基因工程的基本操作程序-高二生物人教版选择性必修3

复习回顾：1.重组DNA技术的基本工具有哪些？2.限制酶切割产生的末端有？3.限制酶为什么不切割自身DNA？4.连接平末端一般用？5.做载体的条件？限制性内切核酸酶DNA连接酶载体黏性末端或平末端无限制酶的识别切割序列，或者将DNA识别序列甲基化使限制酶不能将其切开。T4DNA连接酶能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，有一个至多个限制酶切割位点，有标记基因，无毒害作用情境导入培育转基因抗虫棉的简要过程

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞提取抗虫棉导入与载体拼接重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取（前提）2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞（关键）4.目的基因的检测与鉴定（保证）抗虫基因苏云金杆菌第3章基因工程

第2节基因工程的基本操作程序学习目标：1.简述PCR的原理、条件及过程。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。预习自测(1)可用PCR技术直接扩增mRNA来获取目的基因(

)(2)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(

)(3)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(

)(4)TaqDNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶(

)(5)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(

)(6)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(

)(7)基因表达载体中含有启动子和终止密码子(

)(8)标记基因不一定是抗生素抗性基因(

)××mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。×高温×DNA聚合酶×基因表达载体的构建×有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。√√探究一.目的基因的筛选与获取1.目的基因(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。

根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指___________________。编码蛋白质的基因如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因——Bt抗虫蛋白基因（Bt基因

）探究一.目的基因的筛选与获取2.基因的结构外显子内含子启动子原核生物真核生物RNA聚合酶识别结合的部位，驱动基因转录使转录停止终止子编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游外显子：能编码蛋白质的序列。内含子：不能编码蛋白质的序列编码蛋白质探究一.目的基因的筛选与获取【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较【思考】编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？不能编码蛋白质的序列=

非编码区原核生物的基因：不能编码蛋白质的序列真核生物的基因：=非编码区+内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都由能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成连续不连续编码区非编码不一样，真核细胞更长，因为有内含子探究一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法之一从相关的___________和___________的基因中进行筛选。已知结构功能清晰用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害对Bt基因的表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因功能清晰已知结构实例：Bt

抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程探究一.目的基因的筛选与获取(2)认识基因结构和功能的技术方法利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具(如BLAST)等，找到合适的目的基因。测序技术序列数据库序列比对工具核苷酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。基因测序仪探究一.目的基因的筛选与获取3.获取目的基因的方法①从生物组织中直接获取②人工合成③从基因文库中获取④利用PCR获取和扩增目的基因基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成基因组文库（某生物全部基因）部分基因文库（主要是cDNA文库）前提：方法：DNA合成仪探究一.目的基因的筛选与获取基因组DNA限制酶切基因组文库mRNA逆转录得cDNA,酶切cDNA文库拼接质粒，导入细菌中保存为文库（3）基因文库的构建探究一.目的基因的筛选与获取部分基因文库和基因组文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子（非编码区）基因中内含子基因多少小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列（如非编码区、内含子）探究一.目的基因的筛选与获取4.利用PCR获取和扩增目的基因（1）PCR技术：PCR是______________

_的缩写，是一项根据___________的原理，在___

_提供参与DNA复制的___

____与__

_______，对___________________

_进行______

__的技术；聚合酶链式反应DNA半保留复制体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因原理操作环境目的优点：探究一.目的基因的筛选与获取模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸①条件ATPDNA聚合酶（形成磷酸二酯键）解旋酶（解螺旋，打开氢键）③复制特点:①边解旋边复制

碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）②复制原则:②半保留复制④子链的延伸方向：5'端→3'端

因为DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。回顾:体内DNA复制探究一.目的基因的筛选与获取子链合成需要引物：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链，体内的DNA复制通常以RNA单链为引物（不切除）体外（PCR）一般以DNA单链为引物（后续被酶切除）用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。探究一.目的基因的筛选与获取（2）PCR条件:体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA）反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增。探究一.目的基因的筛选与获取【拓展】DNA的复制的原料--dNTP

dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简图如下：PPP～～N脱氧核糖ATGC脱氧核苷酸dNTP为子链合成供能。dATPdGTPdCTPdTTP探究一.目的基因的筛选与获取（3）PCR反应过程耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。探究一.目的基因的筛选与获取（3）PCR反应过程当温度超过______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

(1)变性：氢键单链DNA变性90℃待扩增的DNA片段3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。探究一.目的基因的筛选与获取（3）PCR反应过程当温度下降

到左右时，

种引物通过

与两条单链DNA结合。

3’5’3’5’碱基互补配对引物15’3’引物25’3’(2)复性：50℃两思考：引物结合在模板链的什么位置？引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。设计引物的要求：①同种引物之间不能发生碱基互补配对，防止引物自身折叠；②两种引物之间不能互补配对，防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合。③引物长度不宜过短，防止引物随机结合探究一.目的基因的筛选与获取（3）PCR反应过程当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端探究一.目的基因的筛选与获取（3）PCR反应过程第二轮循环的产物第三轮的产物3’5’3’5’3’5’3’5’第一轮循环的产物3’5’3’5’由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。探究一.目的基因的筛选与获取探究一.目的基因的筛选与获取（3）PCR反应过程①DNA分子有_____个②总链数_____条③不含引物的链数：___④含引物的链数_____⑤含引物1或2的链数：______⑥仅含引物1的DNA数：______⑦仅含引物2的DNA数：______⑧引物1、2均含有的DNA数：_____⑨不含引物的DNA数：______⑩需要引物的总数：______2n2n+122n+1-2循环n次：2n-1112n-202n+1-2★探究一.目的基因的筛选与获取【思考讨论】1.利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’探究一.目的基因的筛选与获取【思考讨论】2.PCR扩增的

(填“是”或“不是”)完整的模板DNA分子，理由是

。3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是？设计引物时需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？4．要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的

分别添加上

。5.用PCR可以扩增mRNA吗？（p79）只需要根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物（无需知道全部序列）不是PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物5′端限制酶的识别序列PCR不能直接扩增RNA，应先将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增。探究一.目的基因的筛选与获取(4)PCR产物鉴定PCR过程可以在

中自动完成，完成以后，常采用

来鉴定PCR的产物琼脂糖凝胶电泳PCR扩增仪(2)若这个过程中消耗了引物62个,则进行了

轮的DNA复制。(3)若用PCR技术扩增图示目的基因，应选

用的引物是

。【典例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。(1）第1组：

；

第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效5(2n+1-2)=62引物甲、引物丙BC3′端至少3个循环【典例2】(不定项)运用PCR技术从DNA中扩增目的基因的过程中，引物是所需要的基本条件，引物的3′端碱基为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制。下列叙述正确的是(

)A．引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸B．通过设计引物的3′端能选择需要扩增的DNA片段C．引物的5′端可用于添加限制酶切割位点等序列D．用图中引物扩增一个循环后即可获得目的基因探究二.基因表达载体的构建核心1.目的：2.基因表达载体的组成：（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选。注意：目的基因必须插入到启动子与终止子之间。抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。探究二.基因表达载体的构建启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA终止转录翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达探究二.基因表达载体的构建3.构建过程:DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同种载体（质粒）目的基因限制酶切割位点标记基因启动子限制酶切割位点终止子复制原点限制酶限制酶DNA连接酶重组DNA分子探究二.基因表达载体的构建[思考]如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？载体目的基因自身环化片段间

随意

连接目的基因自身环化质粒自身环化目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接反向连接11’22’122’1’21’12’正向连接单酶切法缺点：质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因反向连接探究二.基因表达载体的构建双酶切法：选择两种不同的限制酶同时对含目的基因的DNA片段和载体切割。限制酶a切割abDNA连接酶连接限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割ab双酶切的优点:防止质粒、目的基因自身环化

B.防止质粒与目的基因随意连接探究二.基因表达载体的构建(3)确保出现相同黏性末端原则：

通常所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，如图中

；

为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，选择两种不同