2026届新高考生物考前热点复习：常见PCR类型的原理及应用

2026届新高考生物考前热点复习常见PCR类型的原理及应用应用一利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤,可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。专项突破1.(2026·福建漳州模拟)转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累,可能与内源蛋白相互作用,产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素,科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因(如下图)并导入棉花细胞。相关叙述错误的是(

)A.使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接B.选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接C.可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞D.融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞壁定向积累B解析DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸,而连接两个基因需要的是DNA连接酶,因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接,A项正确。PCR检测融合基因时,需选择位于两个基因外侧的引物(如C基因上游和Bt基因下游),确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段,因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正确连接,B项错误。花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管,利用受精过程将基因整合到胚细胞中,因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞,C项正确。C蛋白能结合纤维素(主要存在于细胞壁),融合基因表达后,Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向至细胞壁附近,减少在细胞质中的积累,即融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞壁定向积累,D项正确。应用二利用PCR技术引导基因定点突变重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。专项突破2.(2026·陕西咸阳模拟)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种蛋白质,是一种优良的凝血酶抑制剂。已知天然水蛭素的抗凝血活性较低,产量和来源有限。研究发现,水蛭素的第47位天冬酰胺替换为赖氨酸,可以提高其活性。某科研团队拟利用这一发现改造水蛭素基因,他们通过重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性,相关原理如图所示。回答下列问题。注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。

(1)改造水蛭素基因时,要建立功能与结构的联系,运用

工程对水蛭素分子进行改造:从预期的水蛭素功能出发,设计水蛭素的蛋白质结构,推测出相应的氨基酸序列,再依据中心法则推测出对应的

,进而运用重叠延伸PCR技术改造基因。

(2)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为

才能达到目的,若引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为

。

(3)过程②和③不能在同一反应容器内同时进行,原因是

。

蛋白质核苷酸序列T—A或C—GT引物2和引物3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用(4)已知天然水蛭素基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割,特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别,请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变后的基因是否为定点突变基因。实验思路:

。

预期实验结果:若

,

则上述过程获得的突变后的基因是定点突变基因。用限制酶DpnⅠ分别处理天然水蛭素基因和上述过程获得的突变后的基因,然后对二者进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果上述过程获得的突变后的基因的电泳条带只有一条且大于天然水蛭素基因的电泳条带解析(1)改造水蛭素基因时,要建立功能与结构的联系,需要运用蛋白质工程对水蛭素分子进行改造,具体过程为:从预期的水蛭素功能出发,设计水蛭素的蛋白质结构,推测出相应的氨基酸序列,再依据中心法则推测出对应的核苷酸序列,进而运用重叠延伸PCR技术改造基因。(2)若天冬酰胺密码子AAU对应基因的模板链中的碱基为TTA,赖氨酸密码子AAA对应基因的模板链中的碱基为TTT,因此将A—T突变为T—A,可以得到TTT基因,其转录出的RNA编码赖氨酸;若天冬酰胺密码子AAC对应基因的模板链中的碱基为TTG,赖氨酸密码子AAG对应基因的模板链中的碱基为TTC,因此将G—C突变为C—G,可以得到TTC基因,其转录出的RNA编码赖氨酸。故拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为T—A或C—G才能达到目的。引物为单链DNA,引物2与3应互补配对,故引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为T。(3)过程②和③不能在同一反应容器内同时进行,是因为引物2和3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用。(4)已知天然水蛭素基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割,特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别,想要鉴定上述过程获得的突变后的基因是否为定点突变基因。可以用限制酶DpnⅠ分别处理天然水蛭素基因和上述过程获得的突变后的基因,然后对二者进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果。若上述过程获得的突变后的基因的电泳条带只有一条且大于天然水蛭素基因的电泳条带,则上述过程获得的突变后的基因是定点突变基因。应用三利用PCR技术扩增未知基因序列利用PCR技术进行基因扩增时,为了便于设计引物,要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。专项突破3.(2026·湖北模拟)反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术,需要先将目标DNA进行环化,再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点,部分过程如下图所示,相关叙述正确的是(

)A.过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3B.过程③中复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合C.过程③所用的酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸D.PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列C解析反向PCR是扩增已知序列两侧的未知序列,过程②设计引物时,应根据已知序列(目的基因两侧的部分核苷酸序列)来设计引物1和4,而不是引物2和3,A项错误。PCR过程中,复性的温度一般在50℃左右,而72℃左右是延伸的温度,所以过程③中复性不是在72℃左右,B项错误。DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,过程③PCR所用的酶也是从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,C项正确。PCR第一轮循环得到的两条DNA链长度不同,第二轮循环得到的DNA片段也都不等长,至少要到第三轮循环才可获得两条链等长的DNA片段,所以PCR第二轮循环不能获得两条链等长的未知序列,D项错误。应用四实时荧光定量PCR专项突破4.(2026·广东模拟)实时荧光定量PCR是将荧光标记的探针与待测样本DNA混合,当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解时,可在特定条件下检测到荧光。随着循环次数的增加,荧光信号强度增加。下列相关叙述正确的是(

)A.PCR过程中两种引物的碱基序列不能互补配对B.耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为3'端→5'端C.荧光信号达到设定的阈值时,经历的循环数越少,说明含有病变的概率越低D.若某次PCR反应共产生52个等长的DNA,则需要加入6个荧光探针A解析PCR的两种引物需分别与模板链的3'端互补,若引物间碱基互补会相互结合,干扰反应,因此设计时应确保两种引物的碱基序列不互补,A项正确。DNA聚合酶催化子链延伸方向为5'端→3'端,而非3'端→5'端,B项错误。若荧光信号达到设定的阈值时,经历的循环数越少,说明扩增次数少,有更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对,可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大,C项错误。PCR反应中DNA以指数形式扩增,即2n(n为循环次数),若产生52个等长的DNA,由于25=32,26=64,所以循环次数大于5小于6。最初的模板DNA不需要荧光探针,从第一次循环后开始,每次循环新合成的DNA需要荧光探针,假设循环n次,需要的荧光探针数为2n-2,当n=6时,需要的荧光探针数为26-2=62,D项错误。应用五DNA片段电泳与遗传试题的综合DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团带有正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。不同大小的DNA片段迁移速率不同,凝胶中的DNA分子通过染色可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。因此琼脂糖凝胶电泳能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段。等位基因由基因突变而来,若一对等位基因A、a经过限制酶切割后形成的DNA片段分子量不同,则在电场作用下移动距离不同,最终使得A、a得以分开,形成不同的条带。专项突破5.(2025·云南模拟)甲型血友病(HA)是凝血因子Ⅷ基因突变导致的一种凝血功能障碍性遗传病。患者常自发性或伤后出血不止,尚不能根治。科研团队对某HA先证者(家系中第一个患者)及家系成员凝血因子Ⅷ基因某片段进行PCR扩增、酶切、电泳来进行基因诊断,电泳结果如图所示。M:标准DNA片段;Ⅲ-2:先证者(男性);Ⅲ-3:先证者妹妹;Ⅱ-3:先证者母亲;Ⅱ-4:先证者父亲;Ⅱ-2:先证者姨妈(妈妈的姐姐);Ⅰ-2:先证者外婆;Ⅲ-1:先证者姨妈的女儿。据图分析,下列叙述正确的是(

)

A.HA的遗传方式是常染色体隐性遗传B.Ⅰ-2的电泳结果与Ⅱ-3相同的概率是1/3C.该研究不能对症状前的婴幼儿进行有效诊断D.先证者妹妹将来生育患病女儿的概率可以是0D解析观察电泳结果图,先证者(Ⅲ-2)为男性患者,其父亲(Ⅱ-4)不患病,母亲Ⅱ-3电泳结果显示是杂合子(有两个条带,一个正常基因条带,一个致病基因条带),若为常染色体隐性遗传,父母都应至少携带一个致病基因,而父亲只有一种基因,说明不是常染色体隐性遗传,HA的遗传方式是伴X染色体隐性遗传,A项错误。设相关基因为XH、Xh,Ⅰ-2是正常女性,其女儿(Ⅱ-3)是携带者,所以Ⅰ-2的基因型为XHXh,Ⅱ-3