嗜热子囊菌与芽孢杆菌共培养对大曲发酵理化及风味的影响

视为合适的粒度REF_Ref13617\w\h[29]，混匀备用，按照小麦粉：水=1：0.25的比例，在盆中将二者混合均匀，静置0.5h，分装至250mL锥形瓶，每瓶100g，用封口膜封口，121℃灭菌15min晾凉间隔1d备用。接种菌液：将筛选出的优势菌种按1:1的比例计算，接入总计5mL于模拟发酵小麦粉瓶中，搅匀。模拟发酵：设置3个不同温度梯度（40℃、50℃、60℃），分别放置在培养箱中培养，在1、3、5d时取样进行理化指标及风味物质的测定。理化指标定义液化酶活力定义：1g干曲在60℃、pH6条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量称为1个酶活力单位（U/g）。蛋白酶酶活定义：在40℃条件下，1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，为1个酶活单位（U/mL）。β-葡萄糖苷酶和酯酶活度单位定义：1min内释放1µmolp-NP所需酶的体积，根据标准曲线计算对硝基酚（p-NP）浓度。风味物质检测方法及条件固体：准确称取1g大曲试样（固态）于20mL顶空瓶,加2gNaCl和4mL纯水,并加入10µL内标（质量浓度为0.1644g/L,2-辛醇）后盖上瓶盖。液体：取1mL酒样于20mL顶空瓶,加2gNaCl和4mL纯水,并加入10µL内标（质量浓度为0.1644g/L,2-辛醇）后盖上瓶盖。气相色谱条件:DB-WAX色谱柱(60m×0.25mm,0.25μm);He作为载气,流速控制为0.8mL/min;采取程序升温方案:起始温度40℃,保持1min,以2.5℃/min速度升至75℃,再以3℃/min升至162℃,再以6℃/min升至230℃/min,保持5min;进样口温度为250℃;不分流进样（分流比为-1）。质谱条件:选择电子轰击离子源,电子能量70eV,离子源温度230℃,接口温度为250℃,检测器电压为相对调谐结果0.1kV,采集方式为扫描,质量扫描范围（m/z）35～500amuREF_Ref12839\w\h[30]。数据处理优良芽孢杆菌的筛选将8株芽孢杆菌及2株嗜热真菌在37℃条件下发酵时1、3、5、7天的理化指标汇总整理，如REF_Ref30274\h图1所示。图SEQ图\*ARABIC137℃液态发酵不同芽孢杆菌酶活分布情况A-H分别表示芽孢杆菌在37℃条件下培养时，1、3、5、7天的各项酶活力（为方便统计，淀粉酶活力＜1.25U/g时以1.25U/g计） GQ-4中性蛋白酶活在3d时达到最大值78.77U/mL，酸性蛋白酶活在1d时达到最大值78.66U/mL，淀粉酶活极低，在7天内未检出，β-葡萄糖苷酶、酯酶活力均较低，未超过10mmol/L；FX-6在发酵后期（7d）时各项酶活达到最高水平，其中蛋白酶活力、β-葡萄糖甘酶活与其他菌株相比表现较为良好，淀粉酶在1、3d未检出，7d时最高，为60U/g，中性、酸性蛋白酶在7d分别为112.83U/mL、140.45U/mL；X-1在7d时各项酶活达到最高水平，其中酸性蛋白酶活力、淀粉酶活力、β-葡萄糖甘酶活与其他菌株相比处于中等水平，中性蛋白酶7d时最高，为127.26U/mL，酯酶活力7d时达到13.28mmol/L；J-6在7d时各项酶活达到最高水平，其中中性蛋白酶活力126.85U/mL，淀粉酶、酯酶活力相对较高，分别为60U/g、8.76mmol/L；M-1蛋白酶活力低，呈现逐渐降低的趋势，3d时中性、酸性蛋白酶活力达到最大值，分别88.97U/mL、91.28U/mL，7天内淀粉酶活力均未检出，7d时酯酶活力最高，为11.29mmol/L；X-18在7d时各项酶活达到最高水平，其中淀粉酶活力与其他菌株相比表现突出，7d时淀粉酶活力为85.71U/g，其他菌整体表现较为稳定，可选为后续混菌发酵菌株；NR-9蛋白酶活非常低，在3d时达到最高，酸性、中性蛋白酶分别为77.63U/mL、80.198U/mL，淀粉酶、酯酶活力7d时较高，分别为85.71U/g、10.91mmol/L；L-2中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶活、酯酶活力在1-7天呈逐渐增大趋势，7d时达到峰值，分别为186.64U/mL、186.60U/mL、120.00U/g、10.22mmol/L、13.07mmol/L，与其他菌株相比表现优秀，可选为后续混菌发酵菌株。综合上述分析，X-18具有突出的淀粉酶活性（85.714U/g）以及均处在一个较高的水平的中性蛋白酶活力（80.20U/mL）、酸性蛋白酶活力（101.27U/mL）、酯酶活力（10.57mmol/L），L-2具有突出的中性蛋白酶活力（186.64U/mL）、酸性蛋白酶活力（186.60U/mL）、酯酶活力（13.07mmol/L）、β-葡萄糖甘酶活力（10.22mmol/L），为后续构建人工菌群奠定基础，因此选择X-18、L-2与嗜热真菌进行混合发酵。嗜热真菌理化指标图SEQ图\*ARABIC237℃液态发酵嗜热真菌酶活力分布情况（为方便统计，淀粉酶活力＜1.25U/g时以1.25U/g计） 由柱状图可知，2株嗜热真菌均表现出较低的中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、β-葡萄糖苷酶活力，淀粉酶活力全部未检出，但酯酶活力较高，分别为10.98mmol/L和28.02mmol/L，由于实验室现有嗜热真菌仅此2株，因此不做进一步筛选，直接与优良芽孢杆菌混合培养。混菌发酵对酶活及风味物质的影响芽孢杆菌和嗜热真菌共培养对酶活的影响相同温度下不同微生物菌种组合对酶活的影响选取液态发酵（37℃）条件下单菌与混菌的理化指标进行汇总与整理，如REF_Ref26793\h图3所示：图SEQ图\*ARABIC337℃液态条件下单菌与混菌发酵酶活力注：为方便统计，淀粉酶活力＜1.25U/g时以1.25U/g计）如图A所示，当酸性蛋白酶活力相当的MJ-1和PDA-50-1分别与活力较好的两株芽孢杆菌共培养时，共培养体系的酶活性会稳定处于中间水平，以各自酶活最高水平为例，MJ-1、PDA-50-1酸性蛋白酶分别为53.44U/mL、53.10U/mL，X-18、L-2为101.28U/mL、188.70U/mL，混合发酵后既高于嗜热真菌单菌发酵时的活性，又低于芽孢杆菌单独发酵时的活性，组合（1+3）、（1+4）、（2+3）、（2+4）为75.30U/mL、121.48U/mL、73.39U/mL、115.20U/mL，推测芽孢杆菌可能对真菌的酸性蛋白酶生产存在正向调控作用，但其自身表达受到一定抑制。如图B所示，（1+3）、（2+3）的组合会使中性蛋白酶处于各自单菌发酵时的中间水平，以各自酶活最高水平为例，MJ-1、PDA-50-1、X-18的中性蛋白酶为54.27U/mL、48.64U/mL、124.03U/mL，而组合后（1+3）、（2+3）为89.32U/mL、84.52U/mL，可推测X-18对MJ-1、PDA-50-1的中性蛋白酶表达有促进作用,但会影响其自身的酶活力；7d时，组合（2+4）的中性蛋白酶为228.52U/mL，高于各自单菌发酵时的48.64U/mL、186.64U/mL，可知这两株菌的组合能够提高体系的中性蛋白酶活力。如图C所示，除组合（1+4）外，酯酶活性整体呈现随着天数的增长逐渐增大的趋势，当嗜热真菌与X-18组合后，酯酶活力从10.58mmol/L(MJ-1)和28.02mmol/L(PDA-50-1)提升为21.21mmol/L（1+3）和31.92mmol/L（2+3），可推测X-18与嗜热真菌组合时对各自的酯酶产生有积极影响，组合（2+4）混合发酵可产生同样的效果。如图D所示，混菌发酵的淀粉酶活在5d时达到最高水平，MJ-1、PDA-50-1、X-18单菌发酵时，淀粉酶活最高分别为1.25U/g、1.25U/g、200.00U/g，而在混合培养后，（1+3）和（2+3）的淀粉酶活力最高为24.00U/g、30.00U/g，说明X-18的加入提高了两株嗜热真菌的淀粉酶活；L-2的加入同样使嗜热真菌从无法检出到整个体系淀粉酶活提高至30.00U/g。如图E所示，（1+3）的组合在5d时的β-葡萄糖苷酶达到最高水平，为10.89mmol/L，且高于各自单菌发酵时的峰值（9.21mmol/L、5.96mmol/L），2+4的组合在1d时酶活力13.77mmol/L，而它们在单独发酵时为8.15mmol/L和10.22mmol/L，提高了两株菌的酶活力，后续酶活力显示出疲弱态势逐渐下降，2+3组合时在7d的酶活力为11.888mmol/L，它们在单独发酵时的酶活力分别为8.15mmol/L、5.96mmol/L，同样提高了两株菌的β-葡萄糖苷酶活力，可知两株芽孢杆菌在与PDA-50-1混合发酵时，可以提高体系的β-葡萄糖苷酶活力。相同温度下不同微生物菌种组合对酶活的影响选取不同发酵温度混菌的理化指标进行汇总与整理，如REF_Ref10951\h图4所示：图SEQ图\*ARABIC4混菌液态（37℃）发酵、固态（40℃、50℃、60℃）发酵时酶活力37℃液态培养时，四种组合的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、酯酶和β-葡萄糖苷酶均高于固态发酵酶活水平，40℃固态发酵淀粉酶活性最高，其中（1+3）在5d时最高，为150.00U/g，同时可以看到，当温度逐渐升高，淀粉酶活力迅速下降，60℃时无法检测到数据，推测可能与发酵过程中的高温和低水分有关REF_Ref3711\w\h[31]REF_Ref10439\w\h；除（2+3）外，酸性、中性蛋白酶活力整体呈现先升后降的趋势，在3d时达到顶峰，酯酶活力随着天数的增长稳步提升，5d时达到最高水平，淀粉酶活和β-葡萄糖苷酶基本呈现先降后升的趋势；同时可以看出，（1+4）的组合与其他组合相比，在37℃发酵3d时有最高的酸性蛋白酶活，最高为121.49U/mL；（2+3）在37℃下发酵时，中性蛋白酶活力呈稳步增大趋势，5d时达到最高水平，为178.54U/mL，高于其他组合；β-葡萄糖苷酶在1d时就表现出了最高的活性，随着时间的增长缓慢下降；组合（1+3）和（2+3）在40℃发酵5d时均表现出了良好的淀粉酶活力，分别30.00U/g和24.00U/g，对比另外两种组合可以推测在适宜温度下X-18对于共培养体系的液化型淀粉酶活力有促进作用；（1+3）和（1+4）液态发酵时，β-葡萄糖苷酶活性逐渐增大，到5d时达到最高水平，分别为10.89mmol/L和10.19mmol/L，可以推测MJ-1能够提高与芽孢杆菌混合发酵的产β-葡萄糖苷酶能力。不同温度条件下混菌发酵对主要挥发性物质的影响采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对3d、5d固态发酵样品挥发性物质分析，整合其中醛类、酮类、酸类、醇类、脂类物质并进行含量计算，从总风味物质、不同温度下风味物质的角度进行分析，将结果汇总如下。总风味物质分析组合（1+3）（1+4）（2+3）（2+4）中醛类、酸类、酮类等风味物质总量绘制柱状图如REF_Ref1977\h图5所示。图SEQ图\*ARABIC5混菌在40℃、50℃、60℃发酵3d、5d时总风味物质含量对比3d和5d的总风味物质可以看出，（1+3）和（2+3）的主要风味物质含量最高，40℃发酵产生的风味化合物含量总体高于50℃和60℃，其中组合（2+3）在3d时风味物质含量最大，为83.06μg/g，（2+4）在60℃条件下发酵5d时风味物质含量最少，为5.34μg/g；40℃时，组合（1+3）和（2+4）随着发酵时间的延长，主要风味物质总含量增加，分别从3d时的61.12μg/g、28.25μg/g增加为78.15μg/g、51.62μg/g，增加了17.03μg/g、13.27μg/g；50℃时，组合（2+4）随着发酵时间的延长，主要风味物质从23.11μg/g增加到31.97μg/g，增加了8.86μg/g。不同发酵天数主要风味物质的差异（40℃）图SEQ图\*ARABIC640℃风味物质含量由图A-E可知，40℃发酵时，醇类物质含量相对较高，且均表现为5d高于3d，组合（2+4）变化幅度最大，增长了7.59μg/g，（1+4）混合发酵3d、5d时产生最多的醛类物质，分别为0.75μg/g和0.52μg/g，但其它4类化合物含量较低；（1+3）混合发酵5d时产生最多的酮类和酸类物质，分别为5.04μg/g和6.64μg/g，同时产生较多的醇类和脂类物质；（2+3）混合发酵3d时产生最多的酯类物质，为0.84μg/g，同时产生较多的酸、醇类物质，但醛、酮类物质未检出。综上所述，40℃时，组合（1+3）、（2+3）在主要风味化合物方面表现突出，组合（1+4）略显不足。不同发酵天数主要风味物质的差异（50℃）图SEQ图\*ARABIC750℃风味物质含量由图A-E可知，组合（1+3）、（1+4）、（2+3）的醛类、酮类含量较低，而（2+4）非常高，分别为0.36μg/g（3d，醛类）、0.65μg/g（5d，醛类）、2.34μg/g（3d，酮类）、2.72μg/g（5d，酮类），推测可能为组合（2+4）产醛酮类物质的能力受高温的抑制作用相对较弱；4种组合的醇类物质含量都保持在较高水平；对比40℃可知，随着温度升高，五类风味物质的含量都呈下降趋势。综上所述，50℃时，组合（2+4）表现出突出的风味物质含量，（1+3）、（1+4）、（2+3）的醛类、酮类风味化合物的合成受到较大抑制，醇类物质保持稳定水平。不同发酵天数主要风味物质的差异（60℃）图SEQ图\*ARABIC860℃风味物质含量由图A-E可知，60℃时，各类风味物质含量达到最低水平，醛类、酸类物质均不高于0.08μg/g，发酵3d时，（2+3）的醛类物质含量最低，为0.02μg/g（3d）和0.84μg/g（5d）；组合（1+3）、（1+4）、（2+3）随着发酵天数的增加，酮类物质含量逐渐降低，分别降低了0.016μg/g、0.041μg/g、0.045μg/g；组合（1+4）3d时的酸类物质含量最高，为0.08μg/g，（2+3）未检测出酸类物质；醇类物质含量依旧保持稳定的较高水平；4种组合的脂类物质含量均表现为3d大于5d。总体来看，60℃时，各类风味物质含量均降低，横向比较时组合（1+4）风味物质最丰富；酸类物质的产生受到最大抑制，4种组合的醇类物质含量保持在稳定水平。结论本研究通过分析8株芽孢杆菌、2株嗜热真菌在37℃小麦浸出物中发酵的理化指标，根据不同菌株的理化指标表现，筛选出了2株优势芽孢杆菌与嗜热真菌组合，进一步建立共培养发酵体系，分别在在液态（37℃）、固态（40℃、50℃、60℃）条件下发酵，进一步探究芽孢杆菌与嗜热真菌共培养对大曲发酵理化指标及风味物质的影响，研究发现：B.amyloliquefaciens（X-18）具有突出的淀粉酶活性和均处在一个较高的水平的中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、酯酶活力，velezensis（L-2）具有突出的中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、酯酶活力、β-葡萄糖甘酶活力，为后续构建人工菌群奠定基础。当嗜热真菌Thermoascuscrustaceus（MJ-1）、T.crustaceus（PDA-50-1）与B.amyloliquefaciens（X-18）共培养能提高酯酶活力；T.crustaceus（PDA-50-1）与芽孢杆菌Velezensis（L-2）共培养能提高中性蛋白酶活力，芽孢杆菌与嗜热真菌混合培养能提高β-葡萄糖苷酶活力。液态发酵的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、酯酶、β-葡萄糖苷酶活性普遍高于固态发酵，淀粉酶在40℃固态发酵时活力最高。40℃发酵产生的风味化合物含量总体高于50℃和60℃，40℃时风味物质的优势组合为Thermoascuscrustaceus+B.amyloliquefaciens（MJ-1+X-18）和T.Crustaceus+B.amyloliquefaciens（PDA-50-1）+（X-18），50℃时风味物质的优势组合为T.crustaceus+Velezensis（PDA-50-1+L-2），60℃时风味物质的优势组合为Thermoascuscrustaceus+Velezensis（MJ-1+L-2）。不足与展望不足本次实验是对芽孢杆菌与嗜热子囊菌共培养本理化指标及风味物质的探索，通过对相关酶的活性的测定及风味物质的分析，初步筛选出了促进中性蛋白酶、酯酶、β-葡萄糖苷酶的混菌组合，确定了各个酶的最适温度以及酶活变化趋势，但是，本研究还有诸多不足，1）实验仅纳入2株嗜热子囊菌（MJ-1、PDA-50-1），所选嗜热子囊菌可能不完全能代表发酵功能，导致关键代谢协同机制的漏筛，后续扩大嗜热真菌菌株筛选范围（≥10株），结合宏基因组学系统解析种间互作机制。2）对于发酵产物理化指标的测定重点侧重于酶活力与风味物质，而忽略了酸、糖等的检测，后续可测定更多理化指标，进行更为全面的分析。展望本研究嗜热真菌与芽孢杆菌共培养的应用提供了基础数据，通过筛选嗜热真菌与芽孢杆菌的最佳共培养组合，确定了其最适温度及培养条件，并初步分析了其对理化指标和风味物质的影响。然而，该体系在食品发酵工业生产中的应用潜力仍有待深入探索。未来研究可从以下几个方面展开：1）目前的研究主要聚焦于共培养的酶活、风味物质，但对微生物间的代谢互作（如协同或拮抗作用）尚未深入探讨，可结合宏基因组学、代谢组学等技术，揭示代谢通路，以优化菌群组合并提高生产效率及大曲品质；2）可尝试将本研究筛选出的优势菌群组合进一步与其他菌种组合，探究更多菌种之间的相互作用；3）还可继续深入探究不同培养环境对理化指标及风味物质的影响，例如实验室小规模培养与工业化生产存在何差异、不同种类小麦对发酵的影响。参考文献吴正坤,刘蒲临,杨团元,等.不同贮存期高温大曲微生物群落演替与理化指标相关性分析[J].中国酿造,2023,42(07):160-166.张春英,张子怡,杨涛,等.浓香型中高温大曲制作过程中细菌群落变化研究[J].酿酒,2025,52(02):104-108.孙亮霞,林一心,王生艳,等.白酒大曲中产香功能微生物的应用研究进展[J].中国酿造,2024,43(09):21-28.陈莹琪,陈杰,周耀进,等.浓香型大曲微生物菌群演替与吡嗪类物质合成的关系[J].食品科学,2023,44(02):222-230.WangX,BanS,HuB,etal.BacterialdiversityofMoutai‐flavourDaqubasedonhigh‐throughputsequencingmethod[J].JournaloftheInstituteofBrewing,2017,123(1):138-143.ZhuM,ZhengJ,XieJ,etal.Effectsofenvironmentalfactorsonthemicrobialcommunitychangesduringmedium-hightemperatureDaqumanufacturing[J].FoodResearchInternational,2022,153:110955.张新红,张源.浓香型大曲质量影响因素研究进展[J].生物化工,2020,6(04):118-122.何小容,张庆,唐家环,等.浓香型白酒大曲发酵过程中主要微生物群系及其作用研究进展[J].中国酿造,2024,43(08):1-6.ChenC,YangH,LiuJ,etal.SystematicreviewofActinomycetesinthebaijiufermentationmicrobiome[J].Foods,2022,11(22):3551.DuH,JiM,**ngM,etal.TheeffectsofdynamicbacterialsuccessionontheflavormetabolitesduringBaijiufermentation[J].FoodResearchInternational,2021,140:109860.李斌,胡俊杰,张兰兰,等.基于高通量测序浓香型和芝麻香型白酒酒曲真菌群落结构的分析[J].中国酿造,2019,38(10):96-100.LiuC,FengS,WuQ,etal.RawmaterialregulatesflavorformationviadrivingmicrobiotainChineseliquorfermentation[J].FrontiersinMicrobiology,2019,10:1520.吴树坤,杨磊,杨玲麟,等.沉香型酒醅中产香芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析[J].中国酿造,2018,37(01):35-40.XueW,JianL,QianW,etal.ResearchProgressontheeffectofBacillusonflavorsubstancesofMaotaiflavorBaijiu[J].FoodScienceandTechnology,2023,43:e101422.谢三款,孙守营,张娇娇,王增强,周涛,杨攀华,何猛超,任俊宇,胡景辉,陈禹锜,韩兴林.馥香型白酒发酵过程微生物演替规律及核心微生物组分析[J].食品与发酵工业,1-12.崔雨欣,蔡开云,陈萍,申登晋,曾宇伦,谭光迅,赵述淼.稻花香馫香型白酒酒曲酶活测定与高通量测序分析[J].酿酒科技,2021,(06):89-94.朱治宇,黄永光.基于高通量测序对茅台镇酱香白酒主酿区霉菌菌群结构多样性的解析[J].食品科学,2021,42(08):150-156.刘延波,王琳琳,金尚萍,等.不同储藏期浓香型白酒大曲的微生物多样性分析[J].中国酿造,2022,41(04):105-110.向港兴,陈莹琪,沈毅,等.不同等级浓香型大曲微生物群落结构与理化性质的