《中国药典》无菌及微生物限度检查法发展与修订

1《中国药典》无菌及微生物限度检查法发展与修订

2医药产品的发展与挑战医药产品的发明与发展进步极大地改变了人类的命运独具特色的中药注射液特殊的医药环境使我国成为规模庞大的“吊瓶大国”注射用药品成为“高风险产品”3医药产品的发展与挑战微生物控制及检验成为高难度工作一百多年来人们努力提高在“有菌的环境”生产“无菌的产品”的能力，事实证明这一努力至今充满挑战。

★2006年7～8月发生了震惊全国的“欣弗事件”●直接死亡11人●企业倒闭●至今余震不断4医药产品的发展与挑战“欣弗事件”对我国的药品生产监管产生了深远的影响，直接推动了新的药典方案和新版GMP规定的出台。

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“欣弗事件”将永远成为无菌药品生产典型反面教材有人借此诋毁中国医药产品是在厕所生产的，理由是从未开封的欣弗中分离出了污水常见菌——肺炎克雷伯菌

显微图像单菌落5医药产品的发展与挑战2012年10月，美国新英格兰合成制药中心生产的注射用类固醇霉菌污染，造成数百人感染真菌脑炎，至年底统计死亡39人。在50支密封药瓶中检测出曲霉菌和突脐乳孢菌两种类型6药品微生物污染的反思在医药产品的发展过程中，尽管世界各国付出过惨重代价，实际上稍有不慎悲剧仍然可能重演。悲剧的避免!尊重规律，科学监管，全程无缝监控，严格落实各项管理、验证、检查和分析调查措施，切实降低无菌药品的微生物污染风险。7历版药典微生物检测方面所取得的进展74年、84年、90年卫生部《药品卫生学检查法》；86年卫生部颁布《药品卫生标准》1995年版药典首次收载微生物限度检查法2000年版药典首次收载微生物限度标准2005版＊将按剂型制定限度修订为按给药途径制定限度＊首次收载方法验证要求＊无菌检查培养时间与国外接轨2010版＊首次收载培养基适用性检查要求＊强调对微生物检验过程的验证及过程控制＊部分品种特别是抗生素品种的无菌检查法由附录走入了各论8中国药典2010年版的框架组成无菌检查法微生物限度检查法灭菌法抑菌效力检查法指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则药品微生物限度检查法应用指导原则药品微生物实验室规范指导原则9修订背景欧、美、日等主要药典均收载了协调一致的微生物检查法和限度标准，由于历史原因，我国目前的微生物限度检查体系与国际相比存在差距，这一差距对于目前我国企业产品出口造成很大的障碍，也对我国的微生物质量控制造成很大困惑。10修订背景虽然中国目前不是ICH的成员国，而是以观察员的身份进入，但中国与国外制药行业交往日益增多，中国药品要想进入国际市场，药品的检验方法和标准与ICH保持一致，势在必行。112015版药典修订的具体原则检验方法与国外药典进一步协调；已有的指导原则实用化，通过科研解决指导原则实用化问题；增加新的指导原则，特别是对与企业过程控制相关的指导原则。

122015版药典无菌及微生物限度检查法目标建立统一的质量技术要求，保持各方药典科技水平一致，保证用药安全、有效。质量控制、检验技术、检验标准等减少国际贸易的障碍。统一医药产品进入国际市场的技术门槛，促进国际间药品在同一技术平台的公平竞争。

132015版药典无菌及微生物限度检查法化学药品与生物制品：★与协调案统一★与国际先进水平同步发展具体目标中药：

★加大科研投入，在方法上与协调案统一，在项目、限度等方面制定与中药相适应的目标。

★以我为主，引领国际发展。142015版药典无菌及微生物限度检查法修订内容修订后的中国药典微生物检验系统成为一个较完备的标准体系，将收载15个左右的微生物检查法和指导原则。修订后的中国药典微生物检测系统与国外完全一致。对实验环境进行了重大修订。

15无菌检查实验室环境规定的修订修订依据及意义：2010年版GMP中附录一《无菌药品》和附录三《生物制品》中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级；无菌检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求。 2010年版2015年版应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离系统进行应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区域内或隔离系统中进行16无菌检查法的培养基系统培养体系的差异是导致中国药典无菌检查与国外药典无菌检查的系统性差异，从而带来结果之间的不确定性及不可比性。这是我国药典无菌检查法必须关注的问题！

药典USP/EP/JP中国药典2010及之前版本分类依据按营养和培养条件分按微生物类别分质控分类需气、厌气菌细菌、真菌检验体系与广谱的培养条件对应人为地选择培养评价严谨易误导结果判断或造成漏检17无菌检查培养基及其有关内容的修订无菌检查是一个定性试验，根据检查方法，要求所用培养基具有广谱的促菌生长能力，而不是也不可能一开始就对可能污染的微生物分类进行培养。为此，各国药典无菌检查用培养基都有一个不断改进至基本确定的发展过程。1950年美国药典第十六章已确定使用硫乙醇酸盐流体培养基(FTG)和胰酪大豆胨液体培养基(TSB)现USP、BP、EP、JP及ICH均规定使用硫乙醇酸盐流体培养基(FTG)和胰酪大豆胨液体培养基(TSB)但在我国长期的微生物分类培养观念下，认为改良马丁培养基(MM)更适用于真菌检查。182011年药典会微生物专业委员会立题对无菌检查用培养基进行了研究——《国产胰酪大豆胨培养基和改良马丁培养基的微生物促生长能力考察》对国产的3个厂家的MM培养基和3个厂家的TSB培养基与BD公司的TSB培养基进行了系统对比实验。19实验菌株细菌：藤黄微球菌[CMCC(B)28001]枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]克氏库克菌（北京所参加国际微生物鉴定所得）真菌：黑曲霉[CMCC(F)98003]腊叶芽枝霉[CMCC(F)7702]一株从样品或环境中分离的霉菌207个实验室的实验结论经统计分析表明：国产胰酪大豆胨液体培养基(TSB)和改良马丁培养基(MM)的促菌生长能力无显著性差异。国产胰酪大豆胨液体培养基(TSB)和改良马丁培养基(MM)适宜生长的微生物种群（广谱性）无显著性差异。国产的两种培养基不比BD公司生产的胰酪大豆胨液体培养基(TSB)质量差。212015版无菌检验用培养基的修订2010年版2015年版硫乙醇酸盐流体培养基30~35℃；20~25℃（三部）改良马丁培养基置23～28℃培养硫乙醇酸盐流体培养基30~35℃；20~25℃（生物制品两种温度）胰酪大豆胨肉汤培养基（TSB)置20～25℃培养选择性培养基0.5%葡萄糖肉汤培养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基选择性培养基0.5%葡萄糖肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基222015版无菌检查法修订增订了无菌检查法所用培养基的性能定义“硫乙醇酸盐流体培养基（FTG）是厌氧菌检查的首选培养基，同时也可用于需气菌检查。”“胰酪大豆胨液体培养基（TSB）适用于真菌和需气菌的检查。”——即某种污染了需气菌的供试品，无论被接种在硫乙醇酸盐流体培养基（FTG）中还是被接种在胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中均可被检出。意义：纠正了微生物学检查中长期存在的对微生物分类培养的概念，提高污染微生物的检出率，与先进国家药典保持一致。23根据培养基的调整所做的相关调整由TSB替代MM两种培养基接入试验菌的调整各菌接种的培养基调整培养基修订培养基灵敏度检查及方法适用性试验中的修订菌液制备用培养基的修订硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（大肠埃希菌）、生孢梭菌胰酪大豆胨液体培养基：枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉24三部药典无菌检查方法的整合修订整合中的焦点：三部无菌检查法中规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基必须分成双份，分别置30~35℃、20~25℃两个温度下培养。以致在取样量、检验量、接种方式、培养温度、阳性对照试验等方面存在与二部不一致的规定。25国际上生物制品无菌检查法的情况美国FDA（May2001）和欧盟（March1999）均早已接受药典无菌检查法适用于生物技术产品及生物制品（见ICHQ6B生物技术产品/生物制品检定规程及标准）。USP、EP、BP、JP及ICH的无菌检查法中均没有对生物制品作出特殊的规定。26分歧出现在我国对WHO6号规程的引用上。从可以查到的《中国生物制品规程》1979年版开始，规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基双份置双温度下分别培养。这一规定一直被延续到2010年版三部的无菌检查法，成为长达35年的我国生物制品无菌检查法的特殊规定。

27整合调查据反映，历史上个别地区在生物制品无菌检查中曾经发现个别品种在20~25℃培养的硫乙醇酸盐流体培养基中有菌生长的情况（但未作鉴定和溯源明确是什么菌）。从微生物适宜培养条件分析嗜热型需氧菌适宜生长温度为45~58℃；嗜温型需氧菌适宜生长温度为20~44℃；嗜冷型需氧菌适宜生长温度为10~18℃；疑点和疑问：阳性产品实验操作中是否有确保无污染的证明？是否存在未知的厌氧菌必须在20~25℃培养才能生长？在胰酪大豆胨液体培养基20~25℃下培养能不能被检出？28修订原则以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大纲三部药典必须整合的要求进行，以二部为基础，在检验数量、检验量、阳性对照样品量、阳性对照试验方法、培养温度等方面互相兼顾，作原则性要求而不作具体细则规定。致力于今后逐步统一完善。

29无菌检查法其他主要的修订2010年版2015年版薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般过滤器。薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。直接接种法即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。即取……;除生物制品外，一般样品两种培养基接种的支/瓶数相等；生物制品硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2:1不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量接种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天。不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量接种至同种新鲜培养基中，培养3天。30312015年版中国药典微生物限度检查法修订非无菌药品微生物限度检查：微生物计数法非无菌药品微生物限度检查：控制菌检查法非无菌药品微生物限度标准参照USP35版和EP7.0版对微生物限度检查法收载形式进行了修订，将其分为三个附录：32微生物限度检查法实验环境的变化2010年版2015年版应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内进行。应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不低于B级单向流空气区域内进行。总的原则：无外源性微生物污染样品样品的微生物检测环境不低于样品的生产环境33微生物限度检查法技术方法适用范围变化2010年版2015年版系检查非灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法◆微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数◆明确规定本检查法不适用于活菌制剂的检查◆明确规定本检查法可采用替代检查方法，包括自动化检测方法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。嗜温型微生物最适生长温度为20℃~44℃（25℃~43℃）金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌最适生长温度为37℃白色念珠菌、黑曲霉最适生长温度为28℃34微生物限度检查法试剂和试药的修订试剂和试药中和剂、灭活剂和表面活性剂均应对微生物无毒性，其相互间具有相容性，有利于样品中微生物均匀分布。稀释液pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；pH7.2无菌磷酸盐缓冲液；pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）；pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠溶制剂）；胰酪大豆胨液体培养基★不限于上述稀释液（如0.9%无菌氯化钠溶液）35微生物限度检查计数法修订前大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验菌株修订后铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉36微生物限度检查计数法培养基和试验菌的修订2010年版2015年版营养琼脂：

大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌玫瑰红钠琼脂：

白色念珠菌黑曲霉胰酪胨大豆琼脂：

金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌白色念珠菌黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂：

白色念珠菌黑曲霉37微生物限度检查计数法培养温度和时间的修订2010年版2015年版细菌数营养琼脂

30~35℃3天霉菌及酵母菌数玫瑰红钠琼脂

23~28℃5天需氧菌总数胰酪胨大豆琼脂

30~35℃3~5天霉菌及酵母菌数沙氏葡萄糖琼脂

20~25℃5~7天38微生物限度检查计数法接种方法的修订2010年版2015年版1、平皿倾注法2、薄膜过滤法1、平皿法（包括倾注法和涂布法），明确可使用直径较大的平皿，且培养基的用量应相应增加。2、薄膜过滤法3、最可能数（Most-Probable-Number,简称MPN）。MPN法用于微生物计数时精密度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品可能是更适合的方法。MPN法仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，且不适用于霉菌计数。39微生物限度检查计数法方法的修订2010年版2015年版术语变化：计数方法验证细菌计数法用三种菌种进行验证菌液加入方式：平皿计数验证时菌液和供试液同时加入平皿，加菌量10~100cfu术语变化：计数方法适用性试验总需氧菌计数法用五种菌种试验菌液加入方式：菌液加入供试液中，使每ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu,且所加菌液的体积不超过供试液体积的1%。40适用性试验加入方式举例：各试验组溶液分装5份每份9.9ml+0.1ml金黄色葡萄球菌液+0.1ml铜绿假单胞菌液+0.1ml枯草芽孢杆菌液+0.1ml白色念珠菌液+0.1ml黑曲霉菌液41微生物限度检查计数法检测项目及结果判断的修订2010年版2015年版细菌数——营养琼脂培养基霉菌和酵母菌数——玫瑰红钠琼脂培养基酵母菌数——酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基需氧菌总数——生长在胰酪胨大豆琼脂培养基上所有菌落（包括霉菌和酵母菌）霉菌和酵母菌总数——指生长在沙氏葡萄糖琼脂培养基上的所有菌落（包括细菌菌落数）。回收率：70%以上回收率：0.5-2（50%-200%）42微生物限度检查计数法结果判断有计数干扰情况时的修订2010年版2015年版若营养琼脂上生长霉菌与酵母菌、玫瑰红钠上生长细菌，则分别点计霉菌和酵母菌、细菌数。然后将营养琼脂上霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠上细菌数与玫瑰红钠上霉菌和酵母菌数或营养琼脂上细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中菌数为计数结果。若因沙氏葡萄糖琼脂上生长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素)的沙氏葡萄糖琼脂或选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂）。43微生物限度检查计数法结果判断的修订2010年版2015年版供试品的细菌数、霉菌数和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以三次结果的平均值报告菌数。无相关内容描述，因微生物试验的特殊性，在实际操作过程中应依据附录《药品微生物实验室质量管理指导原则》对实验结果进行充分和全面的评价。44微生物限度检查计数法结果判断增订内容2010年版2015年版无各品种项下要求执行的微生物限度标准如下：101cfu可接受的最大限度为20；102cfu可接受的最大限度为200；103cfu可接受的最大限度为2000；依次类推.若供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。45微生物限度检查控制菌检查的修订2010年版2015年版大肠埃希菌大肠菌群沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌大肠埃希菌耐胆盐革兰氏阴性杆菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌46微生物限度检查控制菌检查的修订2010年版2015年版大肠菌群方法验证用大肠埃希菌进行验证耐胆盐革兰氏阴性杆菌用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌进行方法适用性试验加菌量：10～100cfu加菌量：不大于100cfu47微生物限度检查控制菌检查的修订2010年版2015年版◆传统的鉴别试验为主◆个体形态、菌体形态◆生理生化反应◆生态学特征◆血清学反应◆对噬菌体及抗生素的敏感性◆用传统的鉴别试验或采用其它适宜的方法进行鉴别◆分子生物学技术应用（溯源分析）482015版微生物限度标准的修订◆将2010版中国药典一、二、三部微生物限度标准项目进行对比、整合。◆采用一部的限度标准项目作为合并后限度标准的基础。修订思路◆与美、欧、日药典比较，修订中国药典的微生物限度标准。◆采用清晰直观的表格形式，按给药途径，分液体、固体性质，列出各类药品的限度标准。49修订后限度标准的总体结构及规定（共9项，4个表）1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。2、用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查规定3、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准（见表1）4、非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表1）5、非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表2）6、非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（见表3）7、中药提取物及中药饮片的微生物限度标准（见表4）8、有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准9、霉变、长螨者以不合格论限度标准50表1、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准及非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准表2、非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准表3、非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准表4、中药提取物及中药饮片的微生物限度标准需氧微生物总数（cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数（cfu/g或cfu/ml)控制菌药用原料、辅料103102未作统一规定需氧微生物总数（cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数（cfu/g或cfu/ml)控制菌中药提取物103102未作统一规定中药饮片未作统一规定未作统一规定不得检出沙门菌（10g)耐胆盐革兰阴性菌应小于104（1g)51微生物检测体系及药品微生物检验的关键点环境保证培养基保证药品微生物实验室规范指导原则洁净实验室微生物控制和监测指导原则无菌检查隔离系统指导原则SOP操作有效的方法方法适用性（验证）有效的结果可靠的结论结果判断无菌性检查灵敏度检查对照培养基药品微生物检验替代方法验证指导原则微生物检查法指导原则522015版药典修订的基本目标2015年版中国药典微生物检验标准体系将推动药品微生物实验室从一个简单的终产品检验实验室向微生物风险调查分析型实验室方向发展。案例介绍53氟康唑注射液生物负荷偏差调查及处理2011年7月，在进行趋势分析时，发现有5批氟康唑注射液灌装后生物负荷监测有超限趋势，经过初步评估后，负责污染问题的委员会决定启动偏差调查，查明导致产生污染的根本原因、确定和实施相关预防措施，并监测其有效性。54（1）确定调查范围：根据产品发生情况和调查时间，调查相关批号206个。（2）鉴定：根据细菌鉴定，氟康唑注射液瓶中的微生物有两种：一种为水里存在的微生物，一种为环境存在的微生物。（3）调查发生原因：一是注射用水连接管路在技术夹层中有一个低点，有存水；二是洗瓶间的一个空气过滤器检漏有问题。制定改正措施55改正措施1-管路坡度修正：管路用5%NaOH进行钝化、灭菌；灌装前增加一个过滤器；增加灌装前