原生质体的培养

原生质体的培育

原生质体(Protoplast)才旨采纳机械或酶解法去掉细胞壁的暴露细胞。

一、原生质体的应用

由于没有细胞壁,原生质体为作物遗传改灵和植物学讨论供应了极为

有利的试验材料。原生质体可以用于下面几种讨论。

用作细胞杂交服务于作物改良

用作遗传转化的对象

讨论细胞壁的发生过程

筛选突变体

膜的结构、运输、激素接受位点等的讨论

用于分别细胞器和大分子

种质资源保存

二、原生质体分别、纯化

原生质体分别的最基本原则是保证原生质体不受损害及不损害它的再生力量。

（-）分别方法

机械法分别

缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费劲

酶法分别

Cocking最早开展这方面讨论,克服了机械法分别的缺陷,可分为直接法和挨次法两

种。酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可

能有不同程度的毒害作用。

（二）影响原生质体分别的因素（酶法）

从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分别得到原生质体。但是对

于原生质体培育来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最终再生完整植株的

原生质体则受很多因素的影响。原生质体分别时主要应考虑

取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。

1.外植体来源：

生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体

的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分别的植物外植体有叶片、叶

柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培育物(Suspensioncultures)、原球

茎、花瓣和叶表皮等。叶肉细胞是常用的材料，由于叶片很易获得而且能充分供应。取材

时，一般用刚绽开的幼嫩叶片。另一个分别原生质

体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采纳其作材料可以避开植株生长环境的不良影

响，可以常年供应，易于掌握新生细胞的年龄，处理时操作便利，无需消毒.选用悬浮细胞

作材料时，需每隔3-5天继代一次，培育一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代

后的第三天游离原生质体。

2.酶液组成和浓度：

纤维素，占壁干重的25-50%

植物细胞壁由三个主要成分构成半纤维素，平均53%,果胶质,5%

用来分别植物原生质体的酶制剂主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶等，

酶解花粉母细胞和四分体小徇子时还要加入蜗牛酶。纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的

纤维素，果胶酶的作用是降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞

分开.

常用的酶制剂及其生产厂家有：

纤维素酶有CellulaseOnozukaR-10(KinkiYakultManuf.Co.Ltd.,Nishinomiya,

日本),CellulaseOnozukaRS(KinkiYakultManuf.Co.Ltd.,Nishinomiya,日本),

Cellulase(Sigma),Driselase(KyowaHakkoKogyoCo.,日本\果胶酶有Pectolyase

Y23(KikkomanShoyuCo.,Lte.Nishinomiya，日本)，Macerozynie(Yakult

BiochemiclesCo.zH$),Pectinase(Serva)等。半纤维素酶有RhozymeHp-150

(RohmandHaasCo.inde.美国宾西法尼亚州X大多数植物分别原生质体时，纤维素

酶浓度在1%-3%,果胶酶在0.1%-1%，但也有很多例外。

3.渗透压:

原生质体操作需要在肯定渗透压存在下进行，常用的配制分别原生质体酶液的溶液以

及洗涤原生质体的溶液为CPW液，CPW盐成分为：

KH2PO427.2mg/L

KNO3Wl.Omg/L

CaCI2.2H2O1480.0mg/L

MgSO4.7H2O246.0mg/L

KI0.16mg/L

CuSO4.5H2O0.025mg/L

5.8

依据渗透剂的浓度和成分可分为以下几种培育基:

CPW13M:CPW盐十13%甘露醇(rndnnitol)

CPW9M:CPW盐+9%甘露醇

CPW21S:CPWJt+21%sucrose

CPWOM:CPW盐溶液。

多数状况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及集中入

原生质体的速度很慢的原因，这样一来能保证一个稳定的渗透压。

4.分别培育基：

钙、镁离子很重要（？）；有时需要激素；PVP有时能增加原生质体

产量。分别原生质体的培育基用量一般为10mg/g组织。

5.培育条件：

最主要的是酶处理时的温度和pH0不同的酶需要的pH值不一样，但pH大于6时不

利于原生质体生存。一般而言，分别原生质体的培育时间与温度成反比，可是高温下短时

间分别的原生质体不适于培育，他们易发褐和裂开。但酶处理时间一般不超过24小时。

T殳常用温度是23-320C。酶处理时一般在暗处培育。叶片分别原生质体可在静置条件下

进行，悬浮细胞由于壁厚，培育（分别）

过程中间断低速震荡有利于酶渗透。

6.组织前处理：主要目的是便于原生质体分别和促进细胞分裂

高渗前处理

激素处理

低温处理

激素处理与低温处理结合使用

（三）原生质体的收集、纯化与活力测定

经酶解处理后，得到的混合物是一个由原生质体、细胞团与细胞碎片等组成的混合液，

只有将杂质和酶液去掉，使原生质体纯化，才能进行培育。

1.收集:原生质体混合液用滤网（40-100|im）去掉没有降解的细胞及组织，收集滤液.

2.洗涤:将网下物低速离心，去掉上清液，再加无酶液的CPW液悬起原生质体，再离心,

弃上清，重复几次即可.

3.纯化:

采纳上浮法和下沉法两种纯化方法。上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左

右）混合，下沉法是先将原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部,

形成一个界面。两种方法中，均在100g下离心5-10分钟，会在蔗糖溶液顶部形成一条

原生质体带。用吸管将带轻轻地吸出来，用培育基悬浮离心，然后稀释到104-105/ml,

用于培育。

4.活力测定：

原生质体培育前通常要进行活力检查,以便知道其状态是否正常。测定原生质体活力

的方法主要有观看胞质环流（Cytoplasmicstreaming1测定呼吸强度和FDA染色，其

中最常用的是FDA法。FDA是荧光素双醋酸酯（Fluoresceindiacetate,FDA）,常用丙酮

配置成2mg/ml溶液，在冰箱（4℃）中保存。FDA本身没有极性，无荧光,可以穿过细

胞膜自由出入细胞，在细胞中不能积累。在活细胞中，FDA经酯酶分解为荧光素，后者为

具有荧光的极性物质，不能自由出入细胞膜，从而在细胞中积累。在紫外光照耀下，发出

绿色荧光。相反假如是死细胞，则不会发出绿色荧光。

三、原生质体培育

1.原生质体计数

原生质体培育前必需调到肯定密度，即确定每毫升培育基中含多少原生质体.用

CPW13M悬浮原生质体,由球计数板计数，计算稀释倍数离心，去除CPW13M

,用所算体积的培育基悬起原生质体，用于培育.

2.原生质体培育

主要有三种方法:

Q)液体浅层培育(Liquidthinlayerculture)

原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培育基中，取少许于培育皿底部形成很薄的一

层，封口进行培育。

(2)固体培育(Solidculture)

也叫琼脂糖平板法(Agaroseplateculture)或包埋培育法(Embeddingculture\

将原生质体悬浮于液体培育基后，与凝固剂(主要是琼脂或低熔点琼脂糖，LMTagarose)

按肯定比例混合，在培育皿底部形成一薄层，凝固后封口培育。

(3)固液双层培育法(Solidoverliquidculture)

此法结合液体浅层培育和固体培育的优点，在培育皿底部先铺一层固体培育基,待凝

固后再在其上进行液体浅层培育。固体培育基中的养分成分可以被液体层中的原生质体汲

取采用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培育基汲取。

植板率(Platingefficiency,即形成愈伤组织的原生质体数量占所培育原生质体总数

的百分比).

3.细胞再生

Q)细胞壁的形成

原生质体培育后经过一段时间会再生出细胞壁，原生质体在培育初期仍旧为圆球形，

随着培育时间的延长，渐渐变为椭圆形，此时表明已经开头再生细胞壁。不同植物原生质

体培育再生细胞壁所需时间不一样，从几小时到几天。简洁的鉴别壁的再生的方法是用荧

光增白剂(CalcofouorWhite),专染纤维素，在荧光灯下发出荧光。一些因素影响壁的再生:

①碳源；②培育条件一固体培育时细胞壁再生比液体培育时快；③渗透剂的种类。

(2)细胞分裂

第一次分裂通常发生在培育后2-5天,可在黑麦中需14天。

4.植株再生

具有再生力量的原生质体就会不断分裂，形成多组胞团。当细胞团进一步发育成为肉

眼可见的小愈伤组织(Minicallus)，要准时转移到分化培育基(Differentiationmedium)

中，培育与再生过程同一般的愈伤组织培育。

四、影响原生质体细胞分裂的因素

物理条件

密度：低于肯定密度不能分裂,一般培育密度为：

5x103—5x105/mlo

光：一般原生质体首先在暗处培育一周利于壁形成和细胞再生。照光如何、什么时候

照光、光强如何等，直接影响着植板率。

温度：通常

22-250Co

化学因素

Q)培育基：

即使来源于同一种基因型的原生质体，在不同培育基中的再生力量也不一样。许智宏

等(1982,1984)发觉在形成细胞团的数量上,KM5P和KM5都不如B5P培育基，但

对细胞的持续分裂来说，KM5P和KM5又优于B5P培育基。培育基中的附加物质也会影

响到原生质体培育效果，如培育基中的激素、无机盐组成、氨基酸、有机酸等。MS铁盐

T殳对原生质体培育是有害的，50RM较合适,由于高铁能降低培育基的pH。

常用的KM8P培育基含有丰富的有机成分，包括维生素、AA、有机酸、核苦酸、糖

及糖醇等，已经证明有机酸(丙酮酸、苹果酸、柠檬酸、延