发酵工艺综合实习指导书

目录

综合实验一土壤中稀有放线菌的别离和纯化

及抗生菌的体外抗菌鉴定

综合实验二玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵

综合实验三甜酒的酿造

综合实验一

土壤中稀有放线菌的别离和纯化

及抗生菌的体外抗菌鉴定

一土壤中稀有放线菌的别离和纯化

1实验目的

了解采集土样的要求和方法，掌握由土壤中别离稀有放线菌的根本原理和操作技术，学习

并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。

2实验原理

筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放

线菌。放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。一般地，放线菌在比拟枯

燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不

同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。

土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以

外的其它放线菌统称为稀有放线菌。假设以常规方法进行别离，得到的几乎全部是链霉菌。

然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高柿有放

线菌的获得率。

由土壤中别离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主

要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。

3仪器和材料

(1)培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用

500ml三角瓶分装250ml.

(2)灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5nli吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水(含30

粒玻璃珠)，18X180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18X180mm试管中分装10ml

l%°K2Cr207母液。

(3)其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。

4试验步骤

(1)采土：选择适宜采样地点。用采土铲去除表土，取5〜10cm深处的土壤约150g左右，

装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样H期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。

(2)土样预处理.：新鲜土样应适当风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发

育的影响。

(3)制备平板：每组取10套无菌培养皿，将冷却至50C左右的各培养基，分别倒入平

nil,每皿约15〜20mL每种培养基中需参加20Ppm的K2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类

及组号。

(4)制备土壤稀释液：每组称取10g土样，放入90nli无菌水中，得到土壤原液。手摇

15〜20min后，静置lmin°再用无菌吸管取1ml上清液，置于9ml无菌水中，充分混匀，那么

得到10-2稀释液。依此类推，制备10—3.10—4稀释液(一般地，较肥的土壤使用10—3〜

10—5稀释液，而瘦土那么使用10—2〜10—4稀释液)。

(5)铺平板：用1ml无菌吸管分别取0.加110—3〜10—5稀释液,置于培养基平板中央。

然后，再用无菌的玻璃刮铲均匀涂布，静置lOmin。每1稀释度3个重复，每1种培养基10套平

板。并注明各稀释度。

(6)培养及观察：将各平板置于28c恒温箱中倒置培养14天。要求分别在第2天、7天和14

天进行观察，并根据菌落大小、气生菌丝有无、气生菌丝和基质菌丝的颜色及可溶性色素有

无等培养特征，选择单菌落放线菌进行纯培养，同时在平板反面的相应位置上作好标记。

(7)纯培养：及时将选定的单菌落接入高氏1号琼脂斜面，每个菌株接1支斜面。必要时，中

间可加1次划线别离培养，然后再转斜面。

5结果与讨论

将实验结果填入下表。

菌落特征旗厂

培养基大小形态表面千湿颜色色素类型

葡萄糖大门冬素琼脂

精氨酸晾脂

高氏1号琼脂

思考题

1.在别离土壤放线菌时为什么要选用多种培养基？

2、在培养基中添加K2Cr207有何作用？

二抗生菌的体外鉴别

1实验目的

了解抗生素产生菌体外筛选法的原理，学习并掌握抗生菌的鉴别方法。

2实验原理

由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的抗生菌。首先应根据筛选目确实定试验模

型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据

是扩散原理.，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。瓶茵圈的大小和透明度那么说

明了该菌株抗菌活性的强弱。本实验选用了这两种方法。

3仪器与材料

(1)培养基：500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂，18X180mm试管分装4nli黄豆饼

粉浸汁，300ml三角瓶分装15cmi细菌培养基，150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。

⑵试验菌:

枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)

大肠杆菌(Escherichiacoli]

金黄色葡萄球菌(Slaphlococcusaureus)

深红酵母(Ruodotorularubra}

⑶待测菌株：

琼脂培养物：将融化的黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿，制成平板。用记号笔在平mi反面

画一直线，将平皿一分为二，分别注明待测菌株的编号。并按照编号将待测菌株密集划线接

入平板。同法接入华美链霉菌(Slreploinyccssplendcns)和金霉素链霁菌(Strcptomyccs

aureofaciens)作为对照菌，28℃下培养7天

发酵液：将待测菌株和对照菌分别接入黄豆饼粉培养液，作好标记，28℃下振荡培养7

天。

(4)灭菌物品：培养皿，打孔器，银子，圆滤纸片，15乂15。廊试管分装51111无菌水，11111

吸管，无菌漏斗。

(5)其它：接种用具，游标卡尺，记号笔，摇床。

4试验方法

4.1琼脂块法

(1)分别取枯草芽胞杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1支，参加5ml无菌水

制成菌悬液，备用。

(2)取9套无菌培养皿,向每套培养皿中分别参加1ml试验菌悬液,然后参加约12ml冷

却至45C左右的细菌培养基，迅速在实验台上摇匀，制成指示菌平板。每1种指示菌3个重复,

并注明指示菌及测定菌株的位置。

(3)用无菌打孔器将待测菌株和对照菌的黄豆饼粉琼脂培养物切块，每种培养物9块。

(4)用无菌接种针，将待测菌株和对照菌琼脂块分别移入各指示菌平板的相应位置上，

菌面朝上，间隔均匀摆放。

(5)静置20min后，放入恒温箱，37c下培养18〜24h。

(6)用游标K尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈的透明程度和边缘整齐程度。

4.2滤纸片法

(1)向深红酵母菌斜面中参加5nd无菌水，制成菌悬液。

(2)向已冷却至45C左右的马铃薯培养基中参加深红酵母菌悬液，摇匀后，倒3个指示

菌平板，并在平皿反面标明测定菌株的位置，备用。

(3)过滤各测定菌株的发薛液。

(4)用无菌银子取无菌的圆滤纸片，蘸取各测定菌株的发酵滤液，放入指示菌平

板的相应位置上，每1测定菌株3个重复。

(5)静置20min后,28c下培养2天。

(6)用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈的透明程度和力缘整齐程度。

5结果

将实验所得结果填入下表，抑菌圈直径以mm来表示。

抑菌圈直径枯草芽他杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球深红酵母

(d)菌

123123123123

待1

测

菌2

株

对华美

照链毒菌

曲金寄素

株链霉菌

思考题

1.为什么在移入琼脂块和滤纸片后不立即保温培养？

2、抑菌圈小是否就意味着菌株的抑菌活性差？为什么？

实验进度安排

第一天：设备准备，土壤采样，培养基准备

第二天：培养基准备.别离稀有放线菌体

第三天：土壤稀释法和微生物的纯培养

第四天：琼脂块法筛选，滤纸片法筛选培养

第五天：实验结果观察总结报告撰写

综合实验二

玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵

1实验目的及要求

要求学生掌握用施法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法，淀粉水解糖酒精发酵方法。掌

握粗淀粉含量和复原糖、酒精含量的化学测定方法。

2实验原理

发酵过程中，有些微生物不能宜接利用淀粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解

成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄轴的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖

液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的枳累

直接相关。

可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯类（木薯、甘薯）淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、

大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可

分为酸解法、酸施结合法和酶解法。实验室中常采用酷解法制备淀粉水解糖。

酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第I

步是利用Q-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化：

第2步是利用糖化酹将糊精或低聚糖进•步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖

化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双解水解法。利用酒精酵母将可

酵糖转化为酒精的过程称为发酵。

2.1酶法液化原理

淀粉的的法液化是以a-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的a14糖甘健，从内部随机地水

解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及小量麦芽糖，所以也称内切淀粉的.淀粉受到。-淀粉

前的作用后,其碘色反响发生如下变化：蓝一紫一红一浅红一不显色（即碘原色）。酹法液化

以生产工艺不同分为间歇法，半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方

法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分为中温的法、高温前法、或

中温酹利高温酹混合法。本实验采用：中温酶法，间歇式，罐式，二次加酹法。

2.2酶法糖化原理

淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非复原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的Q

-1,4糖背键或a-1,6糖背键。因为是从链的•端逐渐地•个个地切断为葡萄糖，所以称为外

切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中，水参与反响，故糖化的理论收率为

111.1%。

（C6H|o05）n+H20------»nC6Hl2。6

16218180

淀粉糖化实际收率的计算：

淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。

淀粉转化率的计算：

DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中复原性糖以葡萄糖计，占

干物质的百分比称为DE值。

DE值计算:

复原糖用裴林氏法或硬量法测定，浓度表示：葡萄糖g/lOOml糖液；

干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100g糖液。

影响DE值的因素：

糖化时间：最初糖化时，精化速度快,DE值显著上升；但24h后，当DE值到达90%以

上时，糖化速度显著放慢。

液化DE值与糖化DE值的关系：

液化程度应控制适当，太低或太高均不利。原因是液化程度低，那么粘度大，难操作；同时,

由于液化程度低，底物分子少.水解时机少,影响糖化速度：液化程度低，易发生老化；但液

化超过一定程度，那么不利于糖化的与糊精生成络合结构，影啊催化效率，造成糖化液的最

终DE值低。故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，那么糖化液的最高DE值越高。•

股液化DE值应控制在12-18%。

脑制剂用量与糖液DE值的关系:

糖化时间与糖化酹用量关系表

糖化时间(h)68101624324872

糖化酶用量(U/g淀粉)480400320240180150120100

为加快糖化速度，可以提高前用星，缩短糖化时间。但酶用量太高.反而吏豆合反响严

重，最终导致葡萄糖值降低。在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间,

减少糖化施用量。

2.3酒精发醉原理

以淀粉为原料，采用酸水解、酸酶结合水解或酶水解方法，可以将淀粉转化为郁萄糖等可酵

糖。利用酒精酵母胞内的酒化酶系，葡萄糖被转化为酒精即酒精发酵。以生产工艺不同，酒

精发酵可分为间歇式、半连续式、连续式过程，各种过程又可以细分为多种形式。本实验采

用酶法糖化、一次添加间歇式方法进行酒精发酵。

3实验仪器、设备和材料

(1)1000ml烧杯

(2)真空过滤装置

(3)烘箱

(4)量杯

(5)量筒

(6)分光光度计

(7)水浴锅

⑻滴定管

(9)电炉

(10)白瓷板

(11)三角瓶

(12)阿贝折光仪

(13)玉米粉

(14)Q-淀粉酶

(15)糖化酶

(16)pH试纸

(17)酒精活性干酵母

(18)酒精蒸缁装置及酒精计

4实验步骤

4.1淀粉水解糖的制备

淀粉的液化

配制30%的淀粉乳，调廿pH值至6.5,参加氯化钙(对固形物02%),在3个1000ml烧杯中

分别参加淀粉乳700ml并分别参加液化酶12U/g淀粉、l6U/g淀粉、20U/g淀粉，在剧烈搅

拌下,先加热至72C,保温15min,再加热至80℃~90℃(视酶的特性而定),并维持30min,

以到达所需的液化程度(DE值：15-18%),碘反响呈棕红色。液化结束后，观察液位，再升温

至100C保持10-15min,以凝聚蛋白质，改良过滤。记录液化可问。

淀粉的糖化(糖化酶用量对精化的影响)

液化结束后，迅速将料液用盐酸将pH调至4.2-45同时迅速降温至60C。将液化醪混匀后

均分为3份，分别参加糖化酹320U/g淀粉、400U/g淀粉、480U/g淀粉，60℃保温，每隔2

小时，取样做酒精实验。当用无水酒精检验无糊精存在时，即为糖化终点，记录糖化时间，同

时将料液pH调至4.8-5.0,并将料液加热至80℃,保温20min.然后将料液温度降至60-70C,

开始过滤。

过滤

将烧杯内的料液冷却至60-70^：趁热采用真空过滤(也可用滤布压滤)，热水洗涤(60-70

℃)滤饼：过滤结束后，洗件过滤的有关设备。量取糖液体积；取样分析史原糖浓度。

4.2酒精发酵

酒精酵母的活化：称取2g蔗糖，溶于100ml经煮沸并冷却的水中，参加lg活性干酵母于

培养箱中30c活化2hr,备用。

清糖液发酵：将4.1方法制备的淀粉水解糖调整浓度为15%左右，于500ml三角瓶中参加

该糖液200ml,用无菌吸管取5ml活化酵母，摇匀，密封三角瓶，置入培养箱中于32,C发酵

24hr后得到发酵成熟醪，蒸修，测定酒精含量。

混合醪发酵：

(1)液化：称取2份各50g玉米粉，置于500ml三角瓶中，混匀，记下液面刻度，参加a.

淀粉酶(酶用量为4U/g淀粉原料)进行液化，得到糊化醪。液化温度为85C,液化时间为

30min,然后冷却至58~60C,保温。

(2)糖化：在糊化醪中分别参加糖化酶200U/g淀粉原料和400U/g淀粉原料，在58~60C

保温糖化30min得到糖化醪。

(3)发酵：将糖化醪冷却至30C,用无菌吸管接入活化酵母液5ml,摇匀，密封容器.置入

培养箱中于32c发酵50hr左右后得到发酵成熟醪，蒸储，测定酒精含量。

5实验分析工程和方法

5.1淀粉原料含水量的测定

原理

样品中的水分受热后产生的蒸汽压，高于空气在电热枯燥箱中的分压，水分便从样品中挥发

出来。样品枯燥的谏度取决于这个压差的大小,在此条件下失云的主要是试样中的游离水。

试样的水分一般是指在100C左右直接枯燥的情况下，所失去的总量。在此条件下失去的重

量不仅是水分，还有微量的挥发性物质。

仪器与设备

(1)分析天平

(2)称量瓶

(3)枯燥器

(4)电热恒温枯燥箱

测定步骤

准确称取约2克试样，置入经1()0-105℃枯燥恒重后的称量瓶中，在100-105℃烘箱中枯

燥34小时，取出,置入枯燥器中冷却至室温,称重。再于相同温度下枯燥I小时左右，同上

操作，直至恒重。

计算

水分=xlOO%

叱-M

式中W0:称量瓶.重：g)

W1:枯燥前试样与称量瓶重(g)

W2:枯燥后试样与称量瓶重(g)

说明

(1)原料的水分测定一般需采用100-105℃烘箱中直接枯燥，其结果较为准确。对生产过程

中的水分快速测定，可采用更高温度下枯燥(如I20-140C)或红外灯下枯燥，以缩短分析时

间。

[2)测定水分时，称量恒重指试样连续两次枯燥后，称量之差不超过2mg.

5.2淀粉原料中粗淀粉含量的测定

原理

淀粉经酸或水解生成葡卷糖：

酸或酶

(C6H10O5)n+nH2O»nC6Hl2O6

所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。

斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平

时甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反响，生成

氢氧化铜沉淀：

2NaOH+CuSO4=Cu(OH)21+Na2sCh

所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反响，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶

解：

COOKCOOK

II

CHOHCHO、

CU(OH)+1

2=|、Cu+2H2O

COOH80)

I|

COONaCOONa

酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是•个氧化剂，能使复原糖中城基氧化，而二价铜被复原生成

一价的氧化亚铜沉淀：

COOK.O(：OOK

//COOH

CHO、Hf(2IIOH

++2%O=2+(CHOH)4+Cu20j

C0O-^(CHOH)4(二OOH|(红色)

11CH2OH

COONaCH20H

(ZOONa

反响终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被复原

后，过量一滴复原糖立即使次甲基蓝复原，溶液蓝色消失以示终点：

试剂

.1斐林试剂

甲液：称取硫酸铜(CuSO4-I5H2O),用水溶解并稀释至1000毫升，如有不溶物可用滤

纸过渡。

乙液：称取346克酒石酸钾钠，100克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000亳升。

.22%盐酸溶液

量取4.5亳升浓盐酸，用95.5受开水稀释。

.320%盐酸溶液

量取20亳升浓盐酸，缓慢倒入80亳开水中。

,420%氢氧化钠溶液

称取200克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000亳升。

.51%次甲基蓝溶液

称取1克次甲基蓝，加100亳升水，加热溶解、贮存于棕色瓶中。

.60.2%标准葡萄糖溶液

准确称取2克无水葡萄糖(预先于I00M05c烘干)，用水溶解，加5亳升浓盐酸，用水定容至

1000亳升。

仪器与设备

⑴三角瓶

(2)长玻璃管(约1米)

(3)容量瓶

(4)分析天平

(5)枯燥器

(6)电热恒温枯燥箱

(7)滴定管

(8)称量瓶

(9)移液管

(10)pH试纸

(11)电炉

(12)水浴锅

测定步骤

.1试样水解

粗淀粉测定中试样水解：准确称取试样1.5〜2克，置入250亳升三角瓶中。加100亳升2%盐

酸溶液，轻轻摇动三角瓶，使试样充分湿润。瓶口按上回流冷凝器或长玻璃管（约I米）.于沸

水浴中回流水解3小时（图2-1）。取出，迅速冷却，用20%氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性

（fflpH试纸试验）。滤纸过浓流液用500亳升容量瓶接收，用水充分洗搽残渣，然后用水定容

至刻度，摇匀，为供试糖液。

.2斐林试剂的校正

吸取斐林试剂甲、乙液各5亳升，置入250亳升三角瓶中，加20亳升水，并从滴定管中参加

约24亳升0.2%标准葡萄糖溶液（其量应控制在后滴定时消耗0.2%标准葡萄糖溶液在1亳升

以内），摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1%次甲基蓝溶液继续用0.2

%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在I分钟内完成。总耗糖量为v亳升。

图2-1水解装置

校正值的计算：

先求得10亳升斐林试剂相当的葡萄糖克数（F）,

F=CV

式中C:标准葡萄糖溶液浓度（g/ml）

再从斐林试剂糖量表（见附表2-1）查得V亳升时相当的葡葡相克数（F0）,斐林试剂校正

值f为：

FCV

F°F。

.3定糖

吸取斐林试剂甲、乙液各5亳升，置入250亳升三角瓶中，加20亳升水，并从滴定管中预先

参加适量的水解糖液（其量应控制在后滴定时消耗水解糖液在1亳升以内），摇匀，于电炉上

加热至沸，并保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝溶液，维续用水解糖液滴定至蓝色消失,

此滴定操作需在1分钟内完成。

计算

从附表2-1查得10亳升斐林试剂消耗水解糖液体积相当于100亳升水解糖液中所含葡

萄糠量（G）,那么1毫升水解糖液中含葡萄糖量为G/100,再乘以斐林试剂校正值，即为1

亳升水解糖液中实际含葡萄糖量：

-^―Xf（g）

100

粗淀粉（%）=—x/x5（）（）x—x0.9x100%

1（X）W

式中500:试样稀释体积（ml）

W:试样重量（g）

0.9:简萄糖与淀粉的换算系数

附表2-1斐林试剂糖量表

消耗糖液相当葡萄100毫升糖液中消耗糖液相当葡萄100亳升糖液中

体积糖量所含葡萄糖的量体积精量所含葡萄糖的量

（毫升）（亳克）（亳克）（毫升）（亳克）（毫克）

1532733

1630734

1728935

1827436

1926037

2038

2139

2240

2341

2442

2543

2644

2745

2846

2947

3048

3149

3250

5.3测定液化反响终点（碘反响）；

5.4糖化终点测定（无水乙醇检验）；

5.5复原糖的测定

原理

原糖的测定采用快速法。其反响与粗淀粉测定相似，不同点为斐林试剂甲液中硫酸铜量

较小，适用于含糖量较少的试样。另外，斐林试剂中参加亚铁乳化钾（黄血盐），使红色氧化业

铜沉淀生成可溶性的豆盐，反响终点更为明显。

CU2O+K4FC（CN）6+H2O=K2CU2FC（CN）6+2KOH

（淡黄色）

试剂

.1斐林试剂

甲液：称取35g硫酸铜，次甲基蓝，用水溶解并定容至1000mL

乙液：称取117g酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁制化钾，用水溶解并定容至1000ml。

.20.1%标准葡萄糖溶液

精密称取经95705C烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，参加5ml盐酸，用蒸储水定容至

1000mL摇匀。

仪器与设备

(1)三角瓶

(2)容量瓶

(3)分析天平

(4)枯燥器

(5)电热恒温枯燥箱

(6)滴定管

(7)称量瓶

(8)移液管

(9)电炉

测定步骤

.1斐林试剂的标定

吸取斐林试剂甲、乙液各5亳升，置入250亳升三角瓶中，加10毫升水，并从滴定管中预先

参加约20亳升0.1%标准葡萄糖溶液(其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄搪溶液1亳升

以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4~5秒钟1滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴

定至蓝色消火，此滴定操作需花1分钟内完成，总耗糖量为V0亳升。

.2定糖

预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5亳升，置入250亳升三角瓶中，参加VI亳升试样

稀释液(含葡萄糖量约为5-15亳克)及适量的0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操

作，总耗糖量为V2亳升。

正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250亳升三角瓶中，加VI毫升试样稀释液

和(V2-I)亳升0.1%标准葡萄糖溶液，补加［“(^(^""▽2)］亳升水，摇匀，以下同标定时操

作，总耗糖量为V亳升。

重复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体枳的平均值Vml.

计算

还原糖(以葡萄糖计％)=(匕-V)xCx〃x-!-xl00%

X

式中V0:斐林试剂标定值(亳升)

V:斐林试剂测定值(室升)

C:标准葡萄糖溶液浓度(克/亳升)

n:试样稀释倍数

vl:所取试样稀释液体枳(毫升)

说明

(1)滴定谏度、三角瓶壁厚度和热源的稳定程度等,对测定精密度影响很大。平行测定

的滴定亳升数相差不应超过0.1ml,故在标定、预备、正式测定过程中，实验条件应力求一

致。

(2)滴定过程应该始终保苟在微沸状态下进行。沸腾后继续滴定至终点的亳升数应控

制在0.5~hnl内,否则应重新测定。

(3)样品液中复原糖浓度不宜过高或过低，根据预备试验结果，应将样品液稀释至复原

糖的含量在1%左右为宜。

(4)滴定至终点蓝色褪去之后，就不应再滴定，因四甲基蓝指示剂被复原褪色后，当接触空

气时，又会被氧化重现篮色。

(5)斐林溶液与复原糖之间的反响因受溶液碱性、加热湿度和时间以及副反响等影响，而没

有严格的定量关系，不能由当量定律来求出试样中复原糖的含量，只熊根据在相同实验条件

下消耗相应的标准复原糖量或由严格相同的实验条件下得出的复原糖检索表上查得相应的

复原糖量来进行计算。所以用廉-爱农法定糖时，必须先用相应的标准复原糖标定斐林溶液。

5.6酒精含量测定

采用国标方法一一蒸储法。

用量筒量取成熟发酵醪100ml置于500ml蒸镭烧瓶中，参加蒸储水100ml,装好蒸储装置，加

热，保持发酵成熟醪始终处于微沸状态，用100ml量筒收集储出液100ml,停止蒸缁。用酒

精计测定储出液的酒度，同时测定偏出液的温度，以便对酒精度进行温度校正。

5.7a-淀粉酶活力测定

原理

液化型淀粉酶(即a.1,4-糊精酶，俗称a.淀粉酶)能将淀粉分子健的a-I,4.葡萄糖甘健

任意切断成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色特异反

响逐渐消失，以该颜色消失的速度计算酹的活力。

试剂

.1原碘液

称取碘(12)11g,碘化钾(KI)22g,先用少量蒸播水使碘完全溶解后定容至500ml,贮于棕色瓶

内。

.2稀碘液

取原碘液2ml,参加KI20g,用蒸缁水溶解定容至500ml,贮于掠色瓶内。

.32%可溶性淀粉

精确称取可溶性淀粉(以绝干计)，然后用少量蒸谣水调匀，徐徐倾于煮沸的蒸镭水中，加热

煮沸至透明为止，冷却定容至100ml。此溶液需当天配制。

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4・H2O)和柠檬酸(C6H807・H2O),用蒸镭水溶解定容至1000ml.

配好后应以酸度计或精密试纸校正pH。

.5标准终点色溶液

A液精确称取氯化钻(CoCi・6H20)和重辂酸钾(K2Cr2O?),以蒸镭水溶解定容至

500mlo

B液精确称取错黑T(C20H12N2NaO7S)10mg,以蒸僧水溶解定容至100mL

使用时取A液40ml与B液50ml混合。此混合液宜冰箱保存，使用15天后需要重新配

制。

操作步骤

.1待测酶液的制备

取发酵液的滤液用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释,供测定用。

.2测定

取2ml标准终点色溶液滴于白磁板空穴内，作为比拟颜色的标准。

取20ml2%可溶性淀粉和5n】lpH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，放于20X200n】m大试

管中，在60C恒温水浴中预热4-5min.然后参加预先稀释好的酶液1,立即记录时间，充分

摇匀。定时用滴管取出反响液约1,滴于预先充满比色稀碘液(约1.5ml)的磁扳空穴内，当穴

内颜色反响由紫色逐渐变为红棕色,与标准终点色相同时，即为反响终点，并记录时间

t(min)0

计算

1ml酶液于60sC.pH6.0的条件下，用1h液化可溶性淀粉的克数来表示(g可溶性淀粉

/ml,h)o

酶活力单位=(宁x20x2%x〃卜0.5

式中60:60min

20:可溶性淀粉的亳升数

n:稀释倍数

t:测定记录时间(min)

2%:淀粉浓度

0.5:测定时的用酶量

考前须知

⑴酶反响(酶活力10~15单位

(2)为统一起见，可溶性淀粉使用同一厂家生产的化学纯试剂。

13)测定时照明采用40W日光灯，灯与口磁板的间距以60cm为宜。

5.8糖化褥活力测定

原理

糖化型淀粉酶(即淀粉a-1,4-葡荀糖甘陶)有催化淀粉水解的作用，从淀粉分了•北曳原性末

端开始，分解a4-糖甘犍生成葡萄糖，反响生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示

糖化性淀粉酶的活力。

试剂

称取醋酸钠(CH3coONa・3H2O)和冰醋酸(CH3coOH)1,用蒸镭水溶解，定容至1000mlo

上述缓冲液应以酸度计或精密试纸校正pH。

⑴配制：称取硫代硫酸钠(Na2s203•5H2O)和硫酸钠那么用蒸镭水稀释制得。

(2)标定：取在I20C下枯燥至恒重的标准重铝酸钾.精密称量。置碘量瓶中，加水50ml使

溶解，加碘化钾2g。轻轻振摇使溶解，加lmol/L硫酸溶液40句摇匀，密塞。在暗处放置

lOmin后用蒸储水250ml稀释，用此液滴定至近终点时，加淀粉指示液3ml,继续滴定至蓝色

消失而显亮绿色。并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的O.lmol/L硫代硫酸钠液相当

于4.903mg重铝酸钾。根据本液的消耗量与垂珞酸钾的用量，计算硫代硫酸钠的当量浓度。

本溶液需每月标定一次。

称取碘化钾(Kl)36g,溶解在100ml蒸储水中，再参加碘(⑵溶解、定容至1000ml贮存于

棕色瓶中。

用标准的0.05mol/L硫代流酸钠溶液标定碘液。

吸取10ml待标定的碘液放入250ml碘量瓶中,以/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时,参加

1%淀粉指示剂1-2滴，继续滴定至无色为终点。

NV

碘的摩尔浓度N=

2V

式中NI:硫代硫酸钠的浓度(mol/L)

VI：消耗硫代硫酸钠的毫升数

V:碘液亳升数

称取4g氢氧化钠(NaOH)加蒸溜水溶解,定容至1000mlo

.5Imol/L硫酸溶液

量取浓硫酸56ml,慢慢参加于80ml蒸饱水中，冷却后定容至100mL摇匀。

.620%氢氧化钠溶液

称取20g氢氧化钠，溶解定容至l(X)ml0

.72%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g,然后用少量蒸储水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸播水中，煮沸至透明，冷却

定容至100ml,此溶液需当天配制。

操作方法

.1待测酶液的制备

取发酵液的浓液用pH4.6醋酸钠缓冲液适当稀释，供测定用。

.2测定

于甲、乙两支比色管中(50ml),分别参加20%可溶性淀粉溶液25ml及0.Imol/LpH4.6

的醋酸-醋酸钠缓冲液5ml,摇匀,40℃的恒温水浴中预热(5-10min)。在甲管中参加的液

2ml(酶活总量约100-170单位)，立即记时间，摇匀。在此温度下准确反响lh后，立即各加

20%NaOH溶液1,摇匀，将两管取出迅速用水冷却，并于乙管中补加酶液2ml。

取上述反响液5ml放入碘量瓶中，准确参加0.Imol/L碘液10ml,再参加0.1mol/L氢氧化钠

15ml(边摇晃)。暗处放置15min,参加lmol/L硫酸2ml,用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无

色为终点。

计算

糖化酶活力单位的定义：在40C、pH4.6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1亳克

葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。

1a,9

的活力单位=(A-8)/Vx90.05xlx—x/7

25

式中A:空白所消耗硫代硫酸钠亳升数

5:样品所消耗疏代硫酸钠亳外数

N:硫代硫酸钠摩尔浓度

90.05:Imi1mol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖亳克数

1/2:折算成1ml酹液的量

32.2:反响液总体积亳升数

5:吸取反向液亳升数

n:稀释倍数

考前须知

(1)(空白和样品)的差数为3~6ml左右(以每亳升约50~90单位为宜)。

(2)为统一起见可溶性淀粉使用浙江菱湖淀粉厂生产的化学纯试剂配制，如暂不能购制，而

需使用其他厂生产的可溶性淀粉时.必须做对照试验。

6数据处理

在详细记录实验数据的根底上完成实验报告。计算淀粉转化率和淀粉出酒率。

7实验结果和讨论

糖化酶用量及糖化时间对糖化效果的影响：

液化和糖化时温度及pH对实验效果的影响。

糖化酶用量对出酒率的影响？

实验进度安排

第一天：实验准备：仪器、药品、玻璃器皿，实验原料。

第二天：淀粉的液化，糖化，过滤

第三天：酒精发酵操作

第四天：测定用试剂的配置，各种指标的测定

第五天：各种指标的测定，实验总结，报告撰写

综合实验三

甜酒的酿造

1试验目的及要求

要求学生掌握甜酒的酿造原理及工艺流程；掌握甜酒酿造过程中酒曲中糖化酶的活力测

定方法：成品总糖、嵬原糖含量、酒精度及总酸度的测定原理及方法。

2甜酒概述

甜酒的酿造，主要采用甜酒曲。甜酒曲是糖化菌及酵母制剂，其所含的微生物主要有根

霉、毛霉及少量醉母。在发酵过程中根霉产生糖化酶，首先将簿米中的淀粉分解成葡萄糖,

蛋白质分解成第基酸，接着少量的酵母又将葡糖糠经糖酵解途密转化成酒精。这样就制成了

香甜可口、营养丰富的甜酒酿。

甜酒酿是米酒曲的最初产品，它是各类酒类制作的雏形，除了食用外，还有两种用途，

一是作为料酒使用，如川式火锅，豆前酱中添加：二是制作馒头，如河南周口的米酒馒头、

浙江金华的米酒馒头。另外，甜酒曲还可以在调料发酵中使用，因此，甜酒曲的用户有甜酒

酿工厂、家庭、餐饮单位、调料生产单位。

甜酒酿作为料酒使用，主要是利用其良好的口感的独特的风味，在调味的过程中，它

既具有一定的酒香，又有酸、甜的口味，能起到处腥膻异味、提鲜增香等作用，使菜肴风味

独特，口味柔和，已经成为烹饪菜肴时不可缺少的调味品。

甜酒酿在制作馒头中使用，最主要的代表在河南周口和浙江金华，具有很强的地方传

统色彩，一般都称之为米酒馒头。米酒馒头的制作方法有很多和，有的是直接利用甜酒曲长

时间发醉面团，制作馒头；有的是利用甜酒酿中的酒水作为面团用水，在添加适当的酵母，

制作馒头，这种发方法在金华最典型；还有的是将甜酒酿和面粉共同长时间发酵，制作馒

头。虽然方法不尽相同，但这些馒头都具有甜酒酿特有的醇否风味，而且口感细腻，是非常

具有民族传统特色的食品。

甜酒曲用于调料发酵，主要是利用甜酒曲中根霉极强的糖化性能。例如酱品的制作，它

是以淀粉质和蛋白质材料作为主要原料，在制作过程中起主要作用的是根霉菌株产生的糖

化霉系和蛋白萌系，通过糖化作用，将淀粉质分解成糖:通过蛋白酶系对蛋白质的水解发酵

作用，产生各种氨基酸，这样就形成了馨类的甜味和鲜味。然后再通过酵母的酒精发酵作用

和细菌的乳酸发酵作用，就得到了风味各异的酱品。

由此看来，甜酒曲及甜酒酿的用途确实十分广泛，当然，甜酒曲及甜酒酿的用途也未

必只有这些，还需要我们在生活和研究中不断的发现和创新。

实验分为三局部进行：a.淀粉酶活性的测定、酣酒的酿造、成品指标检测［酒精含量、总

糖、总酸度的测定)

3a-淀粉酶活性的测定

3.1原理

液化型淀粉酶(即a-1,4-糊精的，俗称a-淀粉酶)能将淀粉分子健的a-1,4-葡萄糖昔键任意

切断成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色特异反响逐

渐消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。

3.2试剂

3.2.1称取分析纯结晶碘11g,分析纯碘化钾22g,先用少量蒸馀水使碘完全溶解后，再加蒸怖水

定容至500mL贮于棕色瓶内。

稀碘液:取原碘液2mL.加碘化钾20g,加蒸储水溶解定容至500mL.贮于棕色瓶内。

3.2.32%可溶性淀粉(HG3-3O95):称取可溶性淀粉(以绝干计)用少量蒸储水调匀，徐徐倾入煮

沸的蒸馅水中,加热煮沸至透明为止，冷却定容至100mLe此溶液当天配制。

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液》H6.0):称取磷限氢二钠(Na2HPO4-12H2O),

和柠株酸(C6H807•H2O),用蒸偏水溶解定容至1000mL,配好后应以酸度计校正pH值为。

3.2.5标准终点色溶液

A液:称取分析纯氯化钻(COC12-6H20)和分析纯重铭酸钾以蒸镯水溶解定容至500mL。

B液:称取络黑T(C20Hl2N3NaO7S)40mg以蒸锚水溶解定容至500mL。使用时取A液40mL与B

液混合。此混合液宜冰箱保存，使用15天后需要重新配制。

测定步骤

待测酶液的制备

称取酶粉〜2.0000g或酶液，先用少量的40C,

的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶洌PH6.0）溶解，并用玻璃棒捣碎瀚上层清液小心倾入适当的容

量瓶中，沉玳局部再参加少量上述缓冲溶液,如此反复捣研3〜4次，最后全部移入容量瓶中，用

缓冲溶液定容至刻度，摇匀，通过4层纱布过滤再用滤纸滤清，滤液供测定用。

3.3.2测定

取2mL标准终点色溶液于白谎板空穴内，作为比拟颜色的标准。取2%可溶性淀粉20mL

和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液5mL放于25mmX2（X）mm试管中，在60c恒温水浴中预热4〜

5min.然后参加预先稀释好的酶液0.5mL,立即记录时间，充分摇匀,定时用吸管取出反响液

0.5mL,滴于预先充满比色稀碘液（约1.5mL）的白底板空穴内，当穴内颜色反响由紫色逐渐变为

红棕色，与标准终点色相同时,即为反响终点，并记录时间（分钟）。

注:①酶反响全部时间控制在2〜之内。

②测定时照明采用40瓦日光灯,灯与瓷板的间距应为60min左右为宜。

③白瓷板可用10mL比色管代替。

3.3.3计算：

年酶粉或1mL酶液于60℃、条件下，以lh液化可溶性淀粉的克数来表示（克可溶性淀粉/克

小时或克可溶性淀粉/亳升•小时）。

X=（竿x20x2%xn）/0.5

式中:X——醉活力单位,u/g;

n——稀释倍数；

T------测定记录时间,min;

60-------分钟数；

20——可溶性淀粉的亳升数；

2%——淀粉浓度；

0.5——测定时稀酶液用量,mL。

4.甜酒的发酵

4.1原理：

甜酒的酿造，主要采用甜酒曲，甜酒曲是糖化菌及醉母制剂，其所含的微生物主要有根毒、

毛霉及少量酵母。在发酵过程中根毒产生糖化酯，首先将箱米中的淀粉分解成葡萄糖，蛋白

质分解成氨基酸，接者少量的酵母乂将葡糖糖经糖酵解途径转化成酒精。这样就制成了香甜

可口、营养丰富的甜酒酿。

4.2原料配方:糯米1kg,甜酒曲10g

4.3器材

搪瓷盆、锅、三角瓶、纱布

4.4工艺流程：糯米一淘洗一浸泡一冲淋一蒸熟一降温一糖化｛加甜酒曲）一发酵一冷却一

成品

制作步骤：

清洗、浸泡：将糯米淘尽，浸泡12小时，用清水冲淋

蒸饭：将米沥干水后装在蒸笼内，蒸至米粒变色呈晶状，即已熟透。(大约15分钟)

降温：用冷开水浇淋米饭，使温度降到温热适宜时，沥去水分。

糖化、发酵：将降温后的米饭倒入已灭菌的容器中，将酒曲研成粉末参加米饭中，搅拌均

匀。再盛入已灭菌的三角瓶中，按平。中心戳一圆洞，三角瓶加塞，在30C以上条件下糖化

和发酵24h-48h。待中心洞眼中有酒醺汁渗出时，即可结结束发酵。

冷却：发酵完成后再移植到较低温度处放置，以防止发酵过渡和变质。

5.酒精含量测定(分光光度计法)

5.1测定原理

挥发的酒精与重铝酸钾、浓硫酸反响生成绿色的硫酸铝，色泽的深浅在•定范围与酒精

浓度成正比，因此可通过测定醪液的OD值即可从标准曲线上查出醪液酒精含量。

5.2试剂

1.0%标准酒精溶液：准确吸取1(AR级)无水酒精,于100ml容量瓶中,定容到刻度。

5.2.22%重格酸钾溶液：称取2g重格酸钾(K2O207),溶于水，并稀释至100ml

浓硫酸：CP级,98%,相对卷度1.84。

HH-SII.2型电热恒温水浴锅、721型分光光度计

5.4测定步骤

样品预处理

称取10g酒酷，于500ml蒸储烧瓶中，加蒸储水15()亳升，蒸谣，锚出液90ml,定容至100ml,

备用。

标准曲线的绘制

取1.0%乙醉的乙醇用蒸储水按表1稀释。取各桶棒液十试管中，在各试管中

参加2.5ml2.0%的K2Cr2O7和10.0ml98%H2SO4,摇匀，沸水浴中加热lOmin,冷却,

600nm测定吸光度。作标准曲线，如图1。得线形回归方程：

Y:储出液中乙醉的百分含量(V/V)

X:吸光度A

：补尝参数

表I1.0%乙醇序列稀一度

稀释编号0#1#2#3#4#5#6#7#

1.0%乙醇ml

蒸憎水ml

o25

♦

<2

>•

胜o15

塔

1

疑•

Noo5

♦

0-------1---------1---------1---------'

00.10.20.30.4

吸光度A

图1乙醇浓度・OD值关系曲线

酒酷中乙醇含量的计算：

C1：酒醋中乙醇的仃分含量,V/M。

Y:储出液中乙醇的体积仃分浓度%

m:蒸储酒酷的质量g

100:储出液的体积ml

6.复原糖、总糖的测定

原理

将一定量的碱性酒石酸桐甲'乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉

淀很快与酒石酸钾钠反响，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次

甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的复原糖与酒石酸钾铜铜反响，生成红色的氧化亚

铜沉淀，待二价铜全部被复原后，稍过量的复原糖把次甲基蓝复原，溶液由蓝色变为无色,

即为滴定终点。根据样液消耗量可计算出复原糖含量。各步反响式(以葡萄桶为例)如下：

(1)CM-SO4+2NaOH=2cM(OH)2J+Na2SO4

COOKCOOK

II

CHOHCHO

(2)CU(OH)2+|=|>CU+2H2O

CHOHCHO

COONaCOONa

⑶

COOHCOOK

CHO