甘蓝型油菜BnaRFC2基因敲除及突变体的鉴定

甘蓝型油菜BnaRFC2基因敲除及突变体的鉴定KNOCKOUTOFBNARFC2GENEANDIDENTIFICATIONOFMUTANTINBrassicanapusL.目录TOC\o"1-3"\h\u1前言 51.1油菜简介 51.2油菜的市场价值 51.3复制子C简介及复制子C研究现状 61.4CRISPR/Cas9基因组编辑技术原理及优势 71.5本研究的目的与意义 82实验材料 82.1供试材料 82.2主要的仪器 82.3主要的试剂 83实验方法 93.1CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建 93.2油菜下胚轴转化体系的构建 113.2.1培养基的配制 123.2.2操作方法 123.3阳性油菜苗的鉴定 134结果与分析 154.1油菜RFC2生物信息学分析 154.2CRISPR-CAS9靶标序列的确定及载体的构建 174.3油菜转化体系 错误!未定义书签。184.4T0代油菜转基因的鉴定 18195讨论 21参考文献： 2122致谢 23附录 2425甘蓝型油菜BnaRFC2基因敲除及突变体的鉴定摘要：复制因子C（replicationfactorC，RFC）是一种普遍存在于真核生物中的蛋白复合体，在DNA合成修复、细胞分裂及植物抗逆等方面发挥着重要的作用。RFC2是RFC复合物的亚基之一，其在植物中的作用暂时还未报道。本实验通过油菜下胚轴遗传转化法将pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2基因编辑载体转入甘蓝型油菜湘油15（XY-15）中，获得Bnarfc2的突变体。通过分析RFC2在不同品种甘蓝型油菜中的拷贝数量、CRISPR-CAS9在阳性植株中的编辑差异、以及T0代植株表型等方面，发现RFC2是一个非常保守的蛋白且甘蓝型油菜不同品种中的拷贝数不一致，存在功能冗余的情况；转基因植株表现为叶片在上有褶皱，叶片面积更小，植株矮小，T0代植株种子败育率高，果荚短小，种子数目减少等表型。关键词：RFC2;基因敲除；生长发育；甘蓝型油菜KNOCKOUTOFBNARFC2GENEANDIDENTIFICATIONOFMUTANTINRAPEAbstract:ReplicationfactorC,anubiquitousproteincomplexineukaryotes,playsanimportantroleinDNAsynthesisandrepair,celldivision,andplantstressresistance.RFC2isoneofthesubunitsofRFCcomplex,anditsroleinplantshasnotbeenreportedyet.Inthisstudy,thepYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2geneeditingvectorwastransformedintoBrassicanapusXiangyou15(XY-15)bygenetictransformationofrapehypocotyltoobtainaBnarfc2mutant..ByanalyzingthecopynumberofRFC2indifferentvarietiesofBrassicanapus,theeditingdifferencesofCRISPR-CAS9inpositiveplants,andthephenotypeofT0generationplants,RFC2wasfoundtobeaveryconservedproteinandamongdifferentvarietiesofBrassicanapus,thenumberofcopiesisinconsistent,andthereisasituationoffunctionalredundancy;;Thetransgenicplantsshowedfoldsontheleaves,smallerleafarea,shortplants,highseedabortionrateofT0generationplants,shortpods,andreducednumberofseeds.Keywords:AtRFC2;geneknockout;growthanddevelopment;BrassicanapusL.1前言1.1油菜简介油菜（Brassicanapus）为十字花科（BrassicaceaeBurnett）芸薹属（Brassica）的一年生草本植物，性喜冷凉或温暖湿润气候，又名芸薹、芸薹、芜菁等。我国油菜主要栽种品种有白菜型油菜（BrassicarapacampetrisL.）、甘蓝型油菜（BrassicanapusL.）和芥菜型油菜（BrassicajunceaL.），其中甘蓝型油菜籽粒产量较高且含油量丰富被市场主推，是该研究的主要材料之一。甘蓝型油菜是由白菜（Brassica

pekinensis，n=10）和甘蓝（Brassicaoleracea，n=9）通过自然种间杂交后双二倍体进化而来的一种复合物种（n=19），因其株型与叶型和甘蓝极为相似，故得此名。甘蓝型油菜起源于欧洲地中海沿岸，中国于20世纪30年代引进，目前主要分布于我国长江中下游流域。乾隆曾写诗“黄萼裳裳绿叶稠，千村欣卜榨新油。爱他生计资民用，不是闲花野草流”夸赞油菜在生活方面的重要作用。油菜作为油料作物和蔬菜，不仅历史悠久，而且较为普遍，在《四时纂要》、《王祯农书》、《农桑衣食撮要》等均有记载[1]。1.2油菜的市场价值油菜的全株、油菜薹、油菜花、油菜籽和油菜秸秆均具有不同的妙用。油菜是我国重要的四大油料作物之一，其种子含油量达35-50％，具有较高的经济价值，目前我国油菜的种植面积和产量均约占世界的1/4，种植面积在710万hm2以上，总产量在1300万以上。油菜薹性凉味甘，富含维生素C、胡萝卜素及矿物质，具有通便润肠、活血化瘀、解毒消肿等功效；作为蔬菜炒熟后口感脆嫩，营养丰富，绿色健康。油菜杆富含丰富的膳食纤维和蛋白质，主要可用于牲畜饲料，发展绿肥、能源等。同时油菜花姿容自然、朴素，拥有自己的独特风格-柔中可亲，美中可近，有诗云：“油菜花开满地黄，丛间蝶舞蜜蜂忙；清风吹拂金波涌，飘溢醉人浓郁香”，且随着育种人员的不断努力，选育出了许多颜色各异的油菜品种，应用于旅游观光产业后，赢得了人们的普遍喜爱。近年来随着第三产业的兴起，其开发与利用能快速有效地有机结合一、二、三产业，是乡村发展生态农业和旅游的理想作物[1-2]。1.3复制子C简介及复制子C研究现状复制因子C（replicationfactorC，RFC）由五个亚基组成的蛋白复合物，即一个大亚基（RFC1/140kD）和四个小亚基（RFC2/37kD，RFC3/36kD，RFC4/40kD，RFC5/38kD），是普遍存在于真核生物复制叉上的结构特异性蛋白。RFC最早是通过纯化人类宫颈癌中Hela细胞的提取物得到的，并发现该因子是猿病毒SV40DNA在体外复制不可或缺的。随后科研人员又相继以小鼠[3]，酵母[4]，人类细胞[5]，果蝇[6]等为研究材料，确定了小鼠、酵母、人类细胞和果蝇中的RFC的各亚基及其编码基因，除序列高度相似以外，都含有ATP/GTP结合蛋白特性的保守区。随着实验研究深入，发现RFC不仅在DNA复制，DNA多聚酶转换过程中起着重要作用，而且在细胞检查点控制、DNA修复及细胞分裂增殖和抗逆性等方面也具有重要的生物学功能[7]。2005年Kim等[8]发现，裂变酵母中的RFC1的末端结构域突变会导致细胞内染色体复制异常，证明该结构域是维持其功能必不可少的。崔金全等[9]通过基因表达谱芯片检测发现，RFC在葡萄胎和绒毛膜癌中高表达，RFC与DNA的复制和修复及细胞周期信号检查点的功能相关联，且与PCNA共同参与细胞DNA损伤后的切除修复和错配修复机制。虽然人类和动物中关于RFC的功能研究进展很快，但植物中有关RFC及其各亚基的研究却因起步较晚、研究的关注点不同等多方面的原因，鲜有报道。2003年Furukawas[10]通过同系物克隆从水稻中成功分离OsRFC五个基因，但仅介绍了其表达特性。2007年夏石头等[11]以拟南芥为载体，研究了AtRFC1的3个T-DNA插入突变株系rfc1-1、rfc1-2和rfc1-3，并发现T-DNA在AtRFC1外显子中插入突变将引起种子胚胎发育异常从而导致种子败育。QianLiu等[12]传通过EMS诱变筛选鉴定了ros1-1的抑制子，ros1-1是SILENCING1OfREPRESSOR的突变体（ROS1；编码DNA脱甲基蛋白），通对ros1和rfc1突变体进行试验发现ros1突变体显示端粒长度增加，但是rfc1突变体显示端粒长度减少和端粒酶表达降低，结果表明RFC1有助于介导拟南芥中的基因组稳定性和TGS。ShitouXia等[13]通过EMS诱变筛选到一个对SA诱导高度敏感的点突变体，rfc3-1。rfc3-1突变导致RFC八个保守结构域中的功能域III中的非极性脂族氨基酸（Gly-84）被带负电荷的氨基酸（Asp）取代，其表现出增强的致病相关（Pathogenesis-related，PR）基因诱导能力，并且增强对丁香假单胞菌的侵染的抗性，以及对rfc3-1的分子生物学及生物化学分析表明RFC3负调控PR基因的表达和系统获得性抗性（systematicacquiredresistance,SAR）。之后刘颖，崔看等[14]以拟南芥突变体rfc3-1为材料，研究了拟南芥复制因子C亚基3（AtRFC3）基因突变对拟南芥植株开花和种子发育的影响，结果表明：RFC3基因突变导致rfc3-1的开花时间比野生型植株提前1周，呈小花表型，且导致种子发育异常。将野生型AtRFC3基因转化到突变体rfc3-1后，恢复了突变株的野生型表型，证实AtRFC3基因在拟南芥花器官和种子发育中起重要作用。JieQian等[15]研究了AtRFC4的功能，发现AtRFC4的功能丧失导致了早期的孢子体发育停滞，这种致死性早于拉长的合子阶段就开始了，所有有缺陷的胚胎都停滞在2至4个细胞期的胚胎阶段，胚乳拥有6至8个自由核。此外还观察到rfc4-1/–FIS2;DD45;ABI3pro::AtRFC4幼苗中晚期S期和M期细胞的比例降低，说明不完全的DNA复制触发了根尖分生组织细胞的细胞周期停滞，因此，AtRFC4是DNA复制的关键基因。又有研究发现[16-18]，OsPCNA可以与所有OsRFC相互作用，而域间连接环（IDCL）域和PCNA的C端对于相互作用RFC亚基必不可少，表明拟南芥和水稻PCNA在与其他PCNA单体相互作用的序列，结构和模式上高度保守。虽然近年来，在水稻和模式植物拟南芥的RFC及各亚基的功能方面已经取得一些进展，但暂时还未报道在植物中间RFC2的突变体，因此在油菜利用CRISPR技术研究RFC2在油菜中的重要意义。1.4CRISPR/Cas9基因组编辑技术原理及优势CRISPR/Cas9（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatednuclease9，Cas9）即规律成簇的间隔短回文重复，是一类广泛存在于细菌及古细菌中的适应性免疫系统。在自然界中共发现三种来自不同细菌的CRISPR/Cas9系统，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统研究的最为透彻，经过深入研究开发将其成功应用于基因编辑技术。CRISPR/Cas9的原理是crRNA（CRISPRRNA）通过碱基配对与tracrRNA（transactivatingCRISPRRNA）结合形成tracrRNA/crRNA双元复合体，内切酶Cas9蛋白在此复合体引导下与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。通过人工设计个性化改造这两种RNA，可以形成单个具有引导作用的sgRNA（single-guideRNA），决定与靶基因结合的特异性，其引导Cas9核酸酶对DNA进行定点切割。DNA双链发生断裂后，其在修复的过程中可实现基因组特定位点的DNA插入、缺失、碱基突变或修饰。该技术可以广泛应用于各类定向基因组编辑，且具有较高活性，攻克传统遗传操作技术难题，只需针对靶序列设计特异的导向RNA就可以探寻相应基因功能与基因组之间的相互关系。具有特异性高，脱靶率低，廉价简便等优势。但值得注意的是，CRISPR/Cas9在靶前无三核苷酸NGG序列（protospaceradjacentmotif，PAM）时无法进行切割[19-22]。1.5本研究的目的与意义由于RFC不仅在DNA复制，DNA多聚酶转换过程中起着重要作用，而且在细胞检查点控制、DNA修复及细胞分裂增殖和抗逆性等方面也具有重要的生物学功能。解析RFC作为复合物及其各亚基在植物中的具体调控作用对植物种植方面具有重要意义。随着研究的不断深入，植物中RFC及各亚基的研究在水稻及拟南芥中都已取得一些进展，其生物学功能以及对植物生长发育调控方面也逐渐揭开面纱。但目前暂时还未报道在植物中间RFC2的突变体，本研究在实验室已有的研究基础上，采用下胚轴转化的方法，构建pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2载体通过农杆菌介导转化到甘蓝型油菜湘油15号（XY-15）中，利用不同浓度的潮霉素筛选愈伤组织，以获得高效的潮霉素筛选体系。利用CTAB法提取组培植株的DNA，使用普通PCR方法及巢式PCR方法获得目的基因序列，并连接到T载体上进行测序，将测序结果与原XY-15基因序列进行对比，并选取有基因编辑的T0代植株，同时对有突变的Bnarfc2植株进行生长发育的初步观察。通过该研究解析RFC复合物的另一个小亚基RFC2对油菜生长发育的调控作用，对进一步丰富植物基因功能组学知识，最终完整了解油菜的生物学特性以及为主要农作物建立相关知识研究参考体系，进一步认识我国重要油料作物油菜中RFC复合物复杂生物学特性具有重要意义。2实验材料2.1供试材料湘油15号，供试质粒为pYLCRISPR/Cas9-MH(Kan+)和AtU6-29-CRISPR/gRNAvectors(Amp+)（由华中农业大学刘耀光院士提供），大肠杆菌菌株为DH10B，农杆菌菌株为GV3101。2.2主要的仪器超净工作台、光照培养箱、ABIPCR仪、Nanodrop2000微量紫外分光光度计、GeneGenius全自动凝胶成像仪、电击仪，Eppendorf低温离心机、迷你离心机、涡旋仪、制冰机、电泳仪、EPS-300核酸专用电泳仪、冰箱、超低温冰箱、恒温水浴锅、高压灭菌锅、研钵、电子天平、便携式pH计等。2.3主要的试剂潮霉素（hygromycin）、限制性内切酶购于Thermofisher公司；T4连接酶购于invitrogen公司；卡那霉素，氨苄青霉素，庆大霉素，利福平等抗生素均购于生工生物工程有限公司；MS粉购于青岛海博生物，胰蛋白胨，酵母提取物等购于OXOID公司；蔗糖、无机盐（氯化钠等）和有机试剂（异丙醇，氯仿，无水乙醇等）等均购于国药集团；质粒提取试剂盒、切胶回收试剂盒和PCR产物回收试剂盒购于天根公司。3实验方法3.1CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建=1\*GB2⑴根据TAIR网站上的AtRFC2的蛋白序列，在油菜数据库s.fr/brassicanapus上BLAST相对应的BnaRFC2基因序列，并对比分析找到可供使用的目标序列，设计特异性的靶标序列。表1BnaRFC2基因靶标序列Table1targetsequenceofBnaRFC2gene基因名称靶标序列BnaRFC2Target1CTTGAACCACGACCATGAGACGG=2\*GB2⑵用BsaI内切酶分别酶切pYLCRISPR/Cas9-MH和pYLgRNA-AtU3d质粒，酶切体系：5μl10xbuffer，1μlBsaI，2μg质粒，加ddH2O补充至50μl，37℃酶切30min，70℃5min失活后，pYLCRISPR/Cas9-MH凝胶电泳检查酶切结果并切胶回收酶切产物，pYLgRNA-AtU3d质粒酶切混合物-20℃保存备用。=3\*GB2⑶根据pYLgRNA-AtU3d质粒骨架及靶标序列设计接头引物，将设计的引物用0.5xTE(pH8.0)溶解成100μM母液，取1μl加入到98μl0.5xTE混合稀释到1μM。约90℃30S，移至室温冷却完成退火。将准备好的引物接头与酶切的pYLgRNA-AtU3d的载体进行连接：2μl5xT4DNAligasebuffer,12ng酶切好的pYLgRNA-AtU3d载体，1μl引物接头（最终浓度0.1μM），加ddH2O补充至10μl，室温（20-25℃）连接20min表2BnaRFC2基因接头引物Table2primersequenceofBnaRFC2gene基因名称接头引物BnaRFC2BnaRFC2F1:5’-gtcaCTTGAACCACGACCATGAGA-3’BnaRFC2R1:5’-aaacTCTCATGGTCGTGGTTCAAG-3’=4\*GB2⑷采用两轮巢式PCR扩增特异的gDNA表达盒：第一轮扩增：通用引物：U-F:5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3;gRNA-R:5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3。反应体系及PCR程序为：上一步连接产物2ulU-F/gRNA-R4ul（最终浓度0.1μM）高保真PCR酶0.3ul2.5mMdNTP2ul5Xbufer4ulddH2Oupto20ul98℃30s;10循环：98℃10s，60℃15s，72℃20s;22循环：98℃10s，60℃15s，72℃30s第二轮PCR：通用引物：Uctcg-B1’:TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGGgRcggt-BL:AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC反应体系：第一轮PCR产物1μl用H2O稀释20倍，取1μl为模板，引物4ul(最终浓度0.1μM)，5xbuffer4ul，高保真PCR酶0.3ul，2.5mMdNTP2ul，加ddH2O补充至20μl。PCR程序：22-25循环98℃30s，98℃10S60℃15s，68℃20s。取2ul凝胶电泳检测PCR产物大小是否一致，然后用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，并检测产物浓度。=5\*GB2⑸混合产物用BsaI内切酶酶切，酶切体系为：5μl10xbuffer，2μlBsaI，800ng产物，加ddH2O补充至50μl，37℃酶切30min，73℃2min。用PCR产物纯化kit纯化，并检测浓度。=6\*GB2⑹将酶切好的pYLCRISPR/Cas9-MH载体骨架与上一步的酶切好的sgRNA盒按照载体：插入片段摩尔比=1:4-8加入EP管中进行连接反应：10ul连接体系：T4ligase1ul，5xbuffer2ul，pYLCRISPR/Cas9-MH（digest）1ul，sgRNA盒xul，ddH2Oupto10ul，室温（22-25℃）过夜连接。=7\*GB2⑺热击转化DH5α感受态：①取50ul冰浴融化的Trans1-T1PhaseResistantChemicallyCompetentCell，加入连接产物混合液5ul，轻轻混匀后冰浴30min。②42℃热激30s，然后快速转移到冰上，冰浴2min，期间不要晃动离心管。③向每个离心管中加入500ulLB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm培养1小时，使其复苏。④吸取上述菌液涂布在含卡那霉素的LB固体板上，涂布均匀，待菌液吸收干后，放在37℃培养箱中倒置过夜培养。=8\*GB2⑻阳性菌检：挑取生长12小时的E.coil单菌落约24个，挑至含有4ml50mg/L的LB(Kan+)液体培养基的玻璃试管中，37℃培养12小时后，采用菌液PCR的方式进行鉴定。鉴定引物为：Uctcg-B1’+BnaRFC2R1。PCR反应体系（总体系20ul）：菌液1ul10xbuffer2ulTagenzyme0.3ul2.5mMdNTP1.6ulF+Rprimer(20uM)0.2ul+0.2ulddH2OUpto20ulPCR反应程序Lid=105℃T=94℃2minT=94℃30secT=56℃30sec40cycleT=68℃1kb/minT=68℃5min凝胶电泳检测是否含有目的条带。=9\*GB2⑼质粒的提取与农杆菌GV3101的电转：质粒提取：选取含有目的片段的菌液进行质粒DNA的提取，参照天根质粒提取试剂盒的方法，提取质粒DNA后，Nanodrop检测质粒DNA浓度，0D260/280为1.8-2.0之间。农杆菌电转：①先将电击杯，质粒DNA置于冰上预冷至少5min，将GV3101农杆菌感受态置于冰上。②将1ul质粒DNA加入到刚融化的40ul农杆菌感受态中，轻甩混匀后加入到预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使其分布均匀，无气泡，使用擦镜纸擦拭电击杯外壁，使其无水珠。③将电击杯放入电击仪反应槽内，1.5KV电击5msec，立即加入800ulLB液体培养基，轻轻吹吸溶液，使其均匀混合，然后将溶液吸入玻璃试管中28℃，200rpm培养1小时。④吸取上述菌液涂布在含卡那霉素，利福平的LB固体板上，涂布均匀，待菌液吸收干后，放在28℃培养箱中倒置过夜培养。⑤挑选阳性菌落于含有4ml的卡那霉素，利福平的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养24小时。⑥将菌液与50%的灭菌甘油1：1加入1.5ml的EP管中，混匀后保存于-80℃冰箱备用。3.2油菜下胚轴转化体系的构建3.2.1培养基的配制（1）LB培养基(液/固体)：10g/L胰蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/LNaCl+50mg/LRif+50mg/LGen+50mg/LKan（pH7.0）（固体培养基加入15g/L琼脂）（2）种子预培养基M0：1/2MS+10g/L蔗糖+8g/L琼脂（pH5.8-6.0）（3）农杆菌重悬液DM：MS+30g/L蔗糖+100mM乙酰丁香酮（AS）(灭菌后加)（pH5.8-6.0）（4）共培养培养基M1：MS+30g/L蔗糖+18g/L甘露醇+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+100mMAS+3g/LPhytagel（pH5.8-6.0）；（5）筛选培养基M2：MS+30g/L蔗糖+18g/L甘露醇+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+3g/LPhytagel+6mg/LHyg+200mg/LCab+200mg/LCef（pH5.8-6.0）；（6）再生培养基M3：MS+10g/L葡萄糖+0.25g/木糖+0.6g/L吗啉乙磺酸+2mg/LZeatin+0.1mg/LIAA+3g/LPhytagel+6mg/LHyg+200mg/LCab+200mg/LCef（pH5.8-6.0）；（7）生根培养基M4：1/2MS+10g/Lsucrose+3g/LPhytagel（pH5.8-6.0）；以上培养基均于121℃，0.1MPa高温高压灭菌20min后使用。3.2.2操作方法挑选150粒左右籽粒饱满，发育优良的甘蓝型油菜XY-15种子，倒入50mLBD管中，再加入配制好的种子消毒液（15%NaClO，0.1%Tween-20）消毒8min，期间间歇漩涡混匀，倒去消毒废液，然后加入70%的酒精冲洗种子1分钟后，倒去酒精废液，用灭菌水涡旋冲洗种子5遍，无菌水浸泡种子1小时；倒去废液，播种于M0培养基(25~30颗/瓶)，在4℃冰箱中春化3天，22-24℃黑暗培养6天。准备菌液：=1\*GB3①小量摇菌：在含有（卡那霉素，利福平，庆大霉素）的抗性平板上划线活化农杆菌，48小时后，挑选阳性菌落PCR检测，检测完后，用枪头挑选2-3个菌落进行于4ml含有上述3个抗性的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养48小时；=2\*GB3②扩大培养：以1：1000的比例扩大培养到100ml含有（卡那霉素，利福平，庆大霉素）的抗性的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养12小时后，菌液浓度（OD600≈0.6）5000rpm离心10min，收集菌体。=3\*GB3③用40-50ml的DM培养基重悬菌体，重悬液浓度（OD600≈0.4），将菌体重悬液继续放入28℃培养箱内保温，待外植体制备完成后使用。将黑暗处理的下胚轴切去根和靠近子叶约1cm左右，整齐放入有5mlDM培养基的无菌平皿中，浸润幼苗，用无菌镊子和解剖刀将下胚轴平切成长度约为1.0cm的小段，将准备好的菌体重悬液倒入平皿内，浸染下胚轴30min，同时每隔3分钟轻轻摇晃一次，促使菌液与外植体充分接触。浸染结束后，将外植体转移至放有无菌吸水纸的培养皿中，吸去残留在外植体上的菌液，并立即转入M1农杆菌共培养培养基中，在24℃，黑暗条件下培养48小时。共培养后，用镊子将外植体转移至M2培养基上，24℃，16/8h光照培养三周，视外植体生长情况每周更换一次新的培养基。三周后，将外植体转入M3培养基中，24℃，16/8h光照培养，每2周继代一次，直至出现分化芽，长出足够叶片。切取已成型的分化苗，放入M4培养基中，24℃，16/8h光照培养至生根后，即可移入装有营养土的小花砵中进行炼苗生长。3.3阳性油菜苗的鉴定=1\*GB2⑴取适量油菜叶子，按照（CTAB）法提取DNA用剪刀剪取油菜叶片于2ml圆底塑料离心管中，按有小到大的顺序标记好材料，在离心管中加入干净的玻璃珠，然后将离心管放在液氮中冷冻，使用组织破碎仪破碎组织后，按下述步骤提取DNA:①用1000ul的移液枪往2ml的离心管中按顺序悬空加入500ulCTAB缓冲液，混匀后，再将离心管放入金属恒温加热器中65℃加热5min。②在每个离心管中依次加入等体积的（500ul）氯仿：异戊醇（Chlorlform:Isoamylalcohol(24:1)）溶液，漩涡震荡仪剧烈震荡混匀两次，13000rpm离心5min。③小心的将上清液转入预加有0.7V体积100%异丙醇的1.5mlEP管中，上下颠倒混匀数次后，室温放置5min。④将上述液体13000rpm离心6min，使DNA沉淀（此时EP管底部应有白色沉淀），倒掉上清液，并将EP管倒置在吸水纸上以去掉残余溶液。⑤加入500ul80%乙醇于上一步EP管中，上下颠倒以洗涤DNA，去除残余物质，13000rpm离心6min后，小心去除上清液，以防DNA沉淀倒出。⑥干燥DNA沉淀，待沉淀透明后，加入50ulTE(pH8.0)缓冲液溶解DNA，然后70℃水浴加热15min，使DNase变性失活，然后将DNA放置于-80℃冰箱中待用。=2\*GB2⑵PCR鉴定质粒是否转入植株中采用载体通用引物SP1:GCGCGGTGTCATCTATGTTACT和SP2:CCCGACATAGATGCAATAACTTCG鉴定CRISPR质粒是否转入再生植株中，PCR反应总体积20ul，反应程序和体系如下：PCR反应体系（总体系20ul）：DNA1ul10xbuffer2ulTagenzyme0.3ul2.5mMdNTP1.6ulF+Rprimer(20uM)0.2+0.2ulddH2OUpto20ulPCR反应程序Lid=105℃T=94℃2minT=94℃30secT=56℃30sec40cycleT=68℃1kb/minT=68℃5min凝胶电泳检测是否含有目的条带。=3\*GB2⑶转基因植株突变植株的测序验证：A：根据目的基因序列，设计特异性引物利用高保真酶扩增含有Target序列的区域，1%的凝胶电泳检测目的条带的大小是否符合预期。第一轮扩增：采用如下表格的1st引物，PCR反应总体积20ul，反应程序和体系如下：DNA1ul5xbuffer4ulphusionenzyme0.3ul2.5mMdNTP1.6ulF+Rprimer(20uM)0.2+0.2ulddH2OUpto20ulPCR反应程序Lid=105℃T=98℃2minT=98℃30secT=56℃30sec40cycleT=72℃1kb/30sT=72℃5min凝胶电泳检测是否含有目的条带。第二轮：采用如下表格的2nd引物，PCR反应总体积50ul，反应程序和体系如下：第一轮PCR产物0.5ul5xbuffer10ulphusionenzyme1ul2.5mMdNTP4ulF+Rprimer(20uM)1ul+1ulddH2OUpto50ulPCR反应程序Lid=105℃T=98℃2minT=98℃30secT=56℃30sec40cycleT=72℃1kb/30sT=72℃5min凝胶电泳检测目的条带大小，切胶回收并检测浓度。1stPCRBnaA09g10830DBnaRFC2A09T-FCGATTCGAACAGAGAAACAAGBnaRFC2A09T-RCAGTTAAGTATGGACATTCGGBnaCnng14850DBnaRFC2CnnT-FCACGTGATTGATGTCTGAATTGBnaRFC2CnnT-RCCTTAATCATAACCACCATCC2ndPCRBnaA09g10830DBnaRFC2A09T-FCGATTCGAACAGAGAAACAAGBnaRFC2A09checkT-RGGAAAGAAAAAGTGGCAAGAGBnaCnng14850DBnaRFC2CnncheckT-FGTCATTCTTGATGAAGCTGACBnaRFC2CnnT-RCCTTAATCATAACCACCATCC4结果与分析4.1油菜RFC2生物信息学分析使用拟南芥TAIR数据库(/)中AtRFC2基因(AT5G220010)的蛋白序列分别在芸薹属数据库(/)，甘蓝数据库(/bolbase/)和甘蓝型油菜数据库（s.fr/brassicanapus/）调取同源基因（表3）。RFC2蛋白质同源性分析和亲缘性分析结果如下（图1，图2）总体来看，结果在白菜型油菜和甘蓝中各有一个同源基因分别为BraRFC2(Bra027624)和BolRFC2(Bol029692)，甘蓝型油菜中有三个拷贝，分别命名为BnaRFC2-30D(BnaA09g10830D、BnaRFC2-40D(BnaC04g20240D)和BnaRFC2-50D(BnaCnng14850D)。从蛋白质同源性上来看，各基因之间的同源性都较高，说明RFC2一个非常保守的蛋白。从亲缘关系上来看，BnaA09g10830D、BnaC04g20240D和Bra027624、Bol029692亲缘关系非常近，而对于BnaC04g20240D来说亲缘关系较远。考虑到在白菜型油菜和甘蓝各只有一个拷贝，而甘蓝型油菜中有三个拷贝，BnaRFC2基因可能是在染色体中发生了复制。表3芸薹属中AtRFC2同源基因Table1HomologousgeneofATRFC2inbrassicaRFC2DNA（bp）Protein(aa)AT1G63160.12081333Bra0276241640334Bol0296921005334BnaA09g10830D1924335BnaC04g20240D1299279BnaCnng14850D1921335图1蛋白质序列同源性比对结果图2亲缘关系分析结果Fig1ProteinsequencehomologyalignmentresultsFig2Kinshipanalysisresults为了确定湘油15(XY15)中RFC2基因的拷贝数以便设计精确的靶标序列，根据数据库上获得的基因序列，分别在每个基因拷贝上设计了1对引物（表4），同时以甘蓝型油菜WEASTAR，中双11（ZS11）和中油821（ZY821）作为对照进行PCR扩增。从PCR鉴定结果来看，在WEASTAR油菜中，存在RFC2基因的3个拷贝，与甘蓝型油菜数据库上的数据一致；中双11（ZS11），中油821（ZY821）中只含有BnaC04g20240D和BnaCnng14850D两个拷贝；而在湘油15中，只含有BnaA09g10830D和BnaCnng14850D两个拷贝的RFC2基因，通过构建T载体对湘油15中的BnaA09g10830D和BnaCnng14850D序列进行进一步确认，发现其与数据库中基因序列一致。说明RFC2在油菜不同品种中的拷贝数不一致，存在功能冗余的情况。表4湘油15中RFC2引物序列Table4RFC2primersequenceinBrassicanapusL.Xiangyou15基因序号引物名称引物序列BnaA09g10830DBnaRFC2A09T-FCGATTCGAACAGAGAAACAAGBnaRFC2A09T-RCAGTTAAGTATGGACATTCGGBnaCnng14850DBnaRFC2CnnT-FCACGTGATTGATGTCTGAATTGBnaRFC2CnnT-RCCTTAATCATAACCACCATCCBnaC04g20240DBnaRFC2C04F-ATGATGTGCTGTTTGTTTGATATGBnaRFC2C04T-RACATACAAACGAAGCCACCG图3.不同甘蓝型油菜品种中RFC2基因的拷贝数差异Fig3DifferencesincopynumberofRFC2geneindifferentBrassicanapusvarieties4.2CRISPR-CAS9靶标序列的确定及载体的构建通过DNAMAN软件的对比分析和CRISPR-CAS9系统的要求，设计了序列CTTGAACCACGACCATGAGA作为靶标位点，位于BnaA09g10830D和BnaCnng14850D第4个外显子上。根据试验方法3.1所述，由于导入到双子叶细胞的PUbi启动子的表达水平高于P35S，因此采用玉米泛素基因启动子Pubi驱动Cas9表达的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒，和AtU3/6启动子启动sgRNA表达，构建pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2载体。载体构建成功后用Sgs1限制性内切酶酶切验证质粒构建成功同时测序验证目的序列导入正确（图4）。4.3油菜转化体系下胚轴农杆菌侵染甘蓝型油菜转化主要步骤如下（图5）：首先将消毒后的种子播种于M0培养基(25~30颗/瓶)，在4℃冰箱中春化3天，22-24℃黑暗培养7天，获得幼苗；然后将下胚轴切去根和靠近子叶约1cm左右,下胚轴平切成长度约为1.0cm的小段，菌液侵染30分钟后,转入M1农杆菌共培养培养基中，在24℃，黑暗条件下培养48小时；共培养后，再用镊子将外植体转移至M2培养基上，24℃，16/8h光照培养三周，视外植体生长情况每周更换一次新的培养基。三周后，将外植体转入M3培养基中，24℃，16/8h光照培养，每2周继代一次，直至出现分化芽，长出足够叶片。切取已成型的分化苗，放入M4培养基中，24℃，16/8h光照培养至生根后，即可移入装有营养土的小花砵中进行炼苗生长。该过程步骤虽然较为简单，但在处理过程需要极为谨慎，避免应操作不当，对其造成污染。A：pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2载体的Sgs1酶切鉴定(1：sgs1单酶切，2：未酶切的质粒)；B：pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2质粒SgRNA表达盒的测序鉴定；MARK为DL2000；图4.pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2载体的构建Fig4ConstructionofpYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2vectorAA:避光生长7天的XY-15植株；B：0.5~1cm的下胚轴与农杆菌共培养时期；C：愈伤组织的诱导时期；D：芽的分化时期；E:生根；F:移栽。图5农杆菌转化油菜下胚轴各个时期4.4T0代油菜转基因的鉴定经潮霉素筛选后，获得的15株T0代BnaRFC2植株,以SP1和SP2为引物,PCR鉴定发现有9株苗中有pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3d-RFC2质粒的转入(附录1）。由于油菜是异源四倍体，且RFC属于保守的基因家族，亚基之间序列相似度高，普通PCR不利于获得高质量纯净的基因序列直接用于测序，因此分别在BnaA09g10830D和BnaCnng14850D的靶标基因序列±1000bp附近设计两对特异性引物，第一轮特异性引物扩增时，有多条非特异性条带如下图（6）A，极易干扰测序结果，可能导致测序失败，因此采用两轮巢式PCR扩增以获得纯净的单一的目的基因条带如图（6）B，用于PCR产物测序。图6.巢式PCR扩增获得BnaRFC2基因序列Fig6NestedPCRamplificationtoobtainBnaRFC2genesequencePCR产物测序结果（附录2）显示，在9株含有质粒的阳性植株中，有2株苗（Bnarfc2-f/i）A基因组和C基因组都没有基因的编辑，说明在T0代，CAS9蛋白没有识别靶标或CAS9蛋白未能正常表达；而Bnarfc2-2检测到C基因组有单个基因的插入，同时Bnarfc2-e检测到A基因组有基因片段的缺失；而Bnarfc2-3/5/6/d//j这5株油菜在A基因组和C基因组都有基因的编辑(如下表所示)。植株编号BnaA09g10830D是否检测到基因编辑BnaCnng14850D是否检测到基因编辑Bnarfc2-2否是Bnarfc2-3是是Bnarfc2-d是是Bnarfc2-f否否Bnarfc2-5是是Bnarfc2-6是是Bnarfc2-e是否Bnarfc2-i否否Bnarfc2-j是是为了进一步鉴定转基因植株的碱基编辑情况，选择Bnarfc2-e，Bnarfc2-d和Bnarfc2-6的PCR产物构建T克隆载体，每一个突变植株的每一个基因组选取5个单克隆进行测序分析。检测结果(如图7)表明：Bnarfc2-eA组CATG四个碱基的缺失，且含有A组和C组野生型的拷贝，是一个基因突变的杂合子植株。Bnarfc2-d在A组存在3种类型的碱基缺失编辑，C组存在两种方式的基因编辑，说明该植株极大可能是一个嵌合体，且后代很有可能分离出纯合突变体；Bnarfc2-6在A组存在1种类型的碱基缺失编辑，C组存在两种方式的基因编辑，且都不包含野生型拷贝的A组和C组基因，说明该植株后代很有可能分离出纯合突变体。图7部分转基因植株RFC2基因T-克隆测序对比结果Fig7ComparisonresultsofT-cloningandsequencingofRFC2geneofsometransgenicplants图8移栽后约120天的Bnarfc2-d阳性苗的表型Fig8PhenotypeofBnarfc2-d-positiveseedlingsabout120daysaftertransplanting5讨论在以往的研究中，拟南芥RFC2的T-DNA插入纯和突变是致死的，且关于植物中RFC2基因的研究一致处于停滞状态。因此在构建油菜RFC2基因敲除载体时，考虑到移码突变或者提前终止翻译将导致突变致死，只选择了一个靶标，期待能获得有碱基替换的有义突变。通过测序分析，本研究靶位点突变率达到60%（9/15），虽然突变体皆为移码突变，但是T0代并没有导致致死的表型，只是转基因植株表现为叶片上有褶皱，叶片面积更小，植株矮小，T0代植株种子败育率高，果荚短小，种子数目减少等表型。但考虑到T0代植株为组培苗，很有可能是嵌合体，因此应该在T1代继续鉴定获得更准确的表型和基因型。在异源四倍体油菜中，单靶点的突变鉴定需要通过测序鉴定突变位点，本试验采用两轮巢式PCR鉴定的方法，能有效提高扩增基因序列的特异性，提高测序成功率和测序质量，筛选有突变的植株，节约成本，减少工作量，准确率高。获得的有基因编辑的突变体可在T0代继续通过T克隆测序，也可以直接T1代再采用PCR产物测序的方法鉴定突变位点，节约测序成本和时间，是一种油菜单位点突变检测的好方法。参考文献：李子雄.油菜抗寒种质材料筛选与应用研究[D].陕西：西北农林科技大学，2019：1-4.刘正琼，王洪锦.油菜多功能开发利用研究综述[J].现代农业科技，2019，758（24）:1-2.LuckowB,BunzF,StillmanB,etal.Cloning,expression,andchromosomallocalizationofthe140kilodaltonsubunitofreplicationfactorCfrommiceandhuman[J].MolCellBiol,1994,14(3):1626-1634.GarySL,BurgersPMJ.IdentificationofthefifthsubunitofSaccharomycescerevisiaereplicationfactorC[J].NuclAcidsRes.1996,23:4986-4991.GrayFC,MacNeillSA.TheSchizoSaccharomycespomberfc3+genesencodesahomologueofthehumanhRFC36andSaccharomycescerevisiaeRFC3subunitofreplicationfactorC[J].CurrGenet.2000,37:159-167.TsuchiyaA,InoueYH,IdaH,etal.TranscriptionalregulationoftheDrosophilarfc1genebytheDRE-DREFpathway[J].FEBS.2007,274(7):1818~1832.陈良城.AtRFC5对拟南芥植株生长发育得调控作用研究[D].湖南：湖南农业大学,2013：1-7.KimJ,RobertsonK,MylonasKJL,etal.ContrastingeffectsofElg1-RFCandCtfl8-RFCinactivationintheabsenceoffullyfunctionalRFCinfissionyeast[J].NucleicAcidRes.2005,33(13):4078-4089.崔金全,石一复,周怀君等.不同妊娠滋养细胞疾病组织中RFC2、PCNA表达的研究[J].癌症.2004,23(2):196-200.FurukawaT,IshibashiT,KimuraS,etal.CharaterizationofallthesubunitsofreplicationfactorCfromahigerplant,rice(OryzasativaL.),andtheirrelationtodevelopment[J].PlantMolBiol.2003,53(1-2):15-25.夏石头，萧浪涛，毕冬玲，等.拟南芥复制因子C亚基1在胚胎发生中起重要作用[J].植物生理与分子生物学报，2007，33(3):179-187.QianLiu，etal.DNAReplicationFactorC1MediatesGenomicStabilityandTranscriptionalGeneSilencinginArabidopsis[J].ThePlantCell,2010,22:2336-2352.ShitouXia,LangtaoXiao,PatrickGannon,etal.RFC3regulatescellproliferationandpathogenresistanceinArabidopsis[J].PlantSignaling&Behavior2010,5:2,168-170.刘颖，崔看等.复制因子C亚基3基因突变对拟南芥开花和种子发育的影响[J].湖南农业科学，2013，（13）：1-3.JieQian,YueyueChen,YingHu,etal.Arabidopsisreplicationfact