3.2基因工程的基本操作程序 课件(共52T)高二下《生物》（人教版）选必修3

我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。普通棉花如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？转基因抗虫棉第3章基因工程将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花转基因抗虫棉非转基因抗虫棉【从社会中来】1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。将该细菌的Bt抗虫蛋白基因（“杀虫基因”，简称Bt基因）转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定01目的基因的筛选与获取一、目的基因1.概念在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。2.作用根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。3.实例与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。培育转基因抗虫棉用到的目的基因Bt抗虫蛋白基因简称

Bt基因实例：Bt

抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关不仅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因二、筛选合适的目的基因1.从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。2.认识基因结构和功能的技术方法测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，可能。三、获取目的基因的方法2.人工合成目的基因。对目的基因的要求？？1.通过构建基因文库来获取目的基因。3.常用

PCR特异性地快速扩增目的基因。基因文库含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。基因组文库部分基因文库主要是cDNA（互补DNA？）文库某种生物的成熟mRNA

→单链DNA→双链DNA逆转录酶DNA聚合酶目的基因较小且全部序列已知基因组文库与部分基因文库的关系利用PCR获取和扩增目的基因（超级厉害，超级好用）PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。利用PCR获取和扩增目的基因1.PCR的含义PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。2.PCR的原理DNA半保留复制3.PCR的场所在一定的缓冲溶液中进行，其中一般要添加Mg2＋。原因？DNA聚合酶需要Mg2＋激活PCR扩增仪4.PCR的条件DNA模板（目的基因模板）、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）【重温】DNA复制的过程，回忆DNA体内复制所需的条件解旋合成子链形成新DNACCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'DNA聚合酶形成磷酸二酯键子链延伸合成的方向？只能从5′－端→3′－端延伸4.复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶DNA母链合成DNA子链的原料催化合成DNA子链

2种引物？？？维持反应体系pH稳定提供DNA复制的模板断开氢键，打开DNA双链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的DNA聚合酶）（体外用高温代替）4种脱氧核苷酸DNA聚合酶缓冲溶液以及能量3′5′子链的延伸方向是5′→3′？DNA聚合酶3′5′模板链子链因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端子链合成需要引物？引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（引物1和引物2的序列相同吗？？引物长度？DNA还是RNA序列？？）3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2引物为何物？3’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。→细胞内→细胞外（PCR）用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端PCR能特异性获得和扩增所需目的基因的玄妙之处在哪里？？制作的特定序列的引物与特定的基因配对，引起特定基因复制（特异性对某基因进行复制需要已知其全部序列吗？）已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。

5’-T

C

C

T

A

G

A

A

T

T

C

T

C

G

G

T

A

T

G

A

A

T

T

C

C

A

T

A

C-3’

3’-A

G

G

A

T

C

T

T

A

A

G

A

G

C

C

A

T

A

C

T

T

A

A

G

G

T

A

T

G-5’以下是要扩增的DNA片段，请写出两种引物的序列（用5个碱基表示即可）引物1：GTATG引物2：TCCTA以下这两组引物的序列选择合理吗？原因？引物选择标准

：1.能和目的基因两端的碱基序列配对2.引物自身及引物之间不应存在互补序列3.长度适宜

体外合成DNA需要这些条件吗？提供条件的方式相同吗？还需要其他条件吗？参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶DNA母链合成DNA子链的原料催化合成DNA子链

2种引物维持反应体系pH稳定提供DNA复制的模板断开氢键，打开DNA双链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的DNA聚合酶？）（体外用高温代替）4种脱氧核苷酸DNA聚合酶缓冲溶液以及能量阅读PCR过程，对比体外复制DNA与复制DNA的条件与过程①变性当温度上升到90℃以上时，双链DNA自动解聚为单链。3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合②复性③延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）的作用下，根据碱基互补配对原则延伸合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’95℃50℃72℃退火变性温度受什么影响？？GC含量越高？第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。第二轮循环的产物第三轮的产物完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式扩增（约为

，其中n为扩增循环的次数）。指数2nPCR中的数量关系（初始DNA数量为1个）复制次数123nDNA分子数

含引物的DNA分子数

含有其中某一种引物的DNA分子数

同时含有两种引物的DNA分子数

共消耗引物的对数

共消耗引物的个数第n次消耗引物的对数？

个数？3’5’3’5’2n2n2n-12n-22n-12n+1－22n2n-1（1）图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第

轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。PCR扩增过程中产生等长的目的基因片段的分析1次后2次后3次后循环次数DNA总数完整目的基因个数非目的基因个数120224043826循环次数DNA总数完整目的基因个数非目的基因个数416885322210n2n2n-2n2n3次后4次后5次后要保证扩增出来的目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2【三点提醒】①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。脱氧核苷三磷酸7.PCR产物的鉴定常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。6.比较PCR扩增技术和体内DNA复制的异同项目体内DNA复制PCR扩增技术解旋方式解旋酶催化DNA在

下变性解旋场所细胞内（主要在

内）PCR扩增仪内酶

温度条件细胞内温和条件需控制温度，在

下进行结果DNA分子DNA片段或目的基因相同点（1）模板：均需要DNA的两条单链作为

；（2）原料：均为4种

；（3）酶：均需

酶高温作用细胞核解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶较高温度模板脱氧核苷酸DNA聚合酶实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是∶在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（

）A．做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA反转录为DNA后再进行扩增C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D．病毒的检测还可以检测病毒的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原-抗体杂交C核酸检测究竟是什么？？p79？：用PCR可以扩增mRNA吗通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变.图1为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点.有关叙述正确的是（

）A.两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等C.第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8APCR的其他应用②设计引物的依据是：

_______________________

③两种引物都结合在DNA模板链的_____端脱氧核苷酸连接在引物的_____端进行延伸，子链的延伸方向_____

已知目的基因两端的核苷酸序列为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点关于引物复习①使用的两种引物的序列相同吗？

_________________________________________3’3’不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列*复制两种引物之间的序列引物1和引物2不同5’→3’④引物设计的要求（或引物失效的原因）a._______________________________________

b._____________________________________

引物内部不能发生局部碱基互补配对（防止引物自身折叠）两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对（防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合）Bt基因苏云金杆菌DNA限制酶Bt基因质粒限制酶导入DNA连接酶重组DNA分子目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定基因工程的4个步骤：核心二、基因表达载体的构建1.目的使目的基因在受体细胞中稳定存在使目的基因遗传给下一代使目的基因能够表达和发挥作用2.表达载体的结构一个基因表达载体的组成，除了有目的基因外，还必须有启动子、终止子、标记基因等注意：如需要复制，还应包括复制原点复制原点目的基因标记基因启动子终止子复制原点目的基因标记基因启动子终止子启动子(1)本质：

特殊序列结构的DNA片段(2)位置：

基因的上游，紧挨转录起始位点(3)功能：

RNA聚合酶识别和结合的部位终止子(1)本质：

特殊序列结构的DNA片段(2)位置：

基因的下游(3)功能：

使转录在所需要的地方停止转录注意：(1)诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达(2)启动子具有组织特异性

制作乳腺生物反应器时，需要将药用蛋白基因插入在乳腺蛋白基因的启动子之后基因表达载体的组成【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。复制原点：复制开始的一段DNA序列（复制的起点）启动子终止子起始密码子终止密码子【区分两组概念】位于基因上位于mRNA上翻译的起始点翻译的终点转录的起始点转录的终点本身不转录决定氨基酸不决定氨基酸3．基因表达载体的构建过程①首先用一定的

切割载体（质粒），使它出现一个切口。②然后用

限制酶或能产生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。②再利用

将含目的基因的DNA片段拼接到

的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。限制酶同种相同DNA连接酶载体【问题探究6】请结合下图，回答问题：（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。标记基因，用于

重组DNA分子的筛选（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？如果能有何弊端？①质粒、目的基因会发生自身环化连接；②会发生两两自身连接；③质粒与目的基因会发生反向连接。能（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；②还可以防止目的基因与载体的反向连接？【核心归纳】图解限制酶的选择原则（1）不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。（3）确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？最佳方案？可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。【例5】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(

)A.PCR产物的分子大小在250至500bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰B【例6】下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为抗氨苄青霉素基因）。下列叙述错误的是（）A．④过程中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选B．可同时选用限制酶PstI、SmaI对含目的基因的DNA进行剪切C．过程②可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞D．质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达D1．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(

)A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D．二者遵循的碱基互补配对原则相同B2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示青霉素抗性基因。下列叙述错误的是(

)A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNAB．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长D【补充】基因的结构DNA片段基因1基因2