复方中药FL的质量标准研究

复方中药FL的质量标准研究摘要：目的：制定复方中药FL的质量标准，控制制剂的质量。方法：用薄层色谱法对制剂FL中的黄芪、黄芩和淫羊藿做定性鉴别，用高效液相色谱法系统建立复方中药FL中君药黄芪中有效成分黄芪甲苷的含量测定方法，并测定样品FL中黄芪甲苷的含量。结果：薄层色谱的斑点分离清楚，并且阴性对照不存在干扰；高效液相色谱方法精密度、重复性、稳定性、准确度良好，黄芪甲苷进样量在1.5552-7.7760μg与峰面积呈良好的线性关系，平均收率为97.7%，RSD1.0%。结论：本研究建立的办法准确简便、稳定可靠，可以用于复方中药FL的质量控制。 关键词：复方中药FL；薄层色谱法；高效液相色谱法；黄芪甲苷；质量标准StudyonQualityStandardofCompoundChineseMedicineFLAbstract:Objective:TosetthequalitystandardofCompoundChineseMedicineFLandcontrolthequalityofthepreparation.Methods:AstragaliRadix,RadixScutellariaeandHerbaEpimediiinFLwereidentifiedqualitativelybythinlayerchromatography.ThedeterminationmethodofastragalosideIVinFLwasestablishedbyhighperformanceliquidchromatographysystem,andthecontentofastragalosideIVwasdetermined.Results:Thespotsonthinlayerplatewereseparatedclearly,andnointerferencewasfoundundernegativecontrol.TheHPLCmethodwasprecise,repeatable,stableandaccurate.AstragalosideIVshowedagoodlinearityintherangeof1.5552-7.7760μg.Theaveragerecoverywas97.7%withaRSDof1.0%.Conclusion:Themethodestablishedinthisstudyisaccurate,simple,stableandreliable.ItcanbeappliedtothequalitycontrolofCompoundChineseMedicineFL.Keywords:CompoundChineseMedicineFL;Thinlayerchromatography;Highperformanceliquidchromatography;AstragalosideIV;Qualitystandard第二部分正文复方中药制剂FL主要由黄芪、黄芩、淫羊藿等组成，具备扶正祛邪，养肝清肺，清热解毒的效用，用于医治免疫低下引起的呼吸道疾病。其君药黄芪的主要有效成分为黄芪甲苷，它能增强机体免疫力、抗病毒等[1]；黄芩主要功用为消炎抗癌、镇静降压，主要有效成分以黄酮类化合物黄芩苷为主[2]；淫羊藿以黄酮类淫羊藿苷为主要成分，其功用为补肾壮阳、祛风除湿[3]。因而，制定复方中药FL中黄芩等的定性标准及黄芪甲苷的定量标准，对确保FL的临床疗效意义重大。为了更好地控制其质量，本研究用薄层色谱法（TLC），对制剂FL中的黄芪、黄芩、淫羊藿做定性鉴别，并用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)对FL中所含有的黄芪甲苷做含量的测定。此外，为了探讨该制剂在贮藏过程中环境对药物的稳定性影响，保证临床用药的质量可控，并为其保质期的确定提供依据，保障药物的安全性、有效性，本研究参照《中华人民共和国药典》2015年版第四部[4]关于原料药物与制剂稳定性试验指导原则及有关文献方法，对复方中药制剂FL进行初步稳定性考察试验研究。1仪器、试药1.1仪器聚酰胺薄膜；Agilent1260系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，装备G1311A四元泵、G1329B自动进样仪、G1316A柱温箱，Alltech3300蒸发光散射检测器，安捷伦液相色谱化学工作站）；SartoriusCPA225D型电子天平（赛多利斯科仪公司）；USC-502超声波清洗器（上海波龙电子设备有限公司）；DHG-9070A电热恒温干燥箱。1.2试药与材料样品FL（批号：20190825，20191028，20191029，20191030），黄芪（批号：120974-201612，供薄层鉴别用，中检所），黄芪甲苷对照品（批号为110781-201717，用于含量测定，含量以96.9%计，规格：约20mg，中检所），黄芩苷（批号为110715-201318，用于含量测定，含量以93.3%计，中检所），黄芩素（批号：111595-201607，用于含量测定，含量以98.5%计，中检所），黄芩对照药材（批号：120955-201810，用于薄层鉴别），淫羊藿苷（批号：110737-201516，用于含量测定，含量以94.2%计，中检所），硅胶G板（青岛海洋化工有限公司），乙腈用色谱纯，水为MILIQ水，别的试剂都是分析纯。2薄层色谱鉴别2.1黄芪的鉴别取[含量测定]黄芪项下的供试品溶液用来当供试品溶液[5]。另取适量的黄芪甲苷对照品，往里加入甲醇制备成每1mL中含有0.5mg的溶液，当作对照品溶液。按照薄层色谱法（通则0502）进行试验[4]，用毛细管取供试品溶液10μL、对照品溶液5μL，点在同一块硅胶G薄层板上面，展开剂是三氯甲烷-甲醇-水（15:7:3）的下层溶液，展开之后取出，等它晾干，接着用10%的硫酸乙醇溶液喷，于105℃加热到斑点颜色显示清楚为止。观察供试品色谱，发现它和对照品的色谱比较时，在相应地方呈现出相同颜色的斑点。见图1。123图1黄芪的TLC鉴别Fig.1TLCidentificationofAstragaliRadix1.黄芪甲苷对照品（AstragalosideIV）2.样品（sample）3.缺黄芪阴性对照（theblankofAstragaliRadix）实验对该方法的耐用性进行了试验，分别在低温（6℃）、低湿（25℃，20%）、高湿（25℃，75%）环境下，按照正文方法进行试验，结果斑点均能得到良好分离，样品与对照品对应良好，斑点很好地分离开了，显色清楚，并且阴性对照不存在干扰，说明此法耐用性良好。见图2-4。123123123图2图3图4图2黄芪的TLC鉴别（低温）Fig.2TLCidentificationofAstragaliRadix（lowtemperature）图3黄芪的TLC鉴别（低湿）Fig.3TLCidentificationofAstragaliRadix（lowhumidity）图4黄芪的TLC鉴别（高湿）Fig.4TLCidentificationofAstragaliRadix（highhumidity）1.黄芪甲苷对照品（AstragalosideIV）2.样品（sample）3.缺黄芪阴性对照（theblankofAstragaliRadix）2.2黄芩的鉴别取样品FL4g，加入乙酸乙酯-甲醇（9:1）溶液80mL，对它进行超声处理（功率200W，频率58KHZ）20分钟，滤过后把滤液减压回收至溶剂无，残渣加1mL甲醇使其溶解，取上清液做供试品溶液。另取黄芩对照药材0.3g，往里加入甲醇10mL，再超声20分钟（功率200W，频率58KHZ），当作对照药材溶液。再取适量黄芩苷的对照品、黄芩素的对照品以及汉黄芩素的对照品，加入甲醇制备成每1mL溶液中分别含有1mg、0.5mg、0.5mg，当作对照品溶液。参考薄层色谱法（通则0502）做试验[4]，吸取供试品溶液10μL、对照药材溶液10μL及对照品溶液各5μL，点在同一张聚酰胺薄膜上，展开剂是甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10:5:1:2），预饱和30分钟，展开后小心取出并晾干，然后喷以1%的三氯化铁乙醇溶液。经过实验，样品与对照品、对照药材对应得挺好，斑点分离得比较清楚，并且阴性对照没有干扰存在。见图5。12345678图5黄芩的TLC鉴别Fig.5TLCidentificationofRadixScutellariae1.黄芩苷（Baicalin）2.黄芩素（Baicalein）3.汉黄芩素（Wogonin）4.黄芩对照药材（RadixScutellariae）5、6.缺黄芩阴性对照（theblankofRadixScutellariae）7、8.样品（sample）实验对该方法耐用性做了试验，分别于低温（6℃）、低湿（25℃，20%）、高湿（25℃，75%）环境下，按照上述方法进行试验，结果斑点均能得到良好分离，样品与对照药材和对照品对应得挺好，斑点很好地分离开了，显色清楚，并且阴性对照不存在干扰，说明此法耐用性良好。见图6-8。123456123456图6图7123456图8图6黄芩的TLC鉴别（低温）Fig.6TLCidentificationofRadixScutellariae（lowtemperature）图7黄芩的TLC鉴别（低湿）Fig.7TLCidentificationofRadixScutellariae（lowhumidity）图8黄芩的TLC鉴别（高湿）Fig.8TLCidentificationofRadixScutellariae（highhumidity）1.黄芩苷（Baicalin）2.黄芩素（Baicalein）3.汉黄芩素（Wogonin）4.黄芩对照药材（RadixScutellariae）5.缺黄芩阴性对照（theblankofRadixScutellariae）6.样品（sample）2.3淫羊藿的鉴别本法系参考药典收载的淫羊藿的薄层色谱鉴别法[5]。取适量的淫羊藿苷对照品，往里加入甲醇制备成每1mL溶液含1mg，当作对照品溶液。参考薄层色谱法（通则0502）进行试验[4]，小心吸取供试品溶液20μL、对照品溶液5μL，点在同一块硅胶G薄层板上，展开剂用三氯甲烷-甲醇-水（15:7:3）的下层溶液，静待展开后取出并等它晾干，接着用1%的三氯化铁乙醇溶液喷。经试验，样品与对照品对应地较好，斑点很好地分离开了，显色清楚，并且阴性对照没有干扰。见图9。123图9淫羊藿的TLC鉴别Fig.9TLCidentificationofHerbaEpimedii1.淫羊藿苷（icariin）2.样品（sample）3.缺淫羊藿阴性对照（theblankofHerbaEpimedii）实验对该方法的耐用性进行了试验，分别在低温（6℃）、低湿（25℃，20%）、高湿（25℃，75%）环境下，按照上述方法进行试验，结果斑点均能得到良好分离，样品与对照品对应得不错，斑点很好地分离开了，显色清楚，并且阴性对照没有干扰存在，说明此法耐用性良好。见图10-12。123123123图10图11图12图10淫羊藿的TLC鉴别（低温）Fig.10TLCidentificationofHerbaEpimedii（lowtemperature）图11淫羊藿的TLC鉴别（低湿）Fig.11TLCidentificationofHerbaEpimedii（lowhumidity）图12淫羊藿的TLC鉴别（高湿）Fig.12TLCidentificationofHerbaEpimedii（highhumidity）1.淫羊藿苷（icariin）2.样品（sample）3.缺淫羊藿阴性对照（theblankofHerbaEpimedii）3黄芪甲苷的含量测定3.1检测器的选择黄芪甲苷分子式无共轭体系，紫外无吸收，故采取通用型检测器——蒸发光散射，能够测得无紫外吸收的那些有机物。3.2流动相的选择采取AgilentExtendC18色谱柱（250mm*4.6mm，5m）为色谱柱。检测时采用乙腈-水做流动相，研究观察不同流动相配比对测定的影响，从而对色谱条件进行优化。结果显示乙腈-水（32:68）系统的图谱，成分峰出峰时间适宜，峰型较好，故选择采用乙腈-水（32:68）系统进行测定。3.3色谱条件色谱柱：AgilentExtendC18色谱柱（250mm*4.6mm，5μm）；流动相使用乙腈-水（32比68）；检测条件：蒸发光散射检测仪器（漂移管的温度:75℃，氮气的流速：2.0L/min）；柱温：35℃；流速为每分钟1.0mL；进样量为20μL。色谱图见图13。11min0511min05101520256080100120140160180mVBmin0510152025mV6080100120140160180AFig.13HPLCchromatogramA-对照品色谱图（A：chromatogramofreferencesubstance）B-供试品色谱图（B：chromatogramofsample）1-黄芪甲苷（1：AstragalosideIV）3.4对照品溶液的制备精密称量黄芪甲苷对照品10.70mg，加入甲醇定容到20mL的量瓶中，将其制备成每1mL含0.5184mg的溶液，即得。3.5供试品溶液的制备3.5.1提取方法的比较准确称量样品FL（20190825）10g，称两份，再精密地往里加入75%甲醇200mL，要称定重量并记下数值，分别超声和回流处理45min，放置一会等它们冷却，再一次称定重量，补足失重，精密量取上清液150mL，减压回收至溶剂干燥，往残渣里加入75%甲醇5mL使其溶解，再加水45mL稀释，过D941大孔吸附树脂柱子（内径为1.5cm，柱高为15cm），150mL水用于洗脱，将上柱液和洗脱液收集，归并，降压回收直至溶剂干燥，往残渣里面加水10mL使溶解，水饱和正丁醇用于萃取，萃4次，每次40mL，归并正丁醇液后要用氨试液洗涤，洗2次，每次用量40mL，洗涤一定要充分，之后把氨试液倒入废液瓶中弃去，把正丁醇液蒸干，留下的残渣用甲醇溶成溶液，定容到5mL的量瓶中，摇匀，既得。结果见表1。表1提取方法比较Table1Comparisonofextractionmethods取样方法黄芪甲苷含量（mg/g）超声0.136回流0.130超声和回流的提取方法对黄芪甲苷提取效果接近，考虑操作简便可行，故挑选超声做供试品溶液制备的提取办法。3.5.2提取溶剂比较准确称量样品FL（20190825）10g，称两份，再分别往里面精密加入50%甲醇和75%甲醇各200mL，称定重量并记下数值，超声处理45min，放置一会等它们冷却，再一次称定重量，若失重便补足，精密量取上清液150mL，减压回收至溶剂干燥，往残渣中加入75%的甲醇5mL使其溶解，再加水45mL用于稀释，将稀释液过D941大孔吸附树脂柱子（内径为1.5cm，柱高为15cm），150mL水洗脱，要收集上柱液和洗脱液，归并，降压回收至溶剂干燥，向残渣中加水10mL使溶解，水饱和正丁醇用来萃取，萃4次，每次40mL，归并正丁醇液后用氨试液洗涤，洗2次，每次用量40mL，洗涤务必要充分，之后将氨试液倒入废液瓶中弃去，把正丁醇液蒸干，留下的残渣再加甲醇溶成溶液，定容到5mL的量瓶中，摇匀，即可得。结果见表2。表2提取溶剂比较Table2Comparisonofextractionsolvents取样溶剂黄芪甲苷含量（mg/g）50%甲醇0.13875%甲醇0.13650%的甲醇和75%的甲醇作为提取溶剂时，黄芪甲苷提取效率接近，75%甲醇为提取溶剂回收溶剂后残渣量较少，易于复溶，故选择75%甲醇为供试品溶液制备的提取溶剂。3.5.3溶剂量的比较精密称定样品（20190825）10g，称三份，分别往里精密加入75%的甲醇100mL、200mL和500mL，称定重量并记下数值，拿去超声45min，放置一会等它们冷却，称定重量，补足失重，精密量取上清液150mL，降压回收至溶剂干燥，往残渣里面加入75%的甲醇5mL使溶解，再加水45mL，稀释液过D941大孔吸附树脂柱子（内径是1.5cm，柱高是15cm），150mL水用于洗脱，将上柱液和洗脱液收集，归并，降压回收至溶剂干燥，向残渣里加水10mL使溶解，水饱和正丁醇用于萃取，萃4次，每次40mL，归并正丁醇液后用氨试液洗涤，洗2次，每次用量40mL，洗涤需充分，之后将氨试液倒入废液瓶中弃去，把正丁醇液蒸干，往残渣中加入甲醇溶城溶液，定容到5mL的量瓶中，摇匀，即可得。结果见表3。表3取样量比较Table3Comparisonofsamplingquantity溶剂量（mL）黄芪甲苷含量（mg/g）1000.1362000.1365000.139不同溶剂量对黄芪甲苷提取效率相当，考虑节约溶剂和保证提取完全，选择200mL作为供试品溶液制备的溶剂量。3.5.4提取时间比较准确称取样品FL（20190825）10g，称三份，再精密加入75%的甲醇200mL，称定重量并记下数值，分别进行超声30min、45min和60min处理，放置一旁等它们冷却，再一次称定重量，补足失重，精密量取上清液150mL，降压回收至溶剂干燥，往残渣里面加入75%的甲醇5mL使溶解，加水45mL，稀释液过D941大孔吸附树脂柱子（内径是1.5cm，柱高是15cm），150mL水用于洗脱，将上柱液和洗脱液收集，归并，降压回收至溶剂干燥，向残渣中倒入水10mL使其溶解，水饱和正丁醇用于萃取，萃4次，每次40mL，归并正丁醇液，氨试液用来洗涤，洗2次，每次用量40mL，洗涤一定要充分，之后将氨试液倒掉，把正丁醇液蒸干，留下的残渣往里加甲醇溶成溶液，再定容到5mL的量瓶中，摇匀，即可得。结果见表4。表4提取时间比较Table4Comparisonofextractiontime提取时间（min）黄芪甲苷含量（mg/g）300.139450.136600.139不同的提取时间对黄芪甲苷的提取效率接近，为了保证提取完全，故选择30min作为供试品溶液制备的提取时间。最终确定下来的供试品液制备办法是：准确称定样品FL10g，往里精密地加入75%的甲醇200mL，称定重量并记下数据，进行超声45min处理，放置一旁等其冷却，再一次称定重量，若补足便失重，精密量取上清液150mL，减压回收至溶剂干燥，向残渣中加入75%的甲醇5mL使其溶称溶液，再加水45mL，稀释液过D941大孔吸附树脂柱子（内径是1.5cm，柱高是15cm），150mL水用于洗脱，将上柱液和洗脱液收集，归并，降压回收至溶剂干燥，往残渣里面加水10mL使溶解，水饱和正丁醇用于萃取，萃4次，每次40mL，归并正丁醇液，氨试液用来洗涤，洗2次，每次40mL，洗涤一定要充分，之后将氨试液倒掉，把正丁醇液蒸干，留下的残渣中加甲醇溶成溶液，再定容到5mL的量瓶中，摇匀，即可得。3.6方法学考察3.6.1线性关系考察精密地量取黄芪甲苷对照品溶液（0.5184mg/mL）3、5、8、10、15μL，缓慢注入液相色谱仪，记录峰面积，将色谱峰面积的对数值设为纵坐标（Y），进样量的对数值设置成横坐标（X）做线性回归，回归方程的计算结果Y=1.687X+1.744，r=0.999，表明黄芪甲苷的进样量在1.5552~7.7760μg范围内的时候其线性关系良好，线性关系图见图14，表5。表5线性关系考察Table5Linearrelationtest对照品量（μg）1.55522.59204.14725.18407.7760lg（对照品）0.19180.41360.61780.71470.8908峰面积115.897278.929618.741894.0771725.285lg（峰面积）2.06412.44552.79152.95143.2436图14线性关系Fig.14Linearrelationship3.6.2精密度精密小心地吸取黄芪甲苷的对照品溶液（0.5184mg/mL）连续使其进样6次，结果黄芪甲苷峰面积的RSD(n=6)为1.0％，见表6，可见仪器进样精密度良好。表6精密度试验结果(n=6)Table6Precisiontestresults(n=6)进样次数123456平均RSD%峰面积595.10606.56612.25608.57604.86604.34605.281.03.6.3重复性精密小心地称取同一批样品FL（批号：20190825）6份，按着供试品溶液的制备办法制好，结果计算得到黄芪甲苷平均的含量为0.136mg/g，RSD(n=6)为2.3％，测定结果见表7，可以表明重复性良好。表7重复性试验结果(n=6)Table7Repeatabilitytestresults(n=6)编号123456平均RSD％黄芪甲苷（mg/g）0.1370.1370.1400.1310.1380.1350.1362.33.6.4溶液的稳定性精密细致地吸取对照品溶液以及同一份供试品溶液（批号：20190825），分别于0、2、4、8、12和18小时的时候进样，依法测试，要记录峰面积值，并计算RSD%。结果见表8，黄芪甲苷对照品的峰面积经计算得知RSD（n=6）为1.0%，供试品峰面积RSD(n=6)为2.1%。表明对照品液以及供试品液在18个小时内基本上是稳定的。表8稳定性试验结果(n=6)Table8Stabilitytestresults(n=6)时间（h）02481218平均峰面积RSD%对照品616.427605.846612.551599.329612.072605.774608.671.0供试品542.454550.092562.111575.385565.559563.661559.882.13.6.5准确度（以回收率表示）精密地称取样品FL（批号：20190825）6份，精确细致地往里加入黄芪甲苷对照品溶液适量，按着供试品制备办法将其制好，并依法测定，结果见表9，黄芪甲苷经计算得知其平均回收率是97.7％，RSD(n=6)为1.0％，符合要求。表9黄芪甲苷加样回收试验结果(n=6)Table9ResultsoftherecoveryofAstragalosideIV(n=6)取样量（g）原有量（mg）加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）5.060530.64760.51841.160498.9197.71.03.6.6样品测定按上述拟定方法对样品做测定，结果见下面的表10，可见4批样品的黄芪甲苷含量在0.099mg/g~0.207mg/g，故暂定样品中黄芪甲苷含量不得低于0.09mg/g。表10样品含量测定结果Table10DeterminationofSampleContent批号黄芪甲苷含量（mg/g）201908250.136201910280.099201910290.135201910310.2073.7稳定性考察将样品（20191028，20191029，20191031）放置在加速（40℃，湿度75%）条件下，于3个月末取样，按照中国药典一部、建立的含量测定方法和薄层鉴别方法，进行性状、水分、鉴别以及含量的测定。各指标均无显著变化，符合要求。将样品（20191028，20191029，20191031）放置常温（25℃，湿度75%）条件下，于1,2，3个月末分别取样，按照中国药典一部、建立的含量测定方法和薄层鉴别方法，进行性状、水分、鉴别以及含量的测定。各指标均无显著变化，符合要求。结果表明，样品FL在测定的时间内稳定。4讨论与总结本研究建立了复方中药FL的质量标准，为FL的质量控制提供了切实可行的分析方法。对制剂的初步稳定性进行了考察，为确定FL的有效期和进行质量评价提供了科学根据。方中黄芪的TLC鉴别，参考药典收载的黄芪的薄层色谱鉴别法，主要针对黄芪甲苷成分，用硅胶G板，展开剂取三氯甲烷-甲醇-水（15:7:3）的下层溶液，之后用10%硫酸乙醇溶液喷，于105℃加热至斑点出现，颜色显示清楚，结果色谱分离效果好。方中黄芩的TLC鉴别摸索，样品前处理研究发现样品过聚酰胺柱后60%ALC洗脱液在与对照品及对照药材相同位置上显相同颜色的斑点，但样品中黄芩苷位