人教版高二下学期生物选择性必修3《生物技术与工程》全册知识点复习提纲

第第⑤以四环素抗性基因为标记基因，可以把表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中吗？不能。思考：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。2.以上情况如何解决？使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工。4.以上情况如何解决？人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。四、目的基因的检测与鉴定1.标记基因筛选呈阳性一定能确定目的基因导入受体细胞了吗？不一定，导入的还可能是载体自身环化产物、载体-载体连接物。2.因此，针对目的基因仅仅通过标记基因筛选是不够的，还需要进行分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。3.目的基因的检测与鉴定的目的：（1）检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。（2）检查转基因生物是否培育成功。4．内容：(1)分子水平检测①通过PCR等技术（结合电泳检测）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因。（用DNA分子杂交技术）②检测目的基因是否转录出mRNA。（用分子杂交技术）③从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。（用抗原—抗体杂交技术若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。）（2）个体生物学水平检测有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如生物抗虫鉴定、抗病鉴定（如抗虫、抗病的接种实验）、活性鉴定（鉴定是否具有生物学活性）个体生物学水平鉴定的内容：表达产物是否具有生物学活性（个体是否具有相应性状）。转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡抗病毒（菌）植物病毒（菌）感染（抗病接种实验）未侵染上病斑抗盐植物盐水浇灌正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂正常生长获取目的基因产物的转基因生物提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常（1）DNA分子杂交技术：将转基因生物的基因组提取出来，在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素（或荧光分子）标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，就表明目的基因已导入受体细胞。（2）核酸分子杂交技术：从转基因生物中提取出mRNA，同样用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。（3）抗原-抗体杂交技术：从转基因生物中提取出蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。若有杂交带出现，表明目的基因已表达合成出蛋白质补充思考：如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA？（1）提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物（也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物），之后再进行电泳检测；（2）提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。五、实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定（一）实验原理1.PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。（PCR利用了DNA的热变性原理、DNA半保留复制原理）（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。（3）一次PCR一般要经历30次循环。注意1：DNA热变性的难易程度跟DNA分子中具有三个氢键的GC碱基对的比例有关，该比例越高，DNA热稳定性越高，越难热变性。注意2：一般在PCR实验中引物的添加量大于实际所需量。原因：复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合。能任意增大添加量吗？不能。2.DNA片段电泳鉴定的原理：（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。（2）在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（3）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关；（负相关）（4）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。（二）实验步骤①加液：利用微量移液器按照一定的配方，在微量离心管中依次加入各组分；（每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换）②离心：盖严离心管的盖子，放入离心机，离心约10s,使反应液集中在管的底部。③反应：设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液有微量离心管放入PCR仪中进行反应。预变性条件94℃5min。预变性目的使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。变性30s原因：时间过长，将会导致酶的钝化。④根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。DNA分子通过核酸染料进行染色。⑤将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。（若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的负极）插入梳子的目的：形成加样孔。⑥待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。⑦将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。电泳缓冲液加入电泳槽并没过凝胶1mm应在加样之前进行。⑧将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（对照组）。标准参照物：不同的已知长度的DNA片段。凝胶载样缓冲液怎么使用？将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。⑨接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1〜5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。⑩取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。观察条件：300nm的紫外灯下。（P85）该过程中的几种缓冲液：（1）电泳缓冲液。*为DNA分子带上电荷提供一定的pH。（2）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）。*指示剂前沿迁移到凝胶边缘时，停止电泳（3）扩增缓冲液（内含Mg2+）。*为PCR提供一定的液体环境和pH等条件（三）注意事项：①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。（这样才能使缓冲液中稳定性差的成分和酶的活性不被破坏）③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。（四）结果分析与评价：1.成功扩增出DNA片段的判断依据是什么？（P85）根据条带的分布及粗细程度（可以在紫外灯下直接观察到DNA条带）。2.进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？应该为一条条带。（P85）3.如果出现不止一条条带，可能原因是什么？（1）引物设计不合理，形成了引物二聚体或引物与非目的序列有同源性；（2）复性温度过低；（3）DNA聚合酶质量不好等。（3）模板DNA被污染4.如果未出现条带，可能原因是什么？漏加了PCR反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当，DNA聚合酶失活等。六、生物体内DNA复制与PCR的区别体内DNA复制PCR解旋在解旋酶的作用下，细胞提供能量，双链部分解开加热至90℃以上，双链全部解开，不需要解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物的基础上，以DNA两条链为模板合成子链，其中一条链连续合成，一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成的，控制温度在72℃左右特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增DNA聚合酶需要需要耐高温的DNA聚合酶循环次数受生物体自身控制约30次相同点都需要模板、四种游离的脱氧核苷酸、酶和引物PCR中需要两种引物（分别与DNA的两条链结合），每合成一个子链就需要一个引物。若一个DNA分子扩增n次，则需要引物2n×2-2个。【深挖教材】1．(选择性必修3第77页正文)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。2．(选择性必修3第80页正文)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的不同限制酶切割。3．(选择性必修3第81页“资料卡”)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上？提示：Ti质粒上的T­DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。第3节基因工程的应用一、基因工程在农牧业方面的应用1.美国是世界上转基因作物种植面积最大的国家。2.大豆是世界上转基因作物种植面积最大的作物。3.转基因作物的优点：（1）减少化学杀虫剂使用量（生物防治）；（2）增加作物产量；（3）增加经济收益。4.第一种用于食用的转基因动物为大西洋鲑(俗称三文鱼），在美国批准上市。5.基因工程被广泛用于改良动植物品种、提高作物和畜产品的产量等。（一）转基因抗虫植物（能抗虫，但是不能抗病毒、细菌、真菌等）(1)技术方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中，培育出具有抗虫性的作物。(2)实例：抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。（二）转基因抗病植物(1)技术方法：将来源于病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出转基因抗病植物。(2)实例：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。（三）转基因抗除草剂植物(1)技术方法：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可培育抗除草剂的作物品种。(2)实例：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。(3)培育目的：喷洒除草剂时，杂草会被杀死而作物不会受到损伤。抗虫、抗病、抗除草剂这些特性属于抗逆性。我国西北地区的主要气候特点是年降雨量小，从而影响粮食的产量，如果从基因工程的角度考虑，如何避免粮食减产？可以用基因工程技术培育抗旱作物（筛选获取抗旱基因）。（四）改良植物的品质(1)技术方法：将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。(2)实例：转基因玉米中赖氨酸的含量比对照高30%。(3)改良植物品质主要提高营养价值、观赏价值等（五）提高动物的生长速率(1)技术方法：将外源生长激素基因导入动物体内，提高动物的生长速率。(2)实例：我国培育成功的为转基因鲤鱼。（六）改善畜产品的品质有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，称之为乳糖不耐受。(1)技术方法：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组。(2)获得转基因牛的特点：分泌的乳汁中乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。）二、基因工程在医药卫生领域的应用1.常见的基因工程药物类型：细胞因子、抗体、疫苗和激素等。2.实例：重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物。思考：（1）干扰素的化学本质是什么？糖蛋白。（P90资料卡）（2）干扰素的作用机理是怎样的？干扰病毒复制。（3）干扰素用于哪些疾病的治疗？病毒感染性疾病、乳腺癌、淋巴癌、多发骨髓瘤和某些白血病等。（4）传统生产干扰素的方法是什么？从人血液中的白细胞内提取。（5）目前大量生产干扰素的方法是什么？用基因工程方法从大肠杆菌及酵母菌细胞内获得。（6）我国批准生产的第一个基因工程药物的名称叫什么？重组人干扰素α-1b用于治疗哪些疾病？主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等。3.让转基因哺乳动物批量生产药物实例：乳腺（房）生物反应器生产抗凝血酶、血清白蛋白、生长素和a-抗胰蛋白等重要医药产品。4.技术方法（1）对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物。（2）利用乳腺生物反应器生产药物：将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射导入哺乳动物的受精卵中，胚胎移植前应做DNA分析，鉴定性别，保留雌性。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药物。（P90）思考：（1）乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？不一定；①目的基因在受体细胞中不是成对存在的，相当于杂合子，配子中可能不含该基因，则有性生殖产生的后代中可能不含目的基因。②有性生殖产生的后代可能为雄性，不能分泌乳汁。（2）乳腺生物反应器指的是转基因动物的乳腺吗？不是，乳腺生物反应器指的就是这个转基因生物。（3）为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达。（4）药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？几乎所有细胞。（5）生物反应器除了用乳腺，还可以用什么器官？膀胱。优点：不局限于性别与生长期（乳腺生物反应器必须是雌性，且泌乳期才会分泌）。（6）研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组。（7）乳腺生物反应器生产药物的优点和缺点？优点：产量高、质量好、成本低、易提取。缺点：受性别和年龄限制。比较项目乳腺（房）生物反应器基因工程菌生产药物基因结构哺乳动物基因的结构与人类结构基本相同细菌或酵母菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异基因产物与天然蛋白质完全相同细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性受体细胞哺乳动物的受精卵微生物细胞目的基因导入方式显微注射法显微注射法生产条件不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件产物提取从动物乳汁中提取，相对简单（一般经过工业发酵后）从微生物细胞（或发酵液）中提取，相对复杂5.用转基因动物作为器官移植的供体中选择猪作为器官供体。（1）选择猪器官移植给人最大的难题是免疫排斥。（P91）（2）为什么选择猪作为器官供体？a.猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似。b.猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物。（3）对猪的器官进行改造的方法：在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。三、基因工程在食品工业方面的应用1.基因工程菌概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类，一般称为基因工程菌。（P91相关资料）2.技术方法：利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵生产凝乳酶。思考：根据前面学过的基因工程的操作程序，说出通过基因工程方法用酵母菌生产乙肝疫苗的过程是怎样的？（提示：乙肝病毒抗原蛋白基因）（1）用PCR扩增乙肝病毒抗原蛋白基因；（2）将乙肝病毒抗原蛋白基因插入质粒，构建基因表达载体；（3）将该基因表达载体导入酵母菌(该过程也是将酵母菌制备成感受态细胞，但是并不是用Ca2+处理，而是用醋酸锂处理）；（4）检测并鉴定，筛选出成功转化的酵母菌，进行发酵培养，分离并提纯产物，获得乙肝病毒抗原蛋白。3.基因工程获得的工业用酶的优点：纯度更高、生产成本显著降低、生产效率较高。4.基因工程在环境方面的应用：培育可以降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染。5.基因工程在能源方面的应用：利用经过基因改造的微生物来生产能源。【合作探究】继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了成功。科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。在研制膀胱生物反应器时，应使药用蛋白基因在什么细胞中特异表达？它与乳腺生物反应器有什么相同和不同点？应使药用蛋白基因在膀胱上皮细胞中特异表达。相同点是收集药用蛋白较容易，且不会对动物造成伤害。不同点是乳腺生物反应器必须是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。第4节蛋白质工程的原理和应用对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的。一、蛋白质工程的原理1．蛋白质工程的概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。(2)手段：改造或合成基因（也是实质）(3)目的：对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。(4)操作对象：基因。(5)地位：在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程。(6)理论和技术条件：分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展。二、蛋白质工程崛起的缘由1.基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。（P93）2.基因工程的不足：基因工程在原则上只能产生自然界中已存在的蛋白质。3.天然蛋白质的不足：天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。4.实例：玉米中赖氨酸的含量比较低，赖氨酸合成中两种酶的氨基酸被替换，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。三、蛋白质工程的基本原理1.蛋白质工程的目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。2.蛋白质工程的实质：改造或合成基因（来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质）。3.天然蛋白质合成过程：天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的。4.蛋白质工程思路考试重点（蛋白质工程与天然蛋白质合成的过程相反）：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新基因→获得所需要的蛋白质（包括目的基因转录成，然后翻译获得氨基酸序列（多肽链），再通过盘曲折叠获得高级结构进而行使预期功能）。5.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因，或应用基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等进而改造基因。四、蛋白质工程的应用1．在医药工业方面的应用(1)研发速效胰岛素类似物：科学家通过改造胰岛素基因使B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物。(2)提高干扰素的保存期：将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，提高了干扰素的保存时间。(3)改造抗体：通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。降低人对小鼠单克隆抗体的免疫反应。2．在其他工业和农业方面的应用(1)改进酶的性能或开发新的工业用酶：利用蛋白质工程获得蛋白酶的多种突变体。(2)改造某些重要的酶：利用蛋白质工程改造参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率。3.蛋白质工程是一项难度很大的工程主要原因：蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。4.蛋白质工程与基因工程比较项目蛋白质工程基因工程操作对象基因基因操作起点预期蛋白质功能目的基因操作水平DNA分子水平DNA分子水平操作流程预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定结果可生产自然界没有的蛋白质可生产自然界已有的蛋白质实质通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状（基因重组）联系①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程基本操作；5.判断是基因工程还是蛋白质工程的依据：是否改造或合成基因，得到的蛋白质是否为天然蛋白质。6.为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？（1）蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大。（2）蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质。（3）基因可以遗传，蛋白质无法遗传。补充1：基因的定点突变技术1——重叠PCR（1）该过程需要4种引物；（2）PCR1的产物AB是引物a和引物b扩增的结果；（3）PCR2的产物CD是引物c和引物d扩增的结果；（4）产物AD的形成需要引物吗