CN115975903B 甲烷氧化菌群的富集驯化及应用方法 （上海交通大学）

通过对富甲烷环境样品中微生物进行富集活化液和NMS培养基混合制成的稻田驯化培养液进行2所述的甲烷氧化菌群，通过对富甲烷环境样品中微生物进行富集活3.根据权利要求1或2所述的稻田甲烷减排应用包括：以煤矿渣为富甲烷环境样品得到的克劳斯氏菌(Cloacibacterium)、甲基孢囊菌(Methylocystis)、保所杆菌(Emticicia)、金黄杆菌(Chryseobacterium)、固氮螺菌步骤3，将步骤2得到的生长至对数期的甲烷氧化菌群富集液转接到稻田驯化培养液中，向包含甲烷氧化菌群富集液和稻田驯化培养液的混合液中通入体积比为1:1的甲烷和由NMS培养基添加不同体积比例的稻田土壤上清液配制，稻田土壤上清液添加量占总体积37.根据权利要求1所述的稻田甲烷减排应用方法，其502O4[0002]目前稻田甲烷减排的措施主要包括改良水稻种植技术、施用有机肥及土壤改良富集液，并进一步通过由NMS培养基添加不同体积比例的稻田土壤上清液配制的稻田驯化培养液对甲烷氧化菌群富集液进行驯化培养，获得应用于稻田甲烷减排的甲烷氧化菌群；穗扬花期和成熟期的稻田甲烷排放量分别为2.86mg/m2/d、4.12mg/m2/d、3.58mg/m2/d和2.66mg/m2/d，相比于未接种的50.83利用污水处理厂二沉池污泥富集驯化获得的甲烷氧化菌群MOPF_2接种于稻田后在分蘖期、拔节孕穗期、抽穗扬花期和成熟期的稻田甲烷排放量分别为2.54mg/m2/d、3.95mg/m2/d、2.76mg/m2/d和2.35mg/m2/d，相比于未接种的稻田甲烷排放量分别降低进行富集活化获得甲烷氧化菌群富集液，再通过稻田土壤上清液和NMS培养基混合制成的5为富甲烷环境样品得到的甲基孢囊菌(Methylocystis)、克劳斯氏菌(Cloacibacterium)、[0011]步骤2，将步骤1得到的已复壮的富甲烷环境样品接种于选择性富集培养基NMS培液中，向包含甲烷氧化菌群富集液和稻田驯化培养液的混合液中通入体积比为1:1的甲烷壤上清液的体积比为25第2、3阶段逐级提高25第4阶段稻田驯化培养液中稻田土壤[0015]所述的NMS培养基的组分及浓度含量为：MgSO4·7H2O0.2g/L、CaCl2·6H2O32O2.0g/4[0020]所述的浇灌，采用细胞密度为108CFUcell/mL的甲烷氧化菌群，每亩用10_15公养期间逐级提高稻田驯化培养液中稻田上清液的体积比，逐步提高其对稻田环境的适应性。本发明利用煤矿渣富集驯化获得的甲烷氧化菌群MOPF_1接种于稻田驯化培养液后3天水处理厂二沉池污泥富集驯化获得的甲烷氧化菌群MOPF_2接种于稻田驯化培养液后3天即6[0025]图3为甲烷氧化菌群富集液_1(驯化前)与甲烷氧化菌群MOPF_1(驯化后)接种稻田[0026]图4为甲烷氧化菌群富集液_2(驯化前)与甲烷氧化菌群MOPF_2(驯化后)接种稻田[0027]图5为接种与未接种甲烷氧化菌群MOPF_1的水稻土壤甲烷氧化气相色谱分析示意[0028]图6为接种与未接种甲烷氧化菌群MOPF_2的水稻土壤甲烷氧化气相色谱分析示意[0030]图8为接种与未接种甲烷氧化菌群MOPF_1、MOPF_2稻田在不同水稻种植时期的甲[0032]图10为甲烷氧化菌富集液_1、甲烷氧化菌富集液_2的菌液PCR琼脂糖凝胶电泳结[0037]2.1)取4g复壮煤矿渣接种到40mL已灭菌的选择性富集培养基NMS培养基，30℃、7[0038]2.2)取4mL第5次富集培养后的菌液接种于装有40mLNMS培养基的100mL灭菌厌氧PCR产物用TIANgelPurificationKit(Tiangen,China)柱式纯化试剂盒纯化，纯化的PCR产物在ABI3730xl全自动DNA测序仪(ABI,CA,USA)进行一代测序，并将测序结果上传至231.042O222O[0046]步骤3)取4mL生长至对数期的上述甲烷氧化菌富集液_1转接到装有40mL稻田土壤上清液和NMS培养基混合制成的稻田驯化培养液的100mL灭菌厌氧瓶中，按表1所示驯化步8[0053]相比甲烷氧化菌群富集液在选择富集培养基NMS培养基中的甲烷氧化速率，菌群[0054]取4mL生长至对数期的上述甲烷氧化菌群MOPF_1接种于40mL稻田驯化培养液中，[0055]步骤4)取40g上海市浦东新区实际稻田土壤于厌氧瓶中，投加40mL上述甲烷氧化股份有限公司进行16SrDNA扩增子测序。使用天根磁珠法通用型基因组提取试剂盒提取DNA，选择16SrRNA基因的V3_V4区域作为扩增和测序的目的片段，引物序列为:341F:9序列间的相似性划分不同的运算分类单元(OTU)，对97％相似水平下的运算分类单元进行甲烷氧化菌群MOPF_1在不同分类层级水平上的群落组成。表1为甲烷氧化菌群MOPF_1的属图1所示。从图1中可以看出，该菌群在属水平上的组成主要为Cloacibacterium、化菌群MOPF_1作为空白对照组。接种甲烷氧化菌MOPF_1的处理组与空白对照组各设3个小[0066]甲烷氧化菌群富集液_2经菌液PCR扩增得到500bp左右条带(图10)，将PCR产物测[0070]表2为甲烷氧化菌群MOPF_2的属水平物种丰度，根据属水平物种丰度绘制甲烷氧组成主要为Methylocystis、Cloacibacterium、Methylomonas、Phreatobacter和[0074]取4mL生长至对数期的上述甲烷氧化菌群MOPF_2接种于40mL稻田驯化培养液中，[0075]取40g上海市浦东新区实际稻田土壤于厌氧瓶中，投加40mL上述甲烷氧化菌群接种甲烷氧化菌群MOPF_2的水稻土壤甲烷氧化速率为22.16mL/d，较未接种的水稻土壤相节孕穗期、抽穗扬花期和成熟期的稻田甲烷排放量分别为2.86mg/m2/d、4.12mg/m2/d、42.63％和50.83利用污水处理厂二沉池污泥富集驯化获得的甲烷氧化菌群MOPF_2接种55.77％和56.56富集驯化获得的2个甲烷氧化菌群均对水稻产量无不良影响。[0078]上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，