动物细胞工程（动物细胞融合技术与单克隆抗体）课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第二节：动物细胞工程动物细胞融合技术与单克隆抗体

雷公藤是一个有着悠久、广泛应用历史的中药。雷公藤甲素是从雷公藤中提取的一种天然活性二萜类化合物，具有多种抗癌作用机制，例如2021年PNAS发表论文：雷公藤甲素能够通过抑制Nrf2相关的谷胱甘肽合成通路，让IDH1突变的癌细胞死于氧化应激。但雷公藤甲素的临床应用仍面临一些挑战，如毒性较大、具有基因表达抑制无特异性、不溶于水等。雷公藤甲素无法大面积用于临床的原因是什么？2.同学们可不可以找到一种方法解决这个问题，使雷公藤甲素只作用于肿瘤细胞？靶向给药系统（TDDS）是通过载体使药物选择性的浓集于病变部位的给药系统，病变部位常被形象的称为靶部位，它可以是靶器官、靶组织、靶细胞，也可以是靶细胞或细胞内的某靶点。靶向制剂不仅要求药物到达病变部位，而且要求具有一定浓度的药物在这些靶部位滞留一定的时间，以便发挥药效。特点：①可以提高药效；②降低毒性；③可以提高药物的安全性，有效性；④可以提高病人用药的顺应性。被动靶向制剂的载药微粒包括：脂质体、乳剂、微囊和微球、纳米囊和纳米球。右图为当下科学研究和临床使用的四种类型的脂质体，分别为常规脂质体、多聚乙二醇化脂质体、配体靶向脂质体、治疗一体化脂质体。配体靶向性脂质体在表面接一种识别分子（即配体），通过配体分子的特异性和专一性，与靶细胞表面的受体分子相互作用使脂质体在靶区释放药物。知识回顾：1.如何得到某种抗原的特异性抗体？可以给实验动物注射该抗原使动物进行特异性免疫，再从血清中分离所需抗体。2.上述方法存在哪些缺点？产量低浓度低分离得到的纯度无法保证，特异性差动物使用引发的问题质量、效率、安全性如何解决？一个极富创造力的方案：动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体1975年，米尔斯坦和科勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体【资料1】将已适应体外培养的小鼠骨髓癌细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞(B淋巴细胞)进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨随瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。骨髓瘤细胞B淋巴细胞融合杂交瘤细胞可产生特定抗体的杂交瘤细胞筛选鉴定融合、筛选、鉴定如何解决？【资料2】1957年，日本学者冈田善雄在培养动物细胞时，发现失去活性的仙台病毒能诱导两个动物细胞融合，产生具有两个核的细胞。研究表明，很多不同种的动物细胞都能进行融合，形成杂交细胞。如鼠－鸡、鼠－兔、鼠－猴等等。1962年日本发现血凝病毒粒子表面具有溶血活性物,当细胞表面与病毒粒子结合可以诱发邻近的腹水瘤细胞互相接近,最后细胞膜融合而成为双核或多核细胞。1.材料中提到的动物细胞融合技术是什么？病毒诱导融合2.课本48页上还提到了哪些动物细胞融合技术？PEG融合、电诱导融合活动一：动物细胞融合技术3.使用流程图表示动物细胞融合技术4.动物细胞融合技术和植物体细胞融合技术什么差异？用抗原注射小鼠从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养已免疫B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合多种杂交细胞小鼠的脾脏中获取诱导融合后得到的细胞一定就是我们所需的杂交瘤细胞吗？如何对杂交瘤细胞进行筛选与分离？【资料3】DNA合成可分为两种途径，一是从头合成途径（D途径），利用磷酸核糖焦磷酸和尿嘧啶，可被氨基蝶呤（A）阻断；二是补救合成途径（S途径），在次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）存在下利用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）。B淋巴细胞中这两种DNA的合成途径都有，而鼠骨髓瘤细胞中只有D途径。【资料4】先解释HAT培养基里的三种成分：H是次黄嘌呤，A是氨基蝶呤，T是胸腺嘧啶核苷。HAT培养基中加入氨基蝶呤的目的是抑制核苷酸合成主通路；加入次黄嘌呤与胸腺嘧啶核苷的目的是为核苷酸合成旁路提供原料。缺乏次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）的缺陷型细胞，在HAT选择培养液中不能生长。可以选择缺陷型的骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，这样就可以使用HAT选择培养液筛除未融合的骨髓瘤细胞及骨髓瘤自身相互融合的细胞。根据上述资料，我们可以选择那种类型的骨髓瘤细胞？为什么？筛选过程到此结束了吗？没有，分离得到的B淋巴细胞并非只有一种，我们还需继续筛选可以产生目标抗体的单一杂交瘤细胞。S途径D途径D途径淋巴细胞

合成DNAS途径D途径骨髓瘤细胞

合成DNA杂交瘤细胞

合成DNA选择培养基（加入氨基蝶呤）接种融合细胞可分裂的为杂交瘤细胞置于选择性培养基（HAT）上培养2杂交瘤细胞13第一次筛选多种杂交瘤细胞融合的细胞骨髓瘤细胞自身融合B细胞自身融合杂交细胞132未融合的B淋巴细胞未融合的骨髓瘤细胞未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡【资料5】有限稀释法——通过逐步稀释得到一定体积内只有1个或少量细胞的方法。二单克隆抗体及其应用二单克隆抗体及其应用二单克隆抗体及其应用抗原1二单克隆抗体及其应用抗体检测呈阳性【资料6】酶联免疫（ELISA）——是常用的分离和鉴定蛋白质的技术。将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，通过观察显色反应有无与强弱来判断目标抗体的有无及含量。是否可以借助酶联免疫法对杂交瘤细胞进行筛选？杂交瘤细胞产生的抗体相当于图片里的那种物质？克隆化培养抗体检测第二次筛选(抗原-抗体杂交技术)多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞阳性细胞注射到小鼠体内体外培养分离、提纯单克隆抗体体内或体外培养能分泌所需抗体的杂交瘤细胞优点：特异性强灵敏度高可大量制备项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高基于单克隆抗体制备的过程，回答有关问题：(1)为什么要对小鼠注射特定的抗原？提示：为了获得能产生相应抗体的B淋巴细胞。(2)单克隆抗体制备过程中，第一次筛选和第二次筛选的目的是什么？方法是什么？其原理是什么？提示：思考第一次筛选第二次筛选目的方法原理得到杂交瘤细胞得到能产生所需要抗体的杂交瘤细胞用特定的选择培养基（HAT）进行筛选抗体检测抗原-抗体的特异性结合只有融合的杂交瘤细胞才能在选择培养基上生长现在请同学们根据本节内容及课本48页单克隆抗体制备过程，总结单克隆抗体制备的流程。小鼠活化的B淋巴细胞骨髓瘤细胞多种融合细胞选择培养基筛选诱导融合杂交瘤细胞克隆化培养抗体检测能分泌所需抗体的杂交瘤细胞体外培养体内培养获得单克隆抗体细胞培养液中提取小鼠腹水中提取注射抗原制备单克隆抗体的流程动物细胞融合杂交瘤细胞筛选单克隆抗体生产