CN117959420B 一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及制备方法 （江苏省农业科学院）

protein.Virology.2022,第579卷29-37.一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及制备方法，属于兽用生物制品领域。本发明构建了含S基因的重组真核质粒组蛋白PEDV_2a_S和pPEDV_2b_S，将两者混合后与佐剂共同构建猪流行性腹泻病毒二价亚单位中诱导较高的中和抗体水平，免疫的仔猪/乳猪行性腹泻病毒二价亚单位疫苗对猪具有良好的2亚单位疫苗包含重组蛋白PEDV_2a_S和PEDV_2b_S，其中，所述PEDV_2a_S的氨基酸序列如所述PEDV_2a_S和PEDV_2b_S的混合物与所述佐剂的体所述混合物为所述PEDV_2a_S和PEDV_2b_S等质量混合，所述混合将重组蛋白PEDV_2a_S和PEDV_2b_S等质量混合后与佐剂等体积混合后，室温搅拌乳所述重组蛋白PEDV_2a_S和PEDV_2b_S的混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位3[0002]猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)属于冠状病毒科[0003]接种疫苗是目前防控PED的主要手段之一。目前市面上售卖的猪流行性腹泻疫苗势抗原COE区域(499～638aa)及2个B淋巴细胞位点(744～755和756～771aa)，S2的胞外区有胰酶切割位点。S蛋白在与宿主细胞受体的相互作用以及进入宿主细胞的过程中发挥着4[0008]本发明提供一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，包括重组蛋白PEDV_2a_S和所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3m[0021]本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗的制备方法，包括以下步[0022]将重组蛋白PEDV_2a_S和PEDV_2b_S混合后与佐剂等体积述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3m[0024]本发明还提供重组蛋白PEDV_2a_S和PEDV_2b_S在制备猪流行性腹泻病毒二价亚重组蛋白PEDV_2a_S和PEDV_2b_S，还可以是PEDV_2a_S和PEDV_2b_S的编码基因，或包含PEDV_2a_S和PEDV_2b_S的编码基因的表达载体[0026]本发明通过实验证明重组真核质粒能特异性表达PEDVG2a_S和G2b_S蛋白，且能乳汁中诱导较高的中和抗体水平。相比于对照组，免疫组仔猪/乳猪肠道组织病变明显较病毒载量较低。本发明明确了PEDVG2a_S/G2b_S二价亚单位疫苗在猪体上的免疫保护效52a_S与pPEDV_2b_S的质粒图谱；B为表达PEDV_2b_S与PEDV_2a_S蛋白的Westernblot分析结果；C为表达PEDV_2b_S与PEDV_2a_S蛋白的间接免疫荧光分析；D为纯化PEDV_2b_S与B为27日龄仔猪攻G2b(AH2012)毒腹和i分别为二价亚单位疫苗免疫组仔猪的大体病理学；h和j分别为攻毒对照组仔猪的大体[0033]图6为验证PEDVG2a_S/G2b_S二价亚单位疫苗接种5日龄仔猪的保护作用；a_e为6[0040]应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发由本实验室保存；HK2021毒株S基因密码子的优化合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完购自天根生化科技(北京)有限公司；Opti_MEM购自美国Gibco公司；SinofectionTransfectionReagent和SMM293_TIIExpressionMedium均购自北京Sinobiological瓶购自广州Jetbiofil股份有限公司；耐CO2水平摇床(CO_06U)购自美国精骐有限公司；HisTrapHP蛋白纯化柱购自美国Cytiva公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生[0051]分别以PEDVG2a毒株HK2021株S基因序列(GenBank:OL762457)和G2b毒株AH2012/7构建到pcDNA3.1载体中。该基因S中包含S蛋白基因(aa19_1383)以及T4噬菌示，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示)和表达G2b型的PEDVS三聚体重组蛋白的重组质粒后_20℃保存。[0054]ATGCACAGCTCTGCTTTACTGTGTTGTCTGGTGCTGCTGACAGGAGTTAGAGCCCTGCCTCAGGACGTGACAAGATGCTCCGCCAACACCAACTTCAGAAGATTCTTCAGCAAGTTCAACGTGCAGGCTCCTGCCGTGGTGGTGCTGGGCGGCTACCTGCCTATCGGCGAGAACCAGGGAGTCAACAGCACCTGGTACTGCGCCGGCCAACACCCTACCGCCAGCGGTGTGCACGGGATCTTCCTGAGCCACATCCGGGGCGGACACGGCTTTGAGATCGGCATCTCTCAAGAGCCTTTCGACCCTTCCGGCTACCAGCTGTATCTGCATAAGGCCACCAACGGCAACACCAACGCCACAGCCAGACTCAGAATTTGCCAGTTCCCCTCTATCAAGACCCTGGGCCCTACAGCCGATAACGACGTGACAACAGGCAGAAACTGCCTGTTCAACAAAGCTATCCCCGCTCACATGAGCGAGCACAGCGTGGTGGGCATCACATGGGACAACGATAGAGTCACAGTGTTCTCTGATAAGATCTACCACTTCTATTTCAAGAACGATTGGTCCCGGGTGGCCACTAAATGTTACAATTCTGGCGGCTGTGCCATGCAGTACGTGTACGAGCCCACCTACTACATGCTGAACGTGACGTCTGCCGGCGAGGACGGCATCTCTTACCAGCTGTGCACCGCCAACTGTATTGGCTACGCCGCCAACGTGTTCGCCACTGAACCTAACGGGCACATACCAGAAGGCTTTTCCTTCAACAACTGGTTCCTGCTGAGCAATGACAGCACGCTGGTCCACGGCAAGGTGGTCTCCAATCAACCTCTGCTGGTCAACTGCCTGCTGGCAATGCCTAAGATCTACGGTCTGGGACAGTTTTTCAGCTTCAATCAGACCATCGATGGCGTGTGTAACGGCGCCGCCGTACAAAGAGCCCCTGAGGCCCTCAGATTCAACATCAACGATACAAGCGTCATCCTGGCTGAGGGCTCGATCGTGCTTCACACAGCCCTGGGCACCAACCTGAGCTTCGTGTGCAGCAATAGTTCCGATCCTCACCTGGCTACATTTGCCATTCCTCTGGGCGCCACCCAGGTGCCCTACTACTGCTTTCTGAAGGTGGATACATACAACAGTACCGTGTATAAGTTCCTGGCCGTGCTGCCACCTACCGTGCGCGAAATCGTGATCACAAAGTACGGCGACGTGTATGTGAACGGTTTCGGCTATCTGCACCTGGGCCTGCTCGACGCCGTGACCATCAACTTCACCGGCCACGGCACAGATGACGACGTCTCCGGCTTCTGGACCATTGCGTCCACAAATTTCGTCGATGCCCTCATCGAGGTGCAGGGCACAGCTATACAGAGAATCCTGTACTGCGATGACCCAGTGTCCCAGCTGAAATGCTCCCAAGTGTCATTCGATCTGGATGACGGCTTCTACCCTATCAGCAGCAGGAACCTGTTAAGCCACGAGCAGCCTATCAGCTTCGTTACCCTACCTTCCTTCAACGACCACAGCTTCGTGAATATCACAGTCAGCGCCAGCTTCGGCGGCCACTCTGGCGCCAATCTGATCGCCAGCGATACCACAATCAACGGGCTGTCCAGCTTCTGTGTCGACACCCGACAGTTCACAATCTCCCTCTTTTACAACGTGACCAACTCTTACGGCTATGTATCCAAGAGCCAAGATAGCAATTGTCCTTTTACCCTGCAGTCTGTGAACGACTACCTCAGCTTCAGCAAATTCTGCGTGTCTACCAGTCTGCTGGCCAGCGCCTGCACAATCGACCTGTTTGGATACCCTGAGTTTGGATCTGGAGTGAAGTTCACCTCTCTGTACTTTCAATTCACCAAGGGCGAGCTGATCACCGGAACACCCAAGCCTCTGGAAGGGGTGACCGACGTGTCGTTTATGACCCTGGACGTGTGCACCAAGTACACCATCTACGGCTTCAAGGGCGAGGGAATCATCACCCTGACCAACTCCAGCATCTTGGCCGGCGTGTACTACACCAGCGACAGCGGCCAGCTGCTCGCATTCAAGAACGTGACCAGCGGCGCAGTGTACTCCGTGACCCCTTGCAGCTTCTCTGAACAGGCCGC8TTATGTCGACGACGACATCGTCGGCGTGATCAGCAGCTTAAGCAGCTCAACCTTTAATAGCACCCGGGAACTGCCCGGATTCTTCTACCACAGCAATGATGGCTCTAATTGCACCGAGCCAGTGCTGGTGTACAGCAACATCGGCGTGTGCAAGAGCGGCTCTATCGGATACGTGCCTAGCCAAAGCGGCCAGGTGAAGATCGCCCCTACTGTGACCGGAAACATCAGCATCCCCACTAACTTTTCCATGAGCATCAGAACCGAGTACCTGCAGCTGTACAACACCCCTGTGTCCGTGGACTGCGCTACATACGTGTGTAACGGTAACTCTCGGTGCAAACAGCTGCTGACGCAGTACACCGCCGCCTGCAAGACGATTGAGAGCGCTCTGCAGCTGAGCGCCCGGCTGGAGTCCGTGGAAGTGAATAGCATGCTGACCATCTCCGAAGAAGCACTGCAGCTGGCCACCATTAGCTCCTTCAATGGCGACGGCTACAACTTCACCAATGTGCTGGGCGTGAGCGTCTACGACCCAGCCAGCGGAAGAGTCGTCCAGAAGCGGAGCTTCATTGAGGATCTGCTTTTCAACAAGGTTGTGACCAACGGACTGGGAACCGTGGATGAGGACTACAAGAGATGCTCTAACGGGCGGAGCGTGGCCGACCTGGTGTGCGCCCAGTACTACAGCGGAGTGATGGTGCTGCCCGGAGTGGTGGACGCCGAAAAACTGCACATGTACAGCGCCAGCCTGATCGGCGGCATGGTCCTGGGCGGCTTTACCAGCGCCGCCGCCCTGCCTTTCTCCTATGCCGTCCAGGCCCGGCTGAACTACCTGGCCCTGCAGACCGACGTGCTGCAGCGGAATCAGCAGATGCTGGCCGAAAGCTTTAACTCCGCTATCGGAAACATTACCTCTGCGTTTGAGTCTGTGAAGGAAGCTATCAGCCAGACATCCAAAGGACTGAACACAGTTGCCCACGCCCTGACAAAGGTGCAAGAGGTGGTGAACAGCCAGGGCGCTGCCCTGACCCAGCTGACCGTGCAACTGCAGCACAACTTCCAGGCCATCAGCAGCTCCATCGACGATATCTACAGCAGACTGGACATCCTGTCTGCTGATGTGCAGGTGGACAGACTCATCACCGGAAGAC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