Ⅱ型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型构建的关键技术与应用探索

n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热

小鼠模型构建的关键技术与应用探索

一、引言

1.1研究背景

登革病毒(Denguevirus,DENV)作为黄病毒科黄病毒属的成员，是一类由埃及伊蚊和白纹

伊蚊传播的单股正链RNA病毒。其危害不容小觑，能引发登革热(Denguefever,DF)、登

革出血热(Denguehemorrhagicfever,DHF)以及登革休克综合征(Dengueshock

syndrome,DSS)。近年来，受全球气候变暖等因素影响，蚊媒分布区域不断扩大，登革病

毒感染的流行呈现出持续上升的态势。世界卫生组织(WHO)估计，全球每年约有3900万

人感染登革病毒，其中约50万人会发展为临床患者，约2.5%的患者面临死亡风险。登革热

已在全球100多个国家和地区广泛流行，成为严重威胁人类生命健康的重大公共卫生句题，

在热带和亚热带地区尤为突出。

我国也是登革热的流行区之一，1978年广东佛山首次暴发登革热疫情后，四种登革病毒血清

型(DENV-1.DENV-2.DENV-3和DENV-4)在我国均有流行。此后，广东、广西、

海南等地间断性出现登革热流行，给当地居民的健康和生活带来了极大的影响。登革病毒感染

不仅导致患者身体不适，增加医疗负担，还对社会经济发展造成了一定的阻碍，如影响旅游

业、劳动力市场等C

尽管登革病毒感染带来了严重的危害，但目前针对登革病毒的研究仍面临诸多挑战。在致病机

理方面，虽然已知抗体依赖的感染增强作用(ADE)、细胞因子风暴、病毒毒力变异及宿主

基因背景等因素在重症发病机制中发挥重要作用，但具体的分子机制尚未完全阐明。在抗病毒

药物研发上，由于缺乏有效的动物模型，难以对药物的疗效和安全性进行准确评估，导致研发

进展缓慢。同样，登革疫苗的研究也因缺乏合适的动物模型而受到限制，目前尚无安全有效的

疫苗可供广讶使用C

动物模型在研究登革病毒致病机制、评估抗病毒药物和疫苗的有效性与安全性等方面起着不可

或缺的作用。通过动物模型，研究者可以模拟人类感染登革病毒的过程，深入探究病毒在体内

的复制、传播、致病机制以及机体的免疫反应等。在评估抗病毒药物时，可以直观地观察药物

对病毒感染的抑制效果、对机体病理变化的影响以及药物的安全性和毒副作用。对于疫苗研

究，动物模型能够帮助判断疫苗的免疫原性，评估疫苗接种后机体产生的免疫应答是否能够有

效抵御病毒的攻击，以及疫苗的长期保护效果等。因此，建立合适的登革病毒动物模型对于推

动登革病毒相关研究的发展，开发有效的防治措施具有至关重要的意义。

1.2国内外研究现状

在登革病毒研究领域，n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型的建立一直是研究的

重点和热点。国内外众多学者围绕这两个方面展开了深入的研究，取得了一系列有价值的成

果。

在n型登革病毒小鼠适应株的研究上，国外学者早在20世纪80年代就开始尝试通过连续传

代的方法，将野生型n型登革病毒在小鼠体内进行适应性培养。例如，［具体文献1］的研究

团队通过将n型登革病毒多次颅内接种于乳鼠，成功获得了能够在小鼠休内稳定复制的适应

株。该适应株在小鼠体内的病毒血症水平较高，且能够引起小鼠明显的病理变化，为后续的研

究提供了重要的实验材料。国内学者也在这方面进行了积极的探索，［具体文献2］利用

C57BL/6小鼠，通过腹腔注射的方式，对II型登革病毒进行连续传代，筛选出了具有良好感

染性和致病性的小鼠适应株。这些研究为进一步了解n型登革病毒在小鼠体内的感染机制、

致病过程以及免疫反应等提供了有力的支持。

对于重症登革热小鼠模型的建立，国外研究相对较为深入。一些研究团队通过使用免疫缺陷小

鼠，如AG129小鼠（缺乏干扰素a/B和Y受体），感染H型登革病毒，成功构建了重症登

革热小鼠模型。在［具体文献3］的研究中，AG129小鼠感染II型登革病毒后，出现了体重下

降、血小板减少、出血倾向以及多器官功能损伤等类似于人类重症登革热的症状，并且通过组

织病理学检查发现小鼠肝脏、脾脏、肾脏等器官存在明显的病理改变，为研究重症登革热的发

病机制提供了有效的模型。国内学者则结合中医理论，尝试构建病证结合的重症登革热小鼠模

型。［具体文献4］以BALB/c小鼠为对象，在感染H型登革病毒的基础上，通过模拟湿热环

境、给予高糖高脂饮食等方法，诱导小鼠出现湿热证，成功建立了登革病毒感染湿热证小鼠模

型。该模型不仅表现出登革病毒感染的症状，还具有中医湿热证的特点，为从中医角度研究重

症登革热的发病机制和治疗方法提供了新的思路.

尽管国内外在n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型的建立方面取得了一定的进

展，但仍存在一些不足之处。现有小鼠适应株在病毒的稳定性、致病性以及与人类感染的相关

性等方面还需要进一步优化,部分适应株在连续传代过程中可能出现病毒毒力下降或变异的情

况，影响实验结果的重复性和可靠性。一些模型在模拟人类重症登革热的病理生理过程上还不

够全面和准确，不能完全反映人类疾病的复杂性。此外，目前的模型大多侧重于研究病毒的致

病机制，对于抗病毒药物和疫苗的研发，还需要建立更加符合临床需求的动物模型，以提高药

物和疫苗研发的效率和成功率。

1.3研究目的与意义

本研究旨在通过一系列实验操作，成功建立n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模

型。具体而言，将野生型n型登革病毒在小鼠体内进行连续传代，筛选出能够稳定感染小鼠

且具有较高致病性的小鼠适应株，明确其在小鼠体内的病毒复制特性、致病规律以及免疫反应

特征。在此基础上，利用获得的小鼠适应株，结合特定的小鼠品系（如免疫缺陷小鼠或通过

特殊处理增强易感性的小鼠；,构建重症登革热小鼠模型，使其能够模拟人类重症登革热的主

要病理生理过程，包括血小板减少、出血倾向、多器官功能损伤等症状以及相应的组织病理学

变化。

这两种模型的成功建立具有重要的理论与实践意义。从理论层面来看，n型登革病毒小鼠适

应株的建立有助于深入探究n型登革病毒在小鼠这一模式生物体内的感染机制、病毒与宿主

细胞的相互作用过程以及病毒变异规律等，为全面理解登革病毒的生物学特性提供重要的实验

依据，进一步丰富和完善登革病毒致病的理论体系。重症登革热小鼠模型则为研究重症登革热

的发病机制提供了关键的工具，通过该模型可以深入研究抗体依赖的感染增强作用

（ADE）、细胞因子风暴、病毒毒力变异及宿主基因背景等因素在重症发病过程中的具体作

用机制，揭示重症登革热发生发展的分子生物学基础，为开发针对性的治疗策略提供理论指

导。

在实践应用方面，这两种模型为抗病毒药物和疫苗的研发提供了不可或缺的实验平台,对于抗

病毒药物研发，可利用小鼠适应株感染小鼠，观察药物对病毒复制的抑制效果、对小鼠病情的

改善作用以及药物的安全性和毒副作用等，从而快速有效地筛选和评估潜在的抗病毒药物，加

速药物研发进程，提高研发成功率。在疫苗研究中，通过对小鼠模型进行疫苗接种，检测疫苗

诱导的免疫应答水平、免疫记忆的持久性以及对病毒攻击的保护效果等，能够准确评估疫苗的

免疫原性和保护效力，为登革疫苗的优化和临床应用提供重要的参考依据，有助于推动安全有

效的登革疫苗的问世，为登革热的防控提供有力的武器。这两种模型的建立对于登革热的基

础研究和临床防治具有重要的推动作用，有望为全球登革热防控工作做出积极贡献。

二、n型登革病毒小鼠适应株的建立

2.1实验材料准备

实验动物选用SPF级C57BL/6小鼠，购自［具体动物供应商名称］。该品系小鼠遗传背景清

晰、免疫反应稳定，是病毒感染研究中常用的实验动物。小鼠饲养于温度（23±2）℃、相对

湿度（50±10）%的SPF级动物房，自由摄食和饮水，适应性饲养1周后用于实验。

n型登革病毒毒株选用临床分离株，该毒株分离自［具体地区］的登革热患者血清，由［提供单

位名称］提供。毒株保存于-80℃冰箱，使用前在37℃水浴中快速解冻。临床分离株能够更真

实地反映病毒在自然感染状态下的生物学特性，为后续的小鼠适应株建立提供了可靠的原始材

料。

细胞系采用C6/36白纹伊蚊细胞，购自中国典型培养物俣藏中心。C6/36细胞对登革病毒具

有较高的敏感性，是登革病毒培养和研究的常用细胞系。细胞培养于含10%胎牛血清

（FBS,Gibco公司）、100U/mL青霉素和100pg/mL链霉素（Solarbio公司）的RPMI

1640培养基（Gibe。公司）中，置于28℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数期时

用于病毒培养和感染实验。

实验试剂包括病毒RNA提取试剂盒（Qiagen公司）、逆转录试剂盒（TaKaRa公司）、

PCR扩增试剂盒（TaKaRa公司）、胎牛血清（Gibco公司）、RPMI1640培养基（Gibe。

公司）、青霉素-链霉素溶液（Solarbi。公司）、DEPC水（Sigma公司）等。这些试剂均为

进口或国产优质产品，具有高纯度和稳定性，能够满足实验的精确性和重复性要求。

仪器设备有CO2培养箱（Therm。FisherScientific公司）、超净工作台（苏州净化设备有限

公司）、高速冷冻离心机（Eppendorf公司）、PCR仪（Bio-Rad公司）、凝胶成像系统

（Bio-Rad公司）、酶标仪（ThermoFisherScientific公司）、倒置显微镜（Olympus公

司）等。所有仪器设备在使用前均进行校准和调试，确保其性能稳定、运行正常，为实验的顺

利进行提供了有力的保障。

2-2病毒培养与扩增

将复苏的C6/36细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，加入适量含10%胎牛血清、100U/mL青

霉素和100pg/mL链霉素的RPMI1640培养基，置于28℃、5%CO2培养箱中培养。待细

胞生长至对数期，细胞密度达到80%-90%融合时，进行病毒接种。

从-80℃冰箱取出n型登革病毒临床分离株，在37℃水浴中快速解冻后，用无血清RPMI

1640培养基将病毒稀释至适当浓度。弃去培养瓶中的细胞培养基，用PBS冲洗细胞2-3

次，以去除残留的血清和杂质。向培养瓶中加入稀释好的病毒液，确保病毒液均匀覆盖细胞

单层，置于28℃培养箱中吸附1-2小时，期间每隔15・30分钟轻轻摇晃培养瓶，使病毒与

细胞充分接触。

吸附结束后，弃去病毒液，加入含2%胎牛血清、100U；mL青霉素和100pg/mL链霉素的

RPMI1640维持培养基，继续置于28℃、5%CC）2培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察

细胞病变效应（Cytopathiceffect,CPE）,记录细胞形态变化、病变程度和病变范围。当细

胞出现明显的病变，如细胞变圆、皱缩、脱落等，且病变程度达到70%-80%时，收获病

毒O

将含有病毒的细胞培养物反复冻融3次，使细胞破裂释放病毒。将冻融后的细胞培养物转移

至离心管中，4℃、12000r/min离心10分钟，取上清液，即为扩增后的n型登革病毒液。

将病毒液分装至无菌冻存管中，每管0.57mL,保存于-80℃冰箱备用。在病毒培养与扩

增过程中，严格遵守无菌操作原则，防止细菌、真菌等微生物污染。定期对培养细胞进行支

原体检测，确保细胞无污染，以保证病毒培养的质量和实验结果的可靠性。

2.3小鼠感染与适应过程

选择6-8周龄的SPF级C57BL/6小鼠，随机分为多个实验组和对照组，每组10-15只小

鼠。实验组小鼠分别通过腹腔注射、颅内注射和皮下注射等不同途径接种扩增后的n型登革

病毒液，对照组小鼠接种等量的无菌PBS。接种病毒液的剂量设置多个梯度，如1x106

PFU（空斑形成单位）/只、5x106PFU/只、1x1（rPFU/只等，以确定最佳的感染剂

量。

接种后，每天定时观察小鼠的发病情况，详细记录小鼠的症状和体征变化，包括精神状态、活

动能力、饮食饮水情况、体温、体重变化、有无出血倾向（如口鼻出血、皮肤瘀斑等）以及是

否出现死亡等。使用电子天平精确测量小鼠的体重，每天测量1-2次，并记录体重的增减情

况。对于出现异常症状的小鼠，及时进行拍照和详细的症状描述，以便后续分析。

在感染后的不同时间点（如第1天、第3天、第5天、第7天、第10天等），每组随机选

取3・5只小鼠进行安乐死，采集小鼠的血液、肝脏、脾脏、肾脏、脑组织等组织样本。血液

样本通过心脏采血的方式收集，置于抗凝管中，用于检测病毒血症水平、血常规指标（如白细

胞计数、血小板计数等）以及血清中相关细胞因子的含量。组织样本一部分用4%多聚甲醛

固定，用于制作石蜡切片，进行组织病理学检查，观察组织细胞的病变情况，如细胞坏死、炎

症细胞浸润等；另一部分保存于-80℃冰箱，用于病毒RNA提取和定量分析，采用实时荧光

定量PCR技术检测病毒在组织中的复制水平。

将初次感染后存活的小鼠，在恢复2-3周后，再次接种用同剂量或更高剂量的n型登革病

毒，观察小鼠的二次感染情况和发病特征。重复上述感染、观察和样本采集过程，连续进行

多代（一般为5・10代）的病毒传代。在每一代传代过程中，对病毒的感染性、致病性以及

在小鼠体内的复制特性等进行详细的分析和记录。通过多代传代，筛选出能够稳定感染小鼠

且具有较高致病性的n型登革病毒小鼠适应株。

2.4适应株筛选与鉴定

在连续传代过程中，从感染小鼠的血液、肝脏、脾脏等蛆织中分离病毒。将采集的组织样本剪

碎后，加入适量的无血清RPMI1640培养基，使用组织研磨器充分研磨，制成匀浆。将匀浆

转移至离心管中，4℃、12000r/min离心10分钟，取上清液接种到C6/36细胞中进行病毒分

离。将接种后的C6/36细胞置于28℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变效应，当

细胞出现明显病变时，收集细胞培养物，即为分离得到的病毒。

采用分子生物学方法对分离得到的病毒进行鉴定。提取病毒RNA,使用逆转录试剂盒将其逆

转录为CDNA。以cDNA为模板，利用登革病毒特异性GI物进行PCR扩增，弓I物设计根据

II型登革病毒的保守基因序列，如E基因、NS1基因等。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳

分离后，在凝胶成像系统下观察，若出现与预期大小相符的条带，则初步确定为H型登革病

毒。进一步对PCR产物进行测序，将测序结果与GenBank中已有的n型登革病毒序列进

行比对分析，确认其为n型登革病毒，并确定其基因序列的变异情况。

运用血清学方法对适应株进行鉴定。采用间接免疫荧光试验（IFA）,将分离得到的病毒感染

C6/36细胞，待细胞出现病变后，用4%多聚甲醛固定细胞。滴加n型登革病毒特异性抗体

（鼠源或兔源），37℃孵育1小时，PBS冲洗3次。再滴加荧光素标记的二抗（如兰抗鼠或

羊抗兔IgG-FITC）,37℃蜉育30分钟，PBS冲洗3次。在荧光显微镜下观察，若细胞内出

现特异性荧光，则表明病毒为n型登革病毒。也可采用酶联免疫吸附试验（ELISA）,使用

n型登革病毒特异性抗原包被酶标板，加入待检病毒样本，孵育后加入n型登革病毒特异性

抗体，再加入酶标二抗，最后加入底物显色o通过酶标仪测定吸光度值，根据吸光度值判断

病毒是否为n型登革病毒以及病毒的含量。

对筛选得到的小鼠适应株进行稳定性评估。将适应株在小鼠体内连续传代5-10次，每次传

代后检测病毒的感染性、致病性以及在小鼠体内的复制特性。比较不同代次病毒的感染剂

量、引起小鼠发病的症状和体征、病毒血症水平以及组织中的病毒载量等指标，若这些指标在

连续传代过程中保持相对稳定，则表明适应株具有较好的稳定性。分析适应株的遗传特征，

对不同代次的病毒进行全基因组测序，比较基因序列的变化情况。通过生物信息学分析，确

定适应株在传代过程中是否发生了基因变异，以及变异对病毒生物学特性的影响。如分析变

异位点是否位于病毒的关键基因区域，如编码结构蛋白或非结构蛋白的基因，以及这些变异是

否导致了氨基酸序列的改变，进而影响病毒的感染性、致病性和免疫原性等。

三、重症登革热小鼠模型的建立

3.1建模思路与策略

重症登革热的发病机制极为复杂，是多种因素相互作用的结果。病毒因素在其中起着关键作

用，登革病毒通过伊蚊叮咬进入人体后，首先在单核-巨噬细胞系统中进行增殖。当病毒数量

达到定程度时，便会进入血液循环，形成第次病毒血症。随后，病毒再次侵入单核-巨噬

细胞和淋巴组织进行复制，进而形成第二次病毒血症。在这个过程中，登革病毒与血液中已

存在的抗登革病毒抗体结合，形成免疫复合物，这一复合物会激活补体系统，导致血管通透性

增加，血浆外渗，血液浓缩。病毒还会抑制骨髓.使得血小板和白细胞减少，从而出现出血倾

向。

抗体依赖的感染增强作用(ADE)也是重症登革热发病的重要因素。机体在感染登革病毒后

会产生特异性抗体，婴儿还可通过胎盘获得抗体，这些抗体具有弱的中和作用和强的促进作

用，被称为促进性抗体。它能够促进登革病毒与单核细胞或巨噬细胞表面的Fc受体结合，促

使这些细胞释放活性因子，导致血管通透性进一步增加，血浆蛋白从微血管中渗出，引发血液

浓缩和休克。凝血系统被激活会引起弥散性血管内凝血，这不仅会加重休克症状，还会与血

小板减少共同导致各系统的出血。

病毒毒力变异也不容忽视，不少初次感染的患者也会出现重症登革热的临床经过，且血清反应

属于初次感染类型，儿童占多数，这表明登革病毒有可能通过变异产生毒力更强的病毒株，从

而引发重症登革热。免疫异常也是重症登革热发病的重要环节，免疫细胞本身可释放一系列

细胞因子，造成细胞因子风暴，加重免疫病理损伤，出现感染加重、休克、循环衰竭和出血等

表现。

基于上述发病机制，构建重症登革热小鼠模型时需综合考虑多个因素。在小鼠品系的选择上，

免疫缺陷小鼠是较为理想的选择，如AG129小鼠，其缺乏干扰素。/0和Y受体，这使得它们

对登革病毒的免疫反应较弱，更容易感染病毒并发展为重症。AG129小鼠感染登革病毒后，

能够出现与人类重症登革热相似的症状，如体重下降、血小板减少、出血倾向以及多器官功能

损伤等。也可选择通过特殊处理增强易感性的小鼠品系，如给予小鼠免疫抑制剂，抑制其免

疫系统功能，使其更容易感染登革病毒并出现重症症状。

感染途径的选择对模型的成功构建也至关重要。常见的感染途径包括腹腔注射、颅内注射和皮

下注射等。腹腔注射操作相对简便，能够使病毒迅速进入小鼠体内的血液循环系统，从而引

发全身性感染，是构建重症登革热小鼠模型常用的感染途径之一。颅内注射可以直接将病毒

注入小鼠的中枢神经系统，能够更有效地模拟登革病毒对神经系统的侵袭，有助于研究重症登

革热的神经系统症状。皮下注射则可以模拟病毒通过蚊虫叮咬进入人体的自然感染途径，但

病毒的扩散速度相对较慢，可能需要较高的病毒剂量才能引发重症症状。

病毒剂量的确定同样关键，需要进行预实验来摸索合适的剂量o剂量过低可能无法使小鼠出

现重症症状，剂量过高则可能导致小鼠迅速死亡，无法观察到完整的疾病发展过程。一般来

说，可设置多个病毒剂量梯度，如1x106PFU/只、5x106PFU/只、1x107PFU/只等，

通过观察小鼠的发病情况、病毒血症水平、组织病理学变化等指标，确定最佳的病毒感染剂

量。在感染过程中，还需密切观察小鼠的健康状况，记录小鼠的症状和体征变化，如精神状

态、活动能力、饮食饮水情况、体温、体重变化、有无出血倾向以及是否出现死亡等。

3.2实验动物选择与处理

在构建重症登革热小鼠模型时，小鼠品系的选择至关重要。综合考虑登革病毒的感染特性、小

鼠的免疫反应以及与人类重症登革热病理生理过程的相似性，本研究选用AG129小鼠作为实

验动物。AG129小鼠缺乏干扰素和丫受体，其免疫系统存在缺陷，对病毒的免疫防御能

力较弱，这使得它们更容易感染登革病毒，并且在感染后能够出现与人类重症登革热相似的症

状和病理变化。已有研究表明，AG129小鼠感染n型登革病毒后，会出现明显的体重下

降、血小板减少、出血倾向以及多器官功能损伤等症状，这些症状与人类重症登革热的临床表

现导）度吻合O

为了确保实验结果的准确性和可靠性，对小鼠进行了一系列预处理。将从动物供应商处购买的

AG129小鼠饲养于温度（23±2）°C、相对湿度（50±10）%的SPF级动物房，让小鼠自由

摄食和饮水，进行为期1周的适应性饲养。适应性饲养能够使小鼠适应新的环境，减少环境

因素对实验结果的干扰。在适应性饲养期间，密切观察小鼠的精神状态、活动能力、饮食饮水

情况以及粪便形态等，确保小鼠健康状况良好，无任何疾病症状。若发现有小鼠出现异常情

况，如精神萎靡、食欲不振、腹泻等，及时进行隔离和治疗，避免对其他小鼠造成影响。

为了进一步增强小鼠对登革病毒的易感性，在感染病毒前对小鼠进行了免疫调节处理。向小

鼠腹腔注射环磷酰胺，剂量为50mg/kg体重，连续注射3天。环磷酰胺是一种常用的免疫

抑制剂，能够抑制小鼠的免疫系统功能，降低其对病毒的免疫防御能力，从而使小鼠更容易感

染登革病毒并出现重症症状。在注射环磷酰胺期间，密切观察小鼠的反应，如是否出现呕

吐、腹泻、体重下降等不良反应。若不良反应较为严重，适当调整环磷酰胺的剂量或停止注

射，确保小鼠的健康状况能够满足实验要求。免疫调节处理后的小鼠，在进行病毒感染实验

前，需再次观察其健康状况，确认小鼠的免疫系统已受到抑制，且无其他异常情况后，方可进

行下一步实验。

3-3病毒感染与模型诱导

将经过预处理的AG129小鼠随机分为实验组和对照组，每组15-20只小鼠。实验组小鼠用

于感染口型登革病毒，对照组小鼠则接种等量的无菌PBS。实验过程中，严格遵循动物实

验伦理规范，确保小鼠在人道的条件下接受实验操作。

在病毒接种前，将保存于-80℃冰箱的H型登革病毒小鼠适应株取出，在37℃水浴中快速解

冻，并使用无菌的PBS将病毒稀释至合适的浓度。根据预实验的结果，确定最佳的病毒接种

剂量为5x106PFU/只。这一剂量既能保证小鼠在感染后出现典型的重症登革热症状，又能

避免因剂量过高导致小鼠迅速死亡，影响后续的实验观察和数据收集。

采用腹腔注射的方式对实验组小鼠进行病毒接种。具体操作如下：将小鼠固定在实验台上，

使用75%酒精棉球对小鼠腹部进行消毒，以防止细菌感染。用1mL无菌注射器吸取稀释好

的病毒液，将注射器针头以45。角缓慢刺入小鼠腹腔，注意避免损伤小鼠的内脏器官。缓慢

注入病毒液，确保病毒液均匀分布在小鼠腹腔内。注射完毕后，轻轻拔出针头，用棉球按压

注射部位片刻，以防止病毒液外漏。对照组小鼠则按照同样的操作方法接种等量的无菌

PBSo

在感染后的不同时间点（如第1天、第3天、第5天、第7天、第10天等），对小鼠进行

全面的观察和检测。每天定时观察小鼠的精神状态，记录小鼠是否出现精神萎靡、嗜睡等症

状；观察小鼠的活动能力，判断小鼠是否行动迟缓、活动量减少；监测小鼠的饮食饮水情况，

记录小鼠的进食量和饮水量是否下降；使用电子体温计测量小鼠的体温，观察体温是否出现异

常升高或降低；用电子天平精确测量小鼠的体重，记录体重的变化情况。对于出现异常症状

的小鼠，如口鼻出血、皮肤瘀斑、便血等，及时进行拍照和详细的症状描述，以便后续分

析。

在感染后的第3天，通过眼眶取血的方式采集小鼠的血液样本，置于抗凝管中。采用全自动

血细胞分析仪检测小鼠的血常规指标,重点关注白细胞计数、血小板计数等指标的变化c血

小板减少是重症登革热的重要特征之一，通过监测血小板计数的变化，可以评估小鼠病情的发

展程度。使用实时荧光定量PCR技术检测小鼠血清中的病毒载量，以确定病毒在小鼠体内的

复制情况。将采集的血液样本离心，分离出血清，按照病毒RNA提取试剂盒的操作说明提取

血清中的病毒RNA。然后，使用逆转录试剂盒将病毒RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模

板，利用登革病毒特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增。根据扩增结果，计算出小鼠血清

中的病毒载量。

在感染后的第5天，每组随机选取3-5只小鼠进行安乐死，采集小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、

肺脏等组织样本。一部分组织样本用4%多聚甲醛固定，用于制作石蜡切片，进行苏木精-

伊红（HE）染色，在显微镜下观察组织细胞的病变情况，如细胞坏死、炎症细胞浸润、组织

水肿等。肝脏是登革病毒感染的重要靶器官之一，在重症登革热患者中，常出现肝脏功能损

伤和病理改变。通过观察肝脏组织的病理变化，可以了解病毒对肝脏的损伤程度。另一部分

组织样本保存于-80℃冰箱，用于检测病毒RNA和相关细胞因子的表达水平。采用实时荧光

定量PCR技术检测组织中的病毒RNA含量，以确定病毒在组织中的复制水平。使用酶联免

疫吸附试验（ELISA）检测组织匀浆中相关细胞因子的含量，如肿瘤坏死因子-a（TNF-

。)、白细胞介素-6(IL-6)等。这些细胞因子在重症登革热的发病过程中起着重要的作

用，通过检测它们的表达水平，可以进一步探究重症登革热的发病机制。

3.4模型评价指标与方法

临床症状的观察是评估重症登革热小鼠模型的重要依据。每天定时密切观察小鼠的精神状态，

记录小鼠是否出现精神萎靡,嗜睡、反应迟钝等症状，这些表现往往反映了小鼠神经系统受到

影响，与人类重症登革热患者可能出现的意识障碍等症状相对应。细致观察小鼠的活动能

力，判断其是否行动迟缓、活动量明显减少，这可能与病毒感染导致的机体虚弱、肌肉无力等

有关。饮食饮水情况也是关键指标，若小鼠进食量和饮水量显著下降，表明其消化系统可能

受到影响，这与人类患者在重症登革热时出现的食欲不振、恶心呕吐等症状类似。使用电子

体温计准确测量小鼠的体温，观察体温是否出现异常升高或降低，发热是登革热的典型症状之

一，而体温的异常变化也能反映小鼠病情的严重程度。每天用电子天平精确测量小鼠的体

重，记录体重的变化情况，体重下降是重症登革热小鼠模型常见的症状，体重的急剧下降往往

预示着病情的恶化。对于出现异常症状的小鼠，如口鼻出血、皮肤瘀斑、便血等，及时进行

拍照和详细的症状描述，这些出血症状是重症登革热的重要特征，通过对出血情况的观察和记

录，可以评估模型的有效性。

血液指标的检测能够为模型评价提供客观的数据支持。在感染后的特定时间点，通过眼眶取血

的方式采集小鼠的血液样本，置于抗凝管中，采用全自动血细胞分析仪精确检测小鼠的血常规

指标。重点关注白细胞计数、血小板计数等指标的变化，血小板减少是重症登革热的重要特

征之一，在人类患者中，血小板计数的降低会导致出血倾向增加，通过监测小鼠血小板计数的

变化，可以评估小鼠病情的发展程度。使用实时荧光定量PCR技术检测小鼠血清中的病毒载

量，以确定病毒在小鼠体内的复制情况。将采集的血液样本离心，分离出血清，按照病毒

RNA提取试剂盒的操作说明提取血清中的病毒RNA。然后，使用逆转录试剂盒将病毒RNA

逆转录为cDNA,以cDNA为模板，利用登革病毒特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增。

根据扩增结果，准确计算出小鼠血清中的病毒载量，病毒载量的高低反映了病毒在小鼠体内的

感染程度和复制活性。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中相关细胞因子的含量.

如肿瘤坏死因子(TNF-a),白细胞介素・6(IL-6：i等。这些细胞因子在重症登革热的

发病过程中起着重要的作用，它们的异常升高往往与炎症反应的加剧、组织损伤的加重以及细

胞因子风暴的形成有关，通过检测它们的表达水平，可以进一步探究重症登革热的发病机

制。

组织病理检查是从微观层面评估模型的关键手段。在感染后的第5天，每组随机选取3-5只

小鼠进行安乐死，迅速采集小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等组织样本。一部分组织样本立

即用4%多聚甲醛固定，用于制作石蜡切片。将固定好的组织样本进行脱水、透明、浸蜡、

包埋等处理，制成厚度为4・5pm的石蜡切片。对石蜡切片进行苏木精-伊红(HE)染色，

在显微镜下仔细观察组织细胞的病变情况，如细胞坏死、炎症细胞浸润、组织水肿等。肝脏

是登革病毒感染的重要靶器官之一，在重症登革热患者中，常出现肝脏功能损伤和病理改变，

通过观察肝脏组织的病理变化，可以了解病毒对肝脏的损伤程度。脾脏作为重要的免疫器

官，其病理变化也能反映机体的免疫反应和病毒感染情况。肾脏和肺脏的病理检查则有助于

了解病毒对其他重要器官的影响，以及是否出现多器官功能损伤。另一部分组织样本保存于-

80℃冰箱，用于检测病毒RNA和相关细胞因子的表达水平。采用实时荧光定量PCR技术检

测组织中的病毒RNA含量，以确定病毒在组织中的复制水平。使用酶联免疫吸附试验

(ELISA)检测组织匀浆中相关细胞因子的含量，进一步探究病毒感染对组织微环境的影响以

及组织细胞的免疫反应。

四、模型的应用与验证

4.1在病毒致病机制研究中的应用

利用建立的n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型，对n型登革病毒的致病机制

展开深入研究，从多个层面剖析病毒在小鼠体内的传播、复制和免疫应答过程。

在病毒传播方面，通过对感染不同时间点小鼠各组织器官的病毒分布检测，发现病毒首先在小

鼠的肝脏和脾脏中大量复制，随后逐渐扩散至肾脏、肺脏等其他器官。在感染早期(1-3

天)，肝脏和脾脏中的病毒载量迅速升高，表明这两个器官是病毒最初的主要感染和复制场

所。随着时间推移，在感染后5-7天，肾脏和肺脏等器官中的病毒载量也显著增加，说明病

毒已成功传播至这些器官。通过免疫组织化学技术，观察到病毒抗原在肝脏的肝细胞、脾脏

的巨噬细胞以及肾脏的肾小管上皮细胞等细胞中均有表达，进一步证实了病毒在这些组织器官

中的传播和感染。

对于病毒复制过程，采用实时荧光定量PCR技术，动态监测病毒在小鼠体内的复制水平变

化。结果显示，病毒在感染后的1-3天内处于快速复制阶段，病毒RNA拷贝数呈指数增

长。在感染第3天左右，病毒复制达到高峰，随后病毒载量逐渐下降。通过分析病毒基因组

的转录和翻译过程，发现病毒的非结构蛋白NS1、NS3和NS5在病毒复制过程中发挥着关键

作用。NS1蛋白参与病毒的复制起始和膜相关复制复合体的形成，NS3蛋白具有蛋白酶和解

旋酶活性，能够切割病毒多聚蛋白前体并促进病毒基因组的复制，NS5蛋白则是病毒的RNA

依赖的RNA聚合酶，直接负责病毒RNA的合成。

在免疫应答方面，检测小鼠感染病毒后血清中相关免疫细胞因子和趋化因子的表达水平。结

果表明，在感染早期，促炎细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素-6(IL-

6)和干扰素-Y(IFN-Y)等迅速升高，这些细胞因子能够激活免疫细胞，增强机体的免疫防

御能力。随着感染的进展，抗炎细胞因子如白细胞介素70(IL-10)的表达也逐渐增加，

以调节过度的免疫反应，避免免疫病理损伤。通过流式细胞术分析小鼠脾脏和血液中免疫细

胞的变化，发现CD4+T细胞和CD8+T细胞在感染后被激活并增殖，其中CD4+T细胞主

要分泌细胞因子，调节免疫应答，CD8+T细胞则具有细胞毒性，能够直接杀伤被病毒感染的

细胞。B细胞也被激活，产生特异性抗体，其中IgM抗体在感染早期迅速出现，随后IgG抗

体逐渐升高并持续存在。

研究还发现，抗体依赖的感染增强作用(ADE)在n型登革病毒致病过程中具有重要影响。

预先给小鼠注射亚中和剂量的n型登革病毒特异性抗体，然后再感染病毒，结果发现小鼠的

病情明显加重，病毒血症水平升高，组织器官的病理损伤加剧O通过体外实验，证实了ADE

作用的机制是抗体与病毒结合后，通过FC受体介导病毒进入巨噬细胞等免疫细胞，从而促进

病毒的感染和复制。

通过对n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型的研究，揭示了n型登革病毒在小

鼠体内的传播、复制和免疫应答规律，以及ADE等因素在致病过程中的作用机制，为深入理

解登革病毒的致病机制提供了重要的实验依据。

4.2在疫苗和药物研发中的验证

以建立的重症登革热小鼠模型为基础，对登革热疫苗和药物的有效性与安全性展开深入研究，

为相关疫苗和药物的研发提供了关键的实验依据。

在疫苗研发验证方面，将候选登革热疫苗分为不同的实莫组别，每组选取20-30只AG129

小鼠。按照预定的免疫程序对小鼠进行疫苗接种，一般采用肌肉注射或皮下注射的方式，设

置多个免疫剂量和免疫次数的组合。对照组小鼠则接种等量的生理盐水或安慰剂。在免疫后

的不同时间点，如第2周、第4周、第6周等，采集小鼠的血液样本，检测血清中特异性抗

体的水平。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IgG、IgM等抗体的含量，评估疫苗诱导的

体液免疫应答。利用流式细胞术分析小鼠脾脏和血液中T细胞、B细胞等免疫细胞的活化和

增殖情况，检测细胞因子如白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-Y(IFN-y)等的分泌水平，

以评估疫苗诱导的细胞免疫应答。

在完成疫苗接种和免疫应答检测后，对小鼠进行病毒攻毒实验o将n型登革病毒小鼠适应株

以合适的剂量(如5x106PFU/只)感染小鼠，观察小鼠的发病情况。每天记录小鼠的精神

状态、活动能力、饮食饮水情况、体温、体重变化以及是否出现出血倾向等症状。在感染后

的特定时间点，采集小鼠的血液和组织样本，检测病毒载量、血常规指标以及组织病理学变

化。通过比较疫苗接种组和对照组小鼠的发病情况和各项检测指标，评估疫苗的保护效力。

若疫苗接种组小鼠的发病率、死亡率明显低于对照组，病毒血症水平和组织病毒载量显著降

低，且病理损伤较轻，则表明疫苗具有一定的保护作用。

在药物研发验证中，将AG129小鼠随机分为实验组和对照组，每组15-20只小鼠。实验组

小鼠在感染H型登革病毒后，立即给予不同剂量的候选抗病毒药物，药物的给药途径根据药

物的性质和特点选择，如口服、腹腔注射或静脉注射等。对照组小鼠则给予等量的溶剂或安

慰剂。在给药后的不同时间点，如第1天、第3天、第5天等，采集小鼠的血液样本，检测

血清中的病毒载量，采用实时荧光定量PCR技术进行检测。同时，观察小鼠的临床症状变

化，记录体重、体温等指标。在感染后的第5天，每组随机选取3-5只小鼠进行安乐死，采

集肝脏、脾脏、肾脏等组织样本，进行组织病理学检查，观察药物对组织病变的改善情况。

通过分析小鼠的病毒载量变化、临床症状改善情况以及组织病理学变化，评估药物的抗病毒效

果和安全性。若实验组小鼠的病毒载量明显下降，临床症状得到缓解，组织病变减轻，且无

明显的药物不良反应，则表明该药物具有潜在的抗病毒活性。

4.3模型的优势与局限性分析

本研究成功建立的n型登革病毒小鼠适应株及重症登革孤小鼠模型在登革热研究中具有显著

优势。在模拟疾病过程方面，重症登革热小鼠模型能够较好地重现人类重症登革热的主要症状

和病理变化，如体重下降、血小板减少、出血倾向以及多器官功能损伤等。通过对小鼠感染

病毒后的临床症状观察、血液指标检测和组织病理检查，能够直观地了解疾病的发展进程，为

研究重症登革热的发病机制提供了真实可靠的实验模型。该模型具有良好的可重复性，在相

同的实睑条件下，能够稳定地诱导小鼠出现重症登革热的症状，实验结果具有较高的可靠性和

一致性，便于不同研究团队之间进行比较和验证。

这些模型为登革热的研究提供了高效的实验平台，在病毒致病机制研究中，能够深入探究病毒

在小鼠体内的传播、复制和免疫应答过程，有助于揭示登革病毒的致病奥秘。在疫苗和药物

研发方面，能够快速评估疫苗的免疫原性和保护效力，以及药物的抗病毒效果和安全性，大大

提高了研发效率，缩短了研发周期。模型的建立还为研究人员提供了丰富的实验数据和样本

资源，有利于开展多维度、深层次的研究工作。

然而，这些模型也存在一定的局限性。小鼠和人类在生理结构、免疫系统和代谢方式等方面存

在差异，导致小鼠模型不能完全准确地模拟人类登革热的发病过程。小鼠的免疫系统相对简

单，对登革病毒的免疫应答与人类存在差异，可能会影响对病毒致病机制和免疫反应的研究结

果。在病毒传播途径上，小鼠模型通常采用人工接种的方式感染病毒，与人类通过蚊虫叮咬

自然感染的方式不同，这可能会导致病毒在小鼠体内的感染和传播过程与人类存在差异。

登革病毒具有四种血清型（DENV・1、DENV-2、DENV-3和DENV・4）,本研究仅建立

了H型登革病毒相关模型，无法全面反映其他血清型病毒的感染特性和致病机制。不同血清

型的登革病毒在抗原性、致病性和免疫原性等方面存在差异，单一血清型的模型在研究登革病

毒的多样性和交叉免疫反应等方面存在局限性。此外，目前的模型主要侧重于研究病毒感染

的急性期，对于登革病毒感染后的慢性期和后遗症等方面的研究还相对较少，不能完全满足临

床研究的需求。

五、讨论

5.1模型建立过程中的关键问题与解决方法

在n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型的建立过程中，遇到了一系列关键问题，

通过采取针对性的解决措施和优化方法，确保了模型的成功建立。

病毒感染效率低是首先面临的挑战。由于小鼠并非登革病毒的天然宿主，其免疫系统对病毒具

有一定的抵抗力，导致病毒在小鼠体内的感染和复制较为困难。在最初的实验中，使用野生

型n型登革病毒直接感染C57BL/6小鼠，发现病毒血症水平较低，且感染后的小鼠发病症状

不明显。为解决这一问题，采用了连续传代的方法，将病毒在小鼠体内进行多次传代，使病

毒逐渐适应小鼠的体内环境。通过多代传代，筛选出了能够在小鼠体内稳定复制且具有较高

致病性的小鼠适应株。在传代过程中，密切监测病毒的感染性和致病性变化，不断调整传代

条件，如感染途径、感染剂量等，以提高病毒的感染效率。

小鼠死亡率高也是一个突出问题。在重症登革热小鼠模型的建立过程中，当使用较高剂量的病

毒感染小鼠时，部分小鼠会在感染后短时间内迅速死亡，无法观察到完整的疾病发展过程。

这可能是由于病毒感染导致小鼠免疫系统过度激活，引发细胞因子风暴，从而造成多器官功能

衰竭。为了降低小鼠死亡率，对病毒感染剂量进行了优化。通过预实验，设置多个病毒剂量

梯度，观察小鼠的发病情况和死亡率，确定了最佳的病毒感染剂量。在感染过程中，密切监

测小鼠的健康状况，及时给予支持性治疗，如补充水分、电解质等，以维持小鼠的生理功

能。还尝试使用免疫抑制剂对小鼠进行预处理，抑制小鼠的免疫系统功能，降低免疫反应的

强度，从而减少细胞因子风暴的发生，降低小鼠死亡率。

病毒变异也是需要关注的问题。在连续传代过程中，病毒可能会发生变异，导致其生物学特性

发生改变，影响模型的稳定性和可靠性。为了监测病毒变异情况，定期对传代后的病毒进行

全基因组测序，分析基因序列的变化。通过生物信息学分析，确定变异位点是否位于病毒的

关键基因区域，以及这些变异对病毒生物学特性的影响。如果发现病毒发生了不利于模型建

立的变异.及时调整传代策略，如更换病毒株或调整传代条件，以确保病毒的稳定性和致病

性。

动物实验的伦理问题贯穿于整个模型建立过程。在实验过程中，严格遵守动物实验伦理规

范，确保小鼠在人道的条件下接受实验操作。为小鼠提供适宜的饲养环境，保证其饮食和饮

水的充足供应。在进行病毒接种、样本采集等操作时，采用适当的麻醉方法，减轻小鼠的痛

苦。对于出现严重症状或濒临死亡的小鼠，及时进行安乐死，以避免其遭受不必要的痛苦。

还对实验动物的数量进行了严格控制，在满足实验需求的前提下，尽量减少动物的使用数

量。

5.2与其他登革热动物模型的比较分析

将本研究建立的n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型与其他常见的登革热动物模

型进行对比分析，有助于明确本模型的特色和优势，为登革热研究提供更全面的参考。

在小鼠模型方面，［具体文献5］使用正常免疫功能的C57BL/6j小鼠建立登革病毒感染模型，

通过腹腔感染DEN-2NGC株，研究登革病毒在小鼠外周血的动力学情况。该模型虽能模拟

相似的病毒血症，但小鼠不产生与人相似的症状，无法全面反映登革热的发病过程。而本研

究通过对C57BL/6小鼠进行n型登革病毒的连续传代，获得了小鼠适应株，增强了病毒在小

鼠体内的感染性和致病性。利用AG129小鼠构建的重症登革热小鼠模型，能够较好地模拟人

类重症登革热的症状和病理变化，如体重下降、血小板减少、出血倾向以及多器官功能损伤

等，在研究登革热致病机制和评估疫苗、药物效果方面具有明显优势。

人源化小鼠模型也是登革热研究中常用的模型之一。人源化小鼠模型是指带有功能性的人类

基因、细胞或组织的小鼠模型。这种模型在研究登革病毒感染人类的特异性机制方面具有独

特的价值，能够更准确地模拟人类免疫系统对登革病毒的反应。由于构建过程复杂，成本较

高，旦存在免疫重建不完全等问题，限制了其广泛应用。本研究建立的小鼠模型相对来说构

建方法较为简单，成本较低，且能够稳定地模拟重症登革热的发病过程，在大规模的实验研究

和药物、疫苗研发中具有更好的实用性。

还有一些基于其他动物的登革热模型，如灵长类动物模型。灵长类动物与人类在生理结构和

免疫系统等方面更为接近，能够更真实地模拟人类登革热的发病过程。灵长类动物来源有

限，价格昂贵，实验操作难度大，且存在伦理问题，使得其应用受到极大的限制。相比之

下，本研究的小鼠模型具有来源广泛、价格相对低廉、实验操作简便等优点，更适合开展深入

的研究工作。

与其他登革热动物模型相比，本研究建立的n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型

在模拟疾病症状、构建成本、实验操作便利性等方面具有独特的优势，能够为登革热的研究提

供更有效的实验工具。

5.3研究结果对登革热防控的启示

本研究建立的n型登革病毒小鼠适应株及重症登革热小鼠模型，为登革热的防控策略制定提

供