生殖系序列中免疫球蛋白重链和轻链可变区的热点基序

生殖系序列中免疫球蛋白重链和轻链可变区的热点基序背景​B细胞表达针对各种抗原的受体（BCR），每个BCR都具有独特的特异性，能够识别并对抗特定抗原。特定的新发或复发病原体。该受体是一种膜结合免疫球蛋白（Ig），由相同的Ig重链和轻链对组成的异二聚体构成，这些重链和轻链对决定了B细胞库的克隆多样性。存在一些变异性较高的集中区域，称为互补决定区（CDR）。这些区域位于VH和VLβ链的连接环上，构成抗体分子中的抗原结合位点。其余区域的变异性较低，称为框架区（FR）。尽管免疫球蛋白基因对免疫功能有着显而易见的核心作用，但它们很少被认为是疾病易感基因。近期研究表明，强烈的遗传偏倚塑造了个体的免疫球蛋白谱。研究还表明，单个密码子的改变即可影响免疫球蛋白基因编码保护性抗体的能力。背景​抗体库的巨大多样性是由两个过程产生的：

V(D)J重组-生殖系基因片段（重链的V、D和J，轻链的V和J）的重组，产生B细胞受体(BCR)。体细胞高频突变(SHM)——SHM发生在抗原激活的生发中心B细胞中，通过产生点突变促进抗体亲和力成熟，这些点突变可能导致VL和VH区氨基酸替换。目前的SHM模型认为激活诱导脱氨酶(AID)以及几种DNA修复途径对突变过程至关重要。AID通过将胞嘧啶转化为尿嘧啶来启动SHM，从而在IgV(D)J序列中产生U:G错配。如果这些错配在细胞复制前未得到修复，则会产生C→T（胸腺嘧啶）转换突变。无论是靶向碱基（热点）还是引入的替换，都存在明显的内在偏好。热点包括WRCY/RGYW和WA/TW，其中W=(A,T)，Y=(C,T)，R=(G,A)。通过分析种系Ig序列，我们可以预测SHM的基序靶位点。本项目的主要目标是研究Ig重链和轻链可变区序列中CDR和FR的热点基序。具体步骤如下：检查CDR和FR中的多样性。检查CDR和FR中基序的频率是否存在差异。检查CDR和FR中基序数量与香农指数之间的相关性。检查位置中基序数量与香农指数之间的相关性。检查位置上的图案保留情况。

方法种系序列取自IMGT数据库。使用R（编程语言）对整个序列进行分析。对基因进行筛选，保留完整且功能完整的基因，然后进一步缩短至统一长度312个核苷酸（包括间隙）。经过过滤，并去除等位基因少于10个的家族后，411个IGHV等位基因中剩下232个，104个IGLV等位基因中剩下47个。香农指数计算多样性，其中p是n（找到的特定核苷酸（A/T/C/G）的数量）与N（位置上的核苷酸总数）之间的比例，s是位置的数量。主要目标结果——CDR和FR的多样性。在对同一家族的每个区域进行过滤后，计算了其多样性。过滤过程中，去除了空位“.”数量超过50%的位置，以减少偏差。几乎所有家族中，CDR区域的多样性均高于FR区域（图1）。例外情况是IGLV2中的CDR1（图1A），其香农指数为0.145；以及IGHV4中的CDR2，其香农指数为0.142（图1B）。图1：A-按CDR和FR划分的IGLV家族香农指数平均值。B-按CDR和FR划分的IGHV家族香农指数平均值。C-IGLV和IGHV家族中香农指数的平均值（按CDR和FR划分）。在IGLV中，当基序数量按等位基因数量进行归一化以及同时按这两个变量进行归一化时，FRs的值均较高。此外，当RGYW/WRCY基序的数量按区域长度进行归一化时，可以看出FRs中的基序数量较高，而CDRs中的TW/WA基序数量较高（图2）。在IGHV中，当基序数量按等位基因数量进行归一化时，FRs中的基序数量较高，与IGLV类似；当RGYW/WRCY基序的数量同时按这两个变量进行归一化时，FRs的值较高，与CDRs的差异很小（0.056）。然而，当RGYW/WRCY基序的数量按区域长度进行归一化以及当TW/WA基序的数量同时按这两个变量进行归一化时，CDRs的值较高（图3）。图2：IGLV中CDR和FR区域的基序数量。A-IGLV家族（IGLV1、IGLV2、IGLV3）中基序数量除以等位基因数量的总和。B-基序数之和除以无间隙区域的平均长度。C-基序数量之和除以等位基因数量和区域长度。图3：IGHV中CDR和FR区域的基序数量。A-IGHV家族（IGLV1、IGLV2、IGLV3）中基序数量除以等位基因数量的总和。B-基序数之和除以无间隙区域的平均长度。C-基序数量之和除以等位基因数量和区域长度。结果-

CDR和FR中基序的频率。IGLV等位基因的相关性CDR中的TW/WA基序（图4A）：p值（CDRs）=0.02353，相关系数=-0.258。FR中的TW/WA基序（图4B）：p值（FRs）=6.075e-05，相关系数=-0.282。CDR中的RGYW/WRCY基序（图4C）：p值（CDRs）=0.001724，相关系数=-0.548。CDR中的RGYW/WRCY基序（图4D）：p值（FRs）=3.157e-06，相关系数=-0.409。图4：A-IGLV等位基因中每个2-mer位置的TW/WA基序总和与CDR中所有2-mer位置的香农指数多样性平均值之间的相关性。B-IGLV等位基因中每个2-mer位置的TW/WA基序总和与FR中所有2-mer位置的香农指数多样性平均值之间的相关性。C-IGLV等位基因中每个2-mer位置的RGYW/WRCY基序之和与CDR中所有4-mer位置的香农指数多样性平均值之间的相关性。D-IGLV等位基因中每个2-mer位置的RGYW/WRCY基序之和与FR中所有4-mer位置的香农指数多样性平均值之间的相关性。结果-

CDR和FR中基序数量与香农指数之间的相关性。平均香农指数IGHV等位基因的相关性。CDR中的TW/WA基序（图5A）：p值（CDRs）=0.3104，相关系数=-0.086。FR中的TW/WA基序（图5B）：p值（FRs）=5.138e-05，相关系数=-0.252。CDR中的RGYW/WRCY基序（图5C）：p值（CDRs）=0.9245，相关系数=-0.0139。CDR中的RGYW/WRCY基序（图5D）：p值（FRs）=0.009682，相关系数=-0.22。图5：A-IGHV等位基因中每个2-mer位置的TW/WA基序总和与CDR中所有2-mer位置的香农指数多样性平均值之间的相关性。B-IGHV等位基因中每个2-mer位置的TW/WA基序总和与多样性之间的相关性-FR中所有2-mer位置的家族香农指数平均值。C-IGHV等位基因中每个2-mer位置的RGYW/WRCY基序之和与多样性之间的相关性-CDR中所有4-mer位置的家族香农指数平均值。D-IGHV等位基因中每个2-mer位置的RGYW/WRCY基序之和与多样性之间的相关性-FR中所有4-mer位置的家族香农指数平均值。结果——CDR和FR中基序数量与香农指数之间的相关性。通过检验各位置基序总数与多样性（香农指数平均值）之间的相关性，我们发现基序占比低于50%的位置并不呈现特定的模式。我们无法断定基序数量越多，多样性就越高还是越低。当观察基序数量在50%至75%之间的位置时，情况也是如此。然而，当我们观察基序数量在75%至100%范围内的位置（紫色点）时，我们可以发现香农指数无一例外地都很低（图6和图7）。结果——基序数量与香农指数在位置上的相关性。图6：仅表示基序数大于0的位置。A-WA基序总和之间的相关性。B-TW基序总和之间的相关性。C-WRCY基序总和之间的相关性。D-RGYW基序总和之间的相关性。图7：仅表示基序数大于0的位置。A-WA基序总和之间的相关性。B-TW基序总和之间的相关性。C-WRCY基序总和之间的相关性。D-RGYW基序总和之间的相关性。根据结果，我还检查了基序在所有等位基因中出现的百分比。当（位置上的基序数/等位基因数）=1时，可以得出结论，所有等位基因的相同位置都出现了该基序。由于IGLV中只有一个位置的基序数量在75%-100%之间，所以我专注于IGHV。图8向我们展示了，在同一家族及其他家族的所有等位基因中，某些位置的基序高度保守。在我研究的所有IGHV家族（IGHV1、IGHV2、IGHV3和IGHV4）中，这些基序的位置基本相同。例如，位于307位的WRCY基序（图8D）出现在所有IGHV1等位基因中，0.958%的IGHV2等位基因中出现，0.99%的IGHV3等位基因中出现，以及所有IGHV4等位基因中出现。图8：IGHV中2(/)4-mers位置的基序数量，按每个家族的等位基因数量进行标准化。仅显示归一化基序数大于1的位置。结果——位置上的图案保留。我尚未能证明存在一个图案数量较多的区域。我一直未能将不同区域的基序数量与香农指数联系起来。我发现，在基序数量较多的位置，其多样性较低，因此我可以得出结论，在同一位置的基序中，核苷酸的同一性相对或完全地得以保