（正式版）DB37∕T 3085-2017 《高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的R∕T-PCR鉴别检测技术》

DB37/T3085—2017高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术 20171229发布 IDB37/T3085—2017本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：杜以军、齐静、丛晓燕、陈蕾、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。DB37/T3085—2017检测技术本标准规定了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术的操作要求。本标准适用于高致病性及经典猪繁殖与呼吸综合征的实验室诊断、监测和流行病学调查等。2实验室生物安全要求实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫4术语与定义下列术语与定义适用于本标准。聚合酶链式反应。十二烷基硫酸钠。5仪器设备和试剂5.1仪器设备5.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。5.1.220000r/min低温高速离心机。5.1.3电热恒温水槽。5.1.4稳流稳压电泳仪。5.1.5水平电泳槽。工2DB37/T3085—5.1.6凝胶成像系统。5.1.7紫外透射反射分析仪。5.1.9烧杯(1000mL)。5.1.10电子天平精度为：0.001g。5.1.12组织匀浆器或研钵。5.1.142℃~8℃冰箱。5.2试剂除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。5.2.2氯仿。5.2.4异丙醇。5.2.5AMV反转录酶(200U/μL)。5.2.6RNA酶抑制剂(40U/μ5.2.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。5.2.81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.1。5.2.950×TAE缓冲液：见附录A.2.1和A.2.2。5.2.10焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水：见附录A.3。5.2.12超纯水：符合GB/T6682,三级。经典毒株扩增片段长度大小为766bp,高致病性毒株扩增基因片段大小为676bp。6操作程序6.1样品的采集和处理6.1.1样品的采集临床上猪的脾、肺、淋巴结、血液等，置于-20℃冰柜或液氮中保存。6.1.2样品的处理6.1.2.1取猪的脾、肺、淋巴结等组织约5g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨；血液3000r/min离心5min,分离血清。6.1.2.2阳性对照处理：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株。6.1.2.3阴性对照处理：灭菌双蒸水。3DB37/T3085—20176.2.1向处理好的300μL组织样品或血清中加入800μLTrizol,重复吹打以裂解细胞(或者剧烈振荡),冰上放置10min～25min。6.2.2加入氯仿200μL,用力振荡30s,室温放置5min。6.2.34℃,12000r/min离心15min,吸取上层液体500μL于1.5mLEP管中。6.2.4加入1.0mL异丙醇，-20℃沉淀RNA至少1h。6.2.54℃12000r/min离心10min,弃上清，用75%的乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min,彻底弃去上清，自然条件下干燥沉淀，溶于50μLDEPC处理的灭菌双蒸水中，-20℃贮存，备用。也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。6.2.6试验中同时设立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。序号体系组成体系含量1RNA22.5mmol/L反转录引物(下游引物)32.5mmol/LdNTPs70℃保温5min,冰浴2min。继续加入。表2反转录体系序号体系组成体系含量15×反转录酶反应缓冲液2AMV反转录酶3RNA酶抑制剂4灭菌DEPC水瞬时离心后，42℃处理45min,95℃灭活10min。取出后直接进行PCR,或置于-20℃保存备用。序号体系组成体系含量1灭菌双蒸水2反转录产物310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7TaqDNA聚合酶DB37/T3085—20174首先加入灭菌双蒸水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，循环30次，72℃延伸10min结束。也可选择市售商品化RT-PCR试剂盒，完成反转录聚合酶链式反应。6.5琼脂糖凝胶电泳6.5.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录A.1。6.5.3加入分子量标准。6.5.4盖好电泳仪，插好电极，5V/cm电压电泳，30min～40min。6.5.5用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。6.5.6用分子量标准比较判断PCR片段大小。7.1在阳性对照出现766bp或者676bp扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立(参见附录A.4)。7.2被检样品扩增片段长度大小为766bp则判定为经典猪繁殖与呼吸综合征病毒株，扩增基因片段大小为676bp则判定为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株(参见附录A.5)。DB37/T3085—20175(规范性附录)试剂的配制A.11.0%琼脂糖凝胶的配制表A.11.0%琼脂糖凝胶的配制试剂名称用量琼脂糖0.5×TAE电泳缓冲液加至100mL微波炉中完全融化，待冷至50℃~60℃时，加溴化乙锭(EB)溶液5μL,摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)试剂名称用量二水乙二铵四乙酸二钠灭菌双蒸水氢氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水加至100mLA.2.2TAE电泳缓冲液(50×)配制试剂名称用量三羟基甲基氨基甲烷(Tris)冰乙酸0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(PH8.0)灭菌双蒸水加至1000mL用灭菌双蒸水稀释使用。表A