DB37T-畜禽肌肉中肌苷酸含量测定　高效液相色谱法

ICSFORMTEXT67.050FORMTEXTX04FORMTEXTDBFORMTEXT37DBFORMTEXT37/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXTFORMTEXT畜禽肌肉中肌苷酸含量测定

高效液相色谱法FORMTEXTDeterminationofinosineacidcontentinlivestockandpoultrymuscle—highperformanceliquidchromatographyFORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT山东省市场监督管理局发布DB37/TXXXXX—XXXX前言本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：呼红梅、朱荣生、王彦平、赵雪艳、王怀中、王继英、王诚、蔺海朝、程立坤、韩红、成建国、林松、郭建凤、刘畅、唐伟静、孙洁、胡顺营、莫贞峰、时冉冉。畜禽肌肉中肌苷酸含量测定高效液相色谱法范围本标准规定了畜禽肌肉中肌苷酸含量测定。本标准适用于畜禽肌肉中肌苷酸含量的测定。本方法检出限为0.05mg/g，定量限为0.20mg/g。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T9695.19肉与肉制品取样方法原理试样中的肌苷酸经5%高氯酸溶液（4.8）提取，再与0.5mol/L氢氧化钠溶液（4.9）发生反应生成化学状态稳定的肌苷酸钠，采用高效液相色谱(紫外检测器)测定，外标法定量。试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。水：GB/T6682，一级水。甲酸铵。高氯酸。氢氧化钠。肌苷酸标准品：纯度≥98.0%。甲醇：色谱纯。甲酸铵缓冲溶液（50mmol/L，pH6.5）：准确称取3.15g甲酸铵（4.2）于烧杯，加500mL水（4.1），用0.5mol/L氢氧化钠溶液（4.9）调至pH6.5，定容至1000mL。用前0.45μm滤膜过滤，超声水浴脱气20min。高氯酸溶液（5%）：准确移取高氯酸（4.3）5mL，加95mL水（4.1）。氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：将氢氧化钠（4.4）配成饱和溶液，密闭放置至溶液清亮，用塑料管虹吸，准确移取26mL上清液于1000mL水（4.1）中。肌苷酸标准储备液（1mg/mL）：准确称取肌苷酸标准品（4.5）15.31mg(精确至0.01mg)，水（4.1）定容至10mL。肌苷酸标准系列工作溶液：准确移取1mg/mL肌苷酸标准储备液（4.10）2、4、8、10、12、14、16mL，水（4.1）定容至100mL，即为0.02、0.04、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mg/mL的肌苷酸标准系列工作液。微孔滤膜：0.45μm无机系。仪器和设备高效液相色谱仪：配备紫外检测仪。离心机：转速不低于4000rpm。高速组织匀浆机：转速不低于8000rpm。分析天平：感量0.1mg和0.01mg各一台。磁力搅拌器。样品按照GBT9695.19中取样方法，采集有代表性的样品20g左右，搅碎、均质，并转入塑料自封袋中，-20℃保存备用。测定步骤提取平行做2份试验。称取1g～2g搅碎、均质的肌肉（精确至0.0001g），置于50mL离心管中，准确加入20mL预冷的5%高氯酸溶液（4.8），高速组织匀浆机8000rpm匀浆1min后，转入50mL容量瓶，5%高氯酸（4.8）定容。移取20mL4000rpm离心3min，准确移取上清液10mL，用0.5mol/L氢氧化钠溶液（4.9）调pH值至6.5，转入50mL容量瓶用水（4.1）定容。用0.45μm滤膜（4.12）过滤备用。液相色谱参考条件色谱柱：柱长150mm，粒径5μm，内径4.6mm，或其他效果等同的C18柱。柱温：30℃。紫外检测波长：254nm。流动相：甲酸铵缓冲溶液（4.10）+甲醇=95+5。流速：1.0mL/min。进样量：10μL。运行时间：10min。测定上机测定肌苷酸标准系列工作液（4.11）和提取溶液（7.1）上机测定。在上述色谱条件下，肌苷酸标准溶液和样品肌苷酸提取液色谱图见附录A。定量以肌苷酸的浓度为横坐标，肌苷酸标准系列工作液（4.11）的色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数不低于0.99。试样中待测物的响应值应在标准系列工作液测定的线性范围内（相差不超过30%）。如果超出标准系统工作液测定范围，应将试样溶液取水进一步稀释后，重新测定。实验数据处理试样中肌苷酸含量Ci，以质量分数表示，单位为毫克/克（mg/g）。按式（1）计算。 (SEQ标准自动公式\*ARABIC1)式中：Ci——样品中肌苷酸的含量(mg/g)；Cs——标准工作液中肌苷酸的浓度(mg/ml)；Ai——样品中肌苷酸所对应的峰面积响应值；As——标准工作液中肌苷酸所对应的峰面积响应值；V——样品提取液总体积(ml)；M——样品质量(g)。测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留2位有效数字。精密度在重复条件下，获得两次独立测定值结果的绝对差值不大于这两个测定值