中。在对照组中不提供外源氨气，在氨气组中使用压缩无水钢瓶，每天提供8小时的外源氨气。氨气浓度如下REF_Ref195869461\h表2.1所示。试验期为30天。圈舍每天清理两次。自然光照，环境参数控制温度为18°C，相对湿度维持65%。实验结束时，将猪屠宰，在冰上迅速收集肾脏组织样本，部分使用4%多聚甲醛固定，部分使用液氮中速冻后-80℃冷冻保存，进行进一步分析。表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s11动物试验分组及处理Table2.1Animaltestinggroupingandtreatment分组氨气浓度(mg/m3)对照组＜5氨气组89.6±0.62.2显微结构观察2.2.1组织石蜡包埋切片（1）固定：用4%的多聚甲醛固定液浸泡肾脏组织24h。（2）脱水：转至浓度增加的乙醇（50%-60%-70%-90%-95%-100％）中脱水，50%到90%各梯度60min，95%、100%乙醇分两步各30min，后一步95％的乙醇溶液过夜完成脱脂处理。（3）透明浸蜡：将切片在二甲苯中处理30min，转移至60℃液态石蜡中进行浸蜡2小时。每间隔1小时更换新鲜石蜡，确保石蜡完全置换出二甲苯。（4）包埋切片：向包埋模具注入已完全熔融的蜡液，静置2-3min以排除气泡。用镊子将浸蜡充分的组织块放入蜡液中，等待凝固成块。待蜡块温度降至室温后，轻敲模具边缘使蜡块脱落。用刀片修整成长方形蜡块后，使用切片机获取5μm切片。（5）展片：将切片转移至40℃恒温水浴槽预展切片后，用载玻片缓慢捞起切片，使切片紧贴载玻片中心区域。放入60℃烤箱内促使切片中石蜡熔化并均匀渗透至组织与载玻片之间并去除水分，然后放入37℃恒温箱中以备染色。2.2.2H&E染色（1）烤片完成的切片首先经过二甲苯脱蜡，然后转入梯度乙醇溶液系统进行复水处理（100%→95%→90%→80%→70%），每个浓度梯度维持5min浸润时间，使组织恢复到含水状态。（2）具体染色步骤：试剂时间二甲苯Ⅰ5min二甲苯Ⅱ5min无水乙醇Ⅰ5min无水乙醇Ⅱ5min95%乙醇5min70%乙醇5minddH2O5min苏木素染液6minddH2O10s*10次1%盐酸乙醇（分化液）1sddH2O10s*10次0.1%氨水（返蓝液）2minddH2O10s*10次伊红染液30s70%乙醇5min无水乙醇Ⅰ5min无水乙醇Ⅱ5min二甲苯Ⅰ5min二甲苯Ⅱ5min中性树脂封片2.3细胞因子的检测2.3.1免疫组化采用切片机制备为5μm厚的切片。二甲苯浸泡（2×15min）后依次经100%-95%-90%-80%-70%乙醇溶液处理（各梯度5min），溶液体积保持切片完全浸没。将切片置于修复盒中，注入柠檬酸盐缓冲溶液，然后微波辐射进行热诱导抗原修复。将完成修复的切片转移至3%H₂O₂中，室温避光环境下孵育25min进行内源性过氧化物酶阻断反应。然后将切片与小鼠抗猪IL-12抗体4℃下过夜进行一抗孵育（18h），然后与HRP标记的二抗室温孵育50min。用显微镜观察染色的切片，细胞核呈蓝色，阳性信号呈棕黄色。使用ImageJ1.8.0软件中的IHCProfiler插件评估IL-12的表达。2.3.2RT-qPCRTrizol法分离提取RNA：（1）取100mg组织研成粉末放进1.5mL离心管，加入1mlTrizol试剂振荡15s，随后冰上静置5min。（2）加入200μL氯仿混匀后静置5min。4℃13000rpm离心15min，取上层水相至新离心管。（3）加入500μL异丙醇，混匀后静置10min。4℃13000rpm离心10min。（4）弃上清液，加入1mL75％乙醇反复吹打。4℃12000rpm离心5min后再次弃去上清，保留管底沉淀。（5）打开离心管盖，室温干燥5min。加入50μLRNase-free水。逆转录试剂盒逆转录RNA：（1）将RNA模板及试剂在冰上解冻，使用前对所有试剂瞬时离心，确保管壁液体收集至管底。（2）RNasefree管中冰上配制反应体系如REF_Ref194506413\h表2.2所示：表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s12逆转录RNA反应体系Table2.2ReversetranscriptionRNAreactionsystem组分体积TotalRNA/mRNA2μg5×RTMasterMix4μL20×OligodT&RandomPrimer1μLRNasefreeH2O补足至20μL（3）移液器轻轻吹打混匀，放入PCR仪，运行程序如REF_Ref194506491\h表2.3所示：表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s13逆转录RNA运行程序Table2.3ReversetranscriptionRNArunprogram温度时间37℃30min85℃5min85℃5min（4）得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应。用FastStartUniversalSYBRGreenMasterROX和基因特异性引物中的基因特异性引物进行qRT-PCR。（5）引物序列如REF_Ref194506559\h表2.4所示，将引物简短离心。表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s14引物序列Table2.4Primersequences基因名称NCBIID引物序列IL-2NM_213861.1正向5’-ACAAAGAAACAACTGGAGCCATTGC-3’反向5’-GAGCATCCTGGAGAGATCAGCATTC-3’IL-8NM_213867.1正向5’-CTCCGTGGCTCCCAAGAATTTCTC-3’反向5’-CCAGCACAGGAATGAGGCATAGATG-3’IL-12NM_214013.1正向5’-TCAGCCAAGGTTACATGCCACAAG-3’反向5’-CAGGACACAGATGCCCATTCACTC-3’IFN-γNM_213948.1正向5’-AGCTCTGGGAAACTGAATGACTTCG-3’反向5’-ACTGATGGCTTTGCGCTGGATC-3’（6）在RNasefree管中冰上配制反应体系，如REF_Ref194506628\h表2.5所示：表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s15qRT-PCR反应体系Table2.5qRT-PCRreactionsystem组分体积FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)10μL上游引物(100μM)0.06μL下游引物(100μM)0.06μLcDNA2μLRNasefreeH2O补足至20μL（7）以cDNA模板：混合反应体系为1：9的比例加入到96孔板中。（8）使用实时荧光定量PCR进行实验，运行程序如REF_Ref194506781\h表2.6所示：表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s16qRT-PCR运行程序Table2.6qRT-PCRoperatingprocedure温度时间循环次数95℃10min195℃15s4060℃15s95℃15s160℃1min95℃15s2.3.3Westernblot用Western及IP专用裂解液和蛋白酶抑制剂提取蛋白，BCA蛋白检测试剂盒测定浓度。配制SDS蛋白凝胶下层胶（12%分离胶）和上层胶（5%浓缩胶），灌入电泳槽，插入梳子，凝固后拔出。每孔上样3μLMarker和10μL样品，电泳80V、30min；120V、90min。结束后根据预染Marker位置切取目标蛋白所在凝胶区域。“三明治”转膜法组装完成后放入转膜槽并加入湿转液，恒流400mA。随后，将PVDF膜浸入5%BSA封闭液摇动1小时。分别加入一抗在4℃孵育过夜及HRP标记的二抗室温孵育1小时。最后将膜置于显色液中，用SyngeneG：BOX化学XX9成象仪检测目标条带。使用ImageJ软件量化蛋白的表达水平。2.4数据分析与统计记录整理数据，通过Excel和SPSS软件建立模型，K-S检验检验是否服从正态分布，T检验分析对比各组间显著性差异。结果以平均值±标准差的形式表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

结果分析3.1显微结构观察如REF_Ref195799834\h图3.1，通过对照组与氨气组的H&E染色对比评估微观结构可以观察到，对照组肾小管轻度扩张，肾间质中可见少量红细胞（RBC）。氨气组的肾组织出现严重的组织破坏与肾小球萎缩（G），肾小管扩张和刷状缘消失（T）、上皮细胞坏死形成细胞管型（C），肾间质中出现红细胞（RBC）和单核细胞（MC）。注：图A为正常对照组肾脏显微结构，图B为氨气组肾脏显微结构。G是肾小球，T是肾小管，C细胞管型，RBC是红细胞，MC是单核细胞。图STYLEREF1\s3.SEQ图\*ARABIC\s11氨气对猪肾脏影响的显微结构图Fig.3.1Microstructurediagramoftheeffectofammoniaonpigkidneys.3.2细胞因子含量的测定如REF_Ref195800019\h图3.2，通过RT-qPCR和Westernblot的实验结果可以观察到，细胞因子IL-2、IL-8、IL-12和IFN-γ在氨暴露后均出现显著升高（P˂0.05）。注：图A为IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ的相对mRNA表达。图B为IL-12和IFN-γ的相对蛋白表达。数据以平均±标准差表示。不同的小写字母代表不同组间的显著性差异（P<0.05）。n=6.图STYLEREF1\s3.SEQ图\*ARABIC\s12氨气对猪肾脏细胞因子的影响Fig.3.2Effectofammoniaoncytokinesinpigkidney如REF_Ref195800438\h图3.3免疫组化分析也显示IL-12的表达在氨气组（3.29倍，P˂0.05）中显著升高。注：图A、B为IHC染色显示IL-12阳性信号。细胞核为蓝色，阳性信号为棕黄色。图C为IL-12阳性细胞比率。n=3.图STYLEREF1\s3.SEQ图\*ARABIC\s13氨气对猪肾脏IL-12的影响Fig.3.3EffectofammoniaonIL-12inpigkidneys

讨论氨气是一种有毒气体，有研究发现氨气暴露能造成鸡肾脏出现炎症损伤REF_Ref195792653\r\h[22]。组织形态学的观察是揭示组织、细胞和器官病理过程和变化最直观的方法之一。不良刺激会导致机体发生一系列的形态学改变，通过对组织的显微结构的观察研究可以推测生物组织受到的应激状态和形态学变化。相关研究发现，26.9mg/m3氨气浓度下育肥猪血液中白细胞和淋巴细胞等总数显著升高REF_Ref195792707\r\h[23]；肉鸡在遭受急性氨中毒后，气管黏膜上皮细胞发生脱落坏死，并伴随黏膜下层出现充血、出血等典型炎症反应REF_Ref195792740\r\h[24]；肺组织结构完整性受损，肺泡壁完整性被破坏，肺泡内可见红细胞渗出及明显的炎性细胞浸润REF_Ref195792811\r\h[25]。在暴露于重金属的小鼠肾脏中，远端肾小管上皮细胞表现出空泡变性并伴有明显的炎性渗出REF_Ref195792886\r\h[26]。高浓度氨气可导致肉鸡肾脏组织结构改变，肾小管管腔扩张，肾小球和肾间质大量的炎性细胞浸润REF_Ref195792653\r\h[22]。在本次实验通过对照组和氨气组H&E染色评估微观结构对比可以发现与对照组相比，氨气组出现肾小球萎缩，肾小管扩张、上皮细胞坏死等组织学变化，说明氨气暴露可导致育肥猪肾脏组织发生组织损伤。炎症是免疫系统应对外界刺激产生的防御反应。然而，过度或持续的炎症将导致多种慢性疾病的发展。研究发现长期氨气暴露可诱发肾脏持续性炎症反应，通过促炎因子级联释放等机制，最终导致肾组织病理性损伤。IL-2、IL-8、IL-12和IFN-γ参与慢性肾病的发展过程，是肾脏炎症反应的标志物REF_Ref195792951\r\h[27]。研究表明，氨气暴露能大幅促进多种动物炎症因子的表达。氨气刺激鸡脾脏后可导致血清中促炎因子IL-2、IL-8的mRNA表达量显著上升REF_Ref195792951\r\h[25]。陈德纯等REF_Ref195793018\r\h[28]研究发现暴露于氨气环境中的鸡胸腺中IL-2、IL-8和IL-12基因mRNA表达水平显著上升。还有研究发现，大弹涂鱼、翘嘴鳜受氨氮胁迫48h后，肝脏中IL-8基因的mRNA表达量显著升高REF_Ref195793056\r\h[29-REF_Ref195793059\r\h30]。Cheng等REF_Ref195788398\r\h[19]发现氨氮胁迫造成暗纹东方鲀、河豚肝脏中IL-12mRNA表达水平升高，引起炎症反应。此外，氨气刺激还可以损伤断奶仔猪气管和肺部结构，使血清中INF-γ的含量显著升高REF_Ref195793185\r\h[31]。综合上述研究结果发现，氨气暴露可通过上调促炎因子引发多物种的炎症反应，进而对机体造成不利影响。在本次实验同样发现了，氨气可以诱导育肥猪肾脏中IL-2、IL-8、IL-12和IFN-γ的升高，说明当机体受到氨气暴露的损伤时，这些细胞因子参与了炎症反应，长时间的氨气损伤使机体细胞因子水平失调，其过量表达导致了炎症反应的加剧，造成育肥猪肾脏组织损伤。

结论氨气暴露引起细胞因子IL-2、IL-8、IL-12和IFN-γ的表达增加，诱导育肥猪肾脏发生炎症反应和组织损伤。

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