关咖啡因对机体的神经系统的影响

5前言近年来，随着食品工业的迅猛发展，人们的饮食结构发生了较大变化。于此同时，发达国家与发展中国家的不孕症患病率逐年增高,不孕症已成为全球关注的问题,我国的不孕症患病率也呈持续上升的趋势[1]。内分泌因素是引起不孕症的主要原因之一[2]。有研究发现，改变饮食可以明显改变机体内的内分泌，影响内分泌系统的功能[3]。卵巢是机体分泌类固醇激素的器官，同时也是承担生育功能的器官。在卵巢的发育周期中，各级卵泡细胞的发育受机体严格的调控，若内分泌干扰物影响生理调节机制的正常功能，则卵巢的发育周期紊乱、生育功能受影响[4]。据调查，截至2018年第三季度,全国现制茶饮门店数达到41万家[5]。从2018年3月18日提取的大众点评搜索次数来看，奶茶第一：总次数109130；咖啡第二：35242。从用户画像上统计，奶茶购买用户以女性为主，占73%，顾客的年龄集中在18-28岁之间[6]。可见奶茶最大的消费群体是年轻女性，而其中含有的咖啡因、植脂末对机体造成的影响需要重视。中国香港食物安全中心曾测定奶茶中咖啡因的含量，平均每升台式奶茶的咖啡因含量为320mg，而每升港式奶茶的咖啡因含量高达730mg[7]。一杯奶茶的咖啡因含量就超过了加拿大卫生部关于健康成人每日咖啡因摄入的每日限量400mg[8]。目前，我国将咖啡因列为第二类精神药品管制品种[9]。2016年，学者DuncanTurnbull研究发现，成人一次摄入100mg的咖啡因就可影响中枢神经系统，与腺苷受体相互作用，影响睡眠[10]。而一次摄入450mg咖啡因就可能引发受试者的紧张情绪[10]。一次摄入480mg的咖啡因就可能引起患有恐慌症的患者恐慌发作[10]。近年来随着茶饮等食品工业、经济的发展，我国平均成人每日咖啡因的摄入量明显增加，但我国还未制定关于特殊人群、一般人群的关于咖啡因摄入的法律法规[11]。植脂末主要成分包括如蛋白、乳糖、植物油及麦芽糊精，常用来添加于咖啡、红茶或者淋于果冻、茶冻、龟苓膏上方，用来增加食物风味以及顺滑口感的产品[12]。在加工植脂末的过程中，植物油的不饱和脂肪酸转变为半饱和脂肪酸，且产生反式脂肪酸[13]。市面上的速溶奶茶经检测，植脂末中的反式脂肪酸含量达8.6g/100g。根据《预包装食品营养标签通则》，成人每天每天摄入反式脂肪酸应少于2.2g[14]。长期大量摄入反式脂肪酸对人体的伤害不仅表现为增加心血管疾病、肿瘤的发病率，还会对生殖健康产生较大的影响[15]。且有研究表明长期过多摄入饱和脂肪酸会降低精子、卵细胞的质量[16-17]。也有回顾性研究表明长期摄入反式脂肪酸与卵巢癌的发病没有明显关联[18]。综上所述，目前有关咖啡因对机体的神经系统的影响及其机制的研究已较为深入详细，而有关咖啡因对机体女性内分泌作用的研究相对较少。且目前国内关于植脂末对女性内分泌系统影响机制的研究较少。奶茶中的咖啡因和植脂末联合作用对女性的生殖内分泌系统造成怎样的影响？是否有卵巢生殖毒性？其机制仍不明确。通过对小鼠长期灌胃染毒，测定其雌激素和孕激素水平，探索咖啡因和植脂末对小鼠卵巢的影响。1材料与方法1.1实验材料、试剂与仪器1.1.1材料材料名称植脂末咖啡因材料来源雀巢（中国）有限公司云南波邦咖啡股份有限公司1.1.2试剂试剂名称小鼠雌二醇(E2)检测ELISA试剂盒小鼠孕酮(PROG)检测ELISA试剂盒生产厂家江苏酶标生物科技有限公司江苏酶标生物科技有限公司1.1.3仪器仪器名称Sigma2K15型冷冻高速离心机超低温冰箱MDF--382ELDR4.8.4C低速大容量离心机BH一200显微镜OLYSIA—BioReport图像拍摄系统PARADIGMTM多功能酶标仪PipetmanP20单道数字可调移液枪PipetmanP200单道数字可调移液枪回转式石蜡切片机手提式不锈钢蒸汽消毒器生产厂家SigmaLaborzentrifugenGmbH公司日本三洋公司北京医用离心机厂日本Olympus公司日本Olympus公司美国Beckman公司德国Gilson公司德国Gilson公司上海仪表厂上海三申医疗器械有限公司1.1.4实验动物三周龄清洁级G57BL/6雌性小鼠72只，体重20±2g，由福建医科大学实验动物中心提供。小鼠分笼饲养，饲养环境控制温度18～29℃，相对湿度40％～70％。光周期控制明：暗(14h：10h)。置于垫以消毒锯木屑的塑料笼，自由饮水进食。1.2研究方法1.2.1实验动物分组及干预方法将72只雌性小鼠随机分为九组，每组8只。参考《药理实验方法学》中人和动物间按照体表面积折算的等效剂量比值，计算出小鼠的给药剂量。参照知名奶茶店一点点的奶茶配方，一杯350ml的奶茶含有87.5g的植脂末，按照等效剂量比值计算，得出小鼠剂量水平为13.3g/kg，水平2的植脂末和咖啡因是模拟一杯奶茶的比例剂量，为了方便称取，取近似值15g/kg为小鼠的植脂末中度水平灌胃量。根据健康成人的每日咖啡因摄入限量400mg，算出小鼠咖啡因中度水平灌胃量为60mg/kg。水平3为水平2的四倍。采用正交表L9（32）设计正交实验，因素和水平如下：表1实验因素及水平表水平因素A（植脂末）B（咖啡因）10g/kg0mg/kg215g/kg60mg/kg360g/kg240mg/kg共考察2因素，3水平，A因素为植脂末，B因素咖啡因，共有9种组合，具体设计如下：表2L9（32）正交表水平因素A（植脂末）（g/kg）B（咖啡因）（mg/kg）11（0）1（0）21（0）2（60）31（0）3（240）42（15）1（0）52（15）2（60）62（15）3（240）73（60）1（0）83（60）2（60）93（60）3（240）1.2.2染毒分别配置植脂末灌胃液、咖啡因灌胃液及生理盐水，使用1mL注射器和16号金属钝针头灌胃。每3天称量小鼠体重，按1.0ml/100g.调整灌胃量，予以灌胃。染毒一天一次，每周6次，连续染毒6周。染毒4周后开始观察动情周期，小鼠的动情周期为两次相邻动情期的间隔时间，一般为4-5天。染毒结束后，待动物进入动情期时处死。处死前采用抠眼球取血，将血样制备成血清。1.2.3样本采集与处理小鼠处死前采用抠眼球取血，离心(3000转／分，6分钟)分离血清，血样在4℃静置3h后，离心(2000r／m×15min)，用移液枪吸取上清至1.5mlEppendorf管，置于-20℃冰箱保存。小鼠每3天称量一次，持续整个饲养期。禁食前一天最后一次称取体重，计算脏器指数(脏器指数=mg脏器重量／l00g体重量)。1.2.4血清E2和P的测定按照ELISA试剂盒操作规范进行操作,所有样品同批次测定,以避免批间误差。测定结束后以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线根.据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,乘以稀释倍数,或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。1.3统计学方法动物喂养和实验过程中所出现的动物死亡均不作为本次统计结果分析。所有数据采用IBMSPSS20.0软件进行统计分析。定量资料用（`X±S）表示，各指标数据经过正态性检验和方差齐性检验，进行单因素方差分（One-WayANOVA），若方差齐性则采用LSD法进行两两比较，若方差不齐则采用Dunnett’sT3进行两两比较。对于不符合正态分布的数据采用Kruskal-WallisH非参数检验。检验水准α=0.05，所有分析结果取双侧P值，以P<0.05为差异有统计学意义。若数据分析认为差异没有统计学意义（P＞0.05），则使用正交设计实验的极差分析法进行直观分析，然后进行计算分析，计算权重。2结果与分析2.1小鼠一般指标的变化2.1.1体重如图1所示，各组小鼠平均体重均呈上升趋势。如表3所示，开始各组小鼠体重无明显差别（P>0.05）。实验结束时，1组的终体重与体重变化明显高于5、6、7、8组（P<0.05）。2组的终体重与体重变化均明显高于5、6、8组（P<0.05）。3组的终体重与体重变化均明显高于6组（P<0.05）。4组的体重变化明显高于5、6、7、8组（P<0.05）。7组的终体重与体重变化明显高于6组（P<0.05）。9组的终体重与体重变化明显高于5、8组（P<0.05）。表3各组间的小鼠体重比较（X±S）组别n初体重（g）终体重（g）体重变化（g）1（植脂末0g/kg；咖啡因0mg/kg）620.650±1.15729.798±2.3649.148±1.3522（植脂末0g/kg；咖啡因60mg/kg）820.575±1.73429.176±1.7738.601±1.2813（植脂末0g/kg；咖啡因240mg/kg）620.317±2.34628.610±2.0838.293±0.3794（植脂末15g/kg；咖啡因0mg/kg）820.775±1.45030.166±1.825※9.391±0.545※5（植脂末15g/kg；咖啡因60mg/kg）719.614±1.37327.049±1.880*#◎7.434±0.972*#◎6（植脂末15g/kg；咖啡因240mg/kg）420.700±1.47227.533±1.550*#※◎6.833±0.395*#※◎7（植脂末60g/kg；咖啡因0mg/kg）820.763±1.18428.871±1.903*◎■8.109±1.090*◎■8（植脂末60g/kg；咖啡因60mg/kg）720.214±1.81128.670±2.129*#◎7.456±0.862*#◎9（植脂末60g/kg；咖啡因240mg/kg）520.140±1.45428.868±0.729Δ■☆8.728±0.170Δ■☆注：*代表P<0.05与1组比较；#代表P<0.05与2组比较；※代表P<0.05与3组比较；◎代表P<0.05与4组比较；Δ代表P<0.05与5组比较；■代表P<0.05与6组比较；☆代表P<0.05与8组比较。2.1.2卵巢脏器系数如表4所示，1组的卵巢重量及其脏器系数明显高于3、6组（P>0.05）。2组的卵巢重量及其脏器系数明显高于4、6、9组（P>0.05）。3组的卵巢重量及其脏器系数明显高于4、5、7、8、9组（P>0.05）。4、5、7、8、9组的卵巢重量及其脏器系数明显高于6组（P>0.05）。表4各组小鼠卵巢重量及卵巢脏器系数比较（X±S）组别n卵巢重量（mg）卵巢脏器系数（%）1618.500±3.6190.623±0.1262814.125±3.8340.486±0.1403612.000±6.033*0.410±0.181*4819.875±3.758#※0.662±0.138#※5718.857±5.146#※0.708±0.248#※6410.500±3.512*◎Δ0.382±0.126*◎Δ7817.875±4.389※■0.628±0.185※■8718.714±5.678※■0.649±0.191※■9520.800±3.962#※■0.722±0.145#※■注：*代表P<0.05与1组比较；#代表P<0.05与2组比较；※代表P<0.05与3组比较；◎代表P<0.05与4组比较；Δ代表P<0.05与5组比较；■代表P<0.05与6组比较。图2各组小鼠鼠干预期结束后卵巢脏器系数2.1.3各组小鼠雌激素（E2）水平对比如表5所示。各组间小鼠的雌激素水平差异无统计学意义（P＞0.05）。表5各组小鼠雌激素（E2）水平比较（X±S）组别n雌激素水平17180.546±77.19026193.382±34.79438164.985±24.81946189.039±63.83257171.504±87.89868160.265±27.63177146.496±86.95187167.110±48.01198155.360±60.597对小鼠雌激素水平进行极差分析：表6L9（32）正交量表与雌激素水平数据表水平因素A（植脂末）（g/kg）B（咖啡因）（mg/kg）雌激素水平11（0）1（0）180.54621（0）2（60）193.38231（0）3（240）164.98542（15）1（0）189.03952（15）2（60）171.50462（15）3（240）160.26573（60）1（0）146.49683（60）2（60）167.11093（60）3（240）155.360K1179.638172.027K2174.603177.332K3156.322160.203R23.31617.129权重58%42%如表6所示，经计算，从K值栏中，A因素的K3（156.322）值最小，B因素的K3（160.203）值最小，又从R栏得知，A（23.316）＞B（17.129），故使用符号A3B3表示其权重顺序。对雌性小鼠雌激素分泌量水平影响最大的为A3B3，植脂末占58%的影响因素，咖啡因占42%的影响因素。2.1.4各组小鼠孕激素（P）水平对比如表7所示。各组间小鼠的孕激素（P）水平差异无统计学意义（P＞0.05）。表7各组小鼠孕激素（P）水平比较（X±S）组别n孕激素水平17902.731±385.95226966.912±173.96838824.927±124.09546945.196±319.15957857.521±439.49168801.324±138.15777732.479±434.75587835.546±240.05398776.801±302.983对小鼠孕激素水平进行极差分析：表8L9（32）正交量表与孕激素水平数据表水平因素A（植脂末）（g/kg）B（咖啡因）（mg/kg）孕激素水平11（0）1（0）902.73121（0）2（60）966.91231（0）3（240）824.92742（15）1（0）945.19652（15）2（60）857.52162（15）3（240）801.32473（60）1（0）732.47983（60）2（60）835.54693（60）3（240）776.801K1898.190860.135K2868.134886.680K3781.609801.017R116.58185.545权重58%42%如表8所示，经计算，从K值栏中，A因素的K3（781.609）值最小，B因素的K3（801.017）值最小，又从R栏得知，A（116.581）＞B（85.545），故使用符号A3B3表示其权重顺序。对雌性小鼠孕激素分泌量水平影响最大的为A3B3，植脂末占58%的影响因素，咖啡因占42%的影响因素。3讨论近几十年来，随着我国经济的快速发展和生活方式、饮食习惯的转变和食品工业的飞速发展．居民膳食结构和生活方式也发生了很大的转变。人们摄入的高脂肪热量食物和食品添加剂增多，于此同时，心血管疾病、代谢综合症甚至癌症等疾病的发病率增高。且有越来越多证据表明膳食结构的改变与我国近年来不孕症发病率逐年上升有关。这些营养相关疾病已经成为重要的公共卫生问题，如何科学规范地摄入营养也越来越受人们的关注。本次实验期间，在饲养3周后，高水平植脂末+高水平咖啡因组小鼠尾部全有啃咬痕迹，小鼠四肢脚趾皆红肿，并有啃咬痕迹及血迹。期间经过观察，高水平植脂末+高水平咖啡因组小鼠精神状态相比对照组小鼠较为暴躁、有攻击行为，不采取干预措施。同时高水平咖啡因组的部分小鼠在灌胃后抽搐死亡，而低水平咖啡因组小鼠则无此情况。年未未[19]等研究发现，小鼠出现暴躁、攻击行为的现象可能是由于脑组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总超氧化物歧化酶(SOD）活性下降、海马细胞受损所致。也有研究表明，一次摄入480mg的咖啡因就可能引起患有恐慌症的患者恐慌发作[20]。咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，在中枢神经系统中起非选择性腺苷受体拮抗剂的作用，长时间使用可能会诱发临床依赖性综合征，并可能引起戒断症状，例如短暂性认知障碍和烦躁不安[21]。根据实验观察，我们推测是由于高浓度的咖啡因摄入干扰了小鼠的中枢神经系统海马回，从而导致小鼠躁动不安。若要进一步探索其发生原因，则需再进行进一步的研究。在本次研究中，各组小鼠体重在实验期间均有增长的趋势。同未添加植脂末组小鼠相比，中、高水平植脂末组的小鼠组体重增长较为缓慢，体重变化量也明显低于未添加植脂末组，说明植脂末明显抑制机体体重的增长。未添加咖啡因组小鼠的体重增长显著高于中剂量咖啡因组，这与Gregory[22]等的研究结果一致，咖啡因降低了与高脂饮食相关的体重增加。但高剂量咖啡因组的小鼠体重增长显著高于中剂量咖啡因组，其作用机制有待于进一步探索。未添加植脂末与咖啡因组的小鼠卵