猪流行性腹泻病毒中国变异株S基因重组伪狂犬病病毒构建及特性研究

猪流行性腹泻病毒中国变异株S基因重组伪狂犬病病毒构建及特性研究一、引言1.1研究背景与意义猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）和伪狂犬病病毒（PseudorabiesVirus，PRV）均是严重威胁养猪业发展的重要病原。PEDV作为一种冠状病毒，主要感染猪的肠道，引发猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）。自2010年以来，PEDV变异株在中国及全球多地引发了大规模的疫情，给养猪业带来了沉重的打击。感染PEDV的猪，尤其是新生仔猪，会出现呕吐、腹泻、脱水等症状，死亡率极高，可达到80%-100%。这不仅导致仔猪的大量死亡，减少了可用猪和生猪的供应量，还使得养猪场的生产成本大幅增加，严重影响了养猪业的经济效益。例如，2013年PEDV在美国首次暴发后迅速蔓延，造成了巨大的经济损失。在中国，PEDV的流行也使得众多猪场面临着严峻的挑战，许多猪场因PEDV的感染而遭受了惨重的损失。PRV则属于疱疹病毒科，可引起猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）。该病在猪群中广泛传播，感染猪会出现发热、奇痒、神经症状等，妊娠母猪感染后还会发生流产、死胎等情况，对养猪业的危害同样不容忽视。自上世纪90年代以来，我国虽然应用Bartha-K61株疫苗进行了广泛免疫，在一定程度上有效防控了伪狂犬病的大范围暴发流行，但2011年以来，PRV变异株的出现再次给养猪业带来了新的危机。与以往毒株相比，PRV变异株除抗原表位发生变化外，感染动物表现出更严重的神经症状，导致猪群的死亡率上升，给养猪场造成了严重的经济损失。目前，针对PEDV和PRV的防控主要依赖疫苗接种，但传统疫苗在应对PEDV变异株和PRV变异株时，效果往往不尽人意。因此，研发新型疫苗成为了防控这两种疫病的关键。构建表达PEDV中国变异株S基因的重组伪狂犬病病毒，有望为这两种疫病的防控提供新的解决方案。通过将PEDV中国变异株的S基因整合到PRV基因组中，使重组病毒既能表达PEDV的关键抗原，又能利用PRV的特性激发机体的免疫反应，从而实现对PEDV和PRV的同时免疫。这种重组病毒活载体疫苗具有多种优势，如能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，免疫效果持久；可以通过黏膜途径接种，更有效地激发黏膜免疫，抵抗病毒的入侵；而且只需一剂接种即可完成免疫程序，操作简便，节省人力和物力。这对于提高猪群的免疫力，减少PEDV和PRV的感染，降低养猪业的经济损失具有重要意义，同时也为其他疫病的疫苗研发提供了新的思路和方法。1.2国内外研究现状在PEDV中国变异株S基因的研究方面，自2010年PEDV变异株在中国引发大规模疫情以来，众多学者针对其S基因开展了深入研究。S基因编码的刺突蛋白（S蛋白）是PEDV的主要免疫原性蛋白，在病毒感染和免疫应答过程中发挥着关键作用。研究发现，中国变异株的S基因与经典毒株相比存在显著差异，这些差异主要体现在核苷酸序列和氨基酸序列的突变上。例如，一些研究通过对不同地区PEDV中国变异株S基因的测序和分析，发现其S1亚基的N端高变区存在多个氨基酸位点的突变，这些突变可能影响S蛋白与宿主细胞受体的结合能力，进而改变病毒的感染特性和免疫原性。对PEDV中国变异株S基因的遗传进化分析也取得了重要进展。通过构建系统发育树，研究人员发现中国变异株的S基因主要分为G2基因型，其中又可进一步细分为G2a和G2b等亚型。不同亚型的S基因在核苷酸和氨基酸水平上存在一定的差异，这些差异与病毒的地理分布、流行时间等因素密切相关。深入了解S基因的遗传进化规律，有助于追踪病毒的传播途径和变异趋势，为疫苗的研发和防控策略的制定提供科学依据。在PRV的研究领域，国内外学者围绕其病毒特性、致病机制、疫苗研发等方面进行了广泛而深入的探索。PRV作为一种重要的兽用疫苗载体，具有诸多优势。其基因组较大，能够容纳较大片段的外源基因插入；病毒稳定性好，在宿主细胞内能够高效复制并表达外源基因；而且PRV能够诱导机体产生强烈的免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫，这使得它成为构建重组病毒疫苗的理想选择。针对PRV的致病机制，研究表明，病毒的囊膜蛋白如gB、gC、gD等在病毒入侵宿主细胞、感染和致病过程中发挥着关键作用。这些蛋白不仅参与病毒与宿主细胞表面受体的结合，还在病毒的吸附、侵入、膜融合等过程中发挥重要功能。此外，PRV的一些毒力相关基因也被逐渐揭示，如TK基因、gE基因等，这些基因的缺失或突变会影响病毒的毒力和致病性，为研发减毒活疫苗提供了理论基础。在疫苗研发方面，PRV疫苗的发展经历了多个阶段。早期的PRV疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，这些疫苗在一定程度上控制了PRV的传播，但在应对PRV变异株时存在局限性。近年来，随着基因工程技术的不断发展，基因工程疫苗成为研究热点。例如，通过基因缺失技术构建的缺失毒力相关基因的减毒活疫苗，以及利用PRV作为载体表达其他病原抗原的重组病毒疫苗，都展现出良好的应用前景。在重组病毒构建方面，国内外已有众多成功的案例。许多研究尝试将不同的外源基因整合到PRV基因组中，以构建具有多种免疫原性的重组病毒。例如，有研究将猪瘟病毒的E2基因插入PRV基因组中，构建出能够同时预防猪伪狂犬病和猪瘟的重组病毒疫苗；还有研究将口蹄疫病毒的VP1基因整合到PRV中，为口蹄疫的防控提供了新的思路。这些研究表明，重组病毒构建技术在兽用疫苗研发领域具有巨大的潜力。然而，目前针对表达PEDV中国变异株S基因的重组伪狂犬病病毒的研究仍相对较少。虽然已有一些相关报道，但在重组病毒的构建方法、免疫原性评估、安全性评价等方面还存在许多需要深入研究和完善的地方。因此，开展这方面的研究具有重要的理论意义和实际应用价值，有望为PEDV和PRV的防控提供更加有效的手段。1.3研究目标与内容本研究旨在构建表达PEDV中国变异株S基因的重组伪狂犬病病毒，为猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的防控提供一种新型的双价疫苗候选株。通过对重组病毒的构建、鉴定及特性分析，深入了解其生物学特性和免疫原性，为后续的疫苗研发和应用奠定基础。具体研究内容如下：重组病毒的构建：从PEDV中国变异株中扩增S基因，利用基因克隆技术将其插入到伪狂犬病病毒的特定基因组位点，构建重组病毒。首先，通过RT-PCR技术从感染PEDV中国变异株的细胞中扩增出S基因，对其进行测序和序列分析，确保基因的准确性和完整性。随后，选择合适的伪狂犬病病毒载体，如Bartha-K61株，利用同源重组技术将S基因表达盒插入到病毒基因组的非必需区域，如TK基因或gE基因位点，构建重组伪狂犬病病毒。在构建过程中，需优化重组条件，提高重组效率，确保重组病毒的成功构建。重组病毒的鉴定：对构建的重组病毒进行全面鉴定，包括病毒形态观察、基因测序验证、S基因表达检测等。通过电镜观察重组病毒的形态结构，与野生型伪狂犬病病毒进行对比，确认其形态特征是否正常。采用PCR和测序技术，对重组病毒基因组中的S基因及插入位点进行精确分析，验证基因插入的正确性和稳定性。利用免疫荧光、Westernblot等方法，检测重组病毒感染细胞后S蛋白的表达情况，确定S蛋白的表达水平和表达特征。重组病毒的特性分析：研究重组病毒的生长特性、遗传稳定性及免疫原性。通过测定重组病毒在不同细胞系中的生长曲线，分析其增殖能力和病毒滴度变化，评估其生长特性是否与野生型伪狂犬病病毒相似。将重组病毒在细胞中连续传代，定期检测S基因的稳定性和表达情况，研究其遗传稳定性。利用动物实验，如小鼠、仔猪等，评估重组病毒的免疫原性，检测免疫动物血清中针对PEDV和PRV的抗体水平，以及细胞免疫应答情况，为疫苗的研发提供依据。二、相关病毒及技术原理2.1伪狂犬病病毒（PRV）2.1.1PRV的生物学特性伪狂犬病病毒（PseudorabiesVirus，PRV）属于疱疹病毒科疱疹病毒亚科水痘病毒属，其病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径约150-180nm。病毒粒子由最外层的囊膜、中间的核衣壳以及内部的线性双链DNA基因组构成。囊膜表面有呈放射状紧密排列的纤突，这些纤突由多种糖蛋白组成，如gB、gC、gD、gE等，它们在病毒的吸附、侵入宿主细胞以及免疫逃逸等过程中发挥着关键作用。例如，gD蛋白能够与宿主细胞表面的受体结合，介导病毒的入侵；gE蛋白则与病毒的毒力和免疫逃逸密切相关。PRV的基因组大小约为150kb，包含70-100个基因，编码多种病毒蛋白，可分为病毒复制相关蛋白、结构蛋白和非结构蛋白等。这些蛋白在病毒的生命周期中各司其职，如病毒复制相关蛋白参与病毒基因组的复制和转录，结构蛋白则构成病毒粒子的各个组成部分。PRV对外界环境具有较强的抵抗力，在低温或潮湿环境下能够存活较长时间，在pH6-8的范围内可长期保持活性。然而，在干燥、高温环境下，特别是在光照条件下，病毒容易失活。PRV对有机溶剂如乙醚、氯仿等较为敏感，常用的消毒剂如0.5%-1%NaOH、碘酊、季铵盐和酚类化学试剂等均可迅速将其灭活。PRV具有广泛的宿主范围，能够感染多种哺乳动物，包括猪、牛、羊、犬、猫、兔子、啮齿动物等，其中猪是其唯一的自然宿主。在猪群中，PRV可感染不同年龄段的猪，引起不同的临床症状。此外，PRV还具有广泛的细胞嗜性，能在多种动物组织细胞中增殖，如猪肾细胞、猪睾丸细胞、鸡胚成纤维细胞、兔肾细胞以及一些传代细胞系如PK-15细胞、HEK293细胞等。在细胞培养中，PRV感染细胞后可引起典型的细胞病变，如细胞变圆、聚集、融合形成合胞体等。2.1.2PRV的致病机制与流行病学PRV的致病机制较为复杂，病毒主要通过呼吸道、消化道或破损的皮肤黏膜等途径侵入猪体。感染初期，病毒在鼻、口咽黏膜上皮细胞中进行复制，随后通过神经末梢的逆行运输进入外周神经系统神经元，进而扩散到中枢神经系统，在神经节内建立潜伏感染。当猪体受到应激等因素刺激时，潜伏的病毒可被激活，重新复制并沿神经纤维传播，引起相应的临床症状。在全球范围内，PRV的流行较为广泛。自1813年美国首次报道伪狂犬病病例以来，该病已在多个国家和地区出现。在20世纪70-80年代，随着全球养猪业的发展，PRV在全世界猪群内暴发，并出现了持续数十年的大流行。虽然一些国家通过疫苗接种和其他根除措施，成功净化了国内猪群的伪狂犬病，但部分国家仍有二次暴发的情况，如阿根廷在2019年、法国在2020年、墨西哥在2020年都再次出现了伪狂犬病疫情。我国于1947年首次报道家猫感染PRV，随后猪、牛、羊等家畜也陆续出现伪狂犬病病例。20世纪80年代初，由于国内猪养殖检测技术和生物安全管理水平较低，PRV在国内大部分地区流行。之后，我国从匈牙利引进商品化的伪狂犬Bartha-K61疫苗，疫情得到了有效控制。然而，2011年国内许多猪场再次暴发伪狂犬病疫情，经分子生物学分析证实为PRV变异株引起，且Bartha-K61疫苗无法为仔猪提供针对这些新变种的完全保护。PRV的传播途径主要包括直接接触传播和间接接触传播。直接接触传播是指带毒猪与易感猪直接接触，通过口鼻分泌物、尿液、粪便等排出病毒，感染易感猪。间接接触传播则是通过被病毒污染的饲料、饮水、器具、车辆以及人员等传播媒介，将病毒传播给易感猪。此外，PRV还可通过空气传播，在低温潮湿的环境中，病毒可在空气中传播数公里。妊娠母猪感染PRV后，可经胎盘将病毒传播给胎儿，导致新生仔猪发病，窝发病率可达100%，15日龄仔猪发病死亡率高达100%。2.1.3PRV的防控现状目前，PRV的防控主要依赖疫苗接种、生物安全措施和监测净化等综合手段。疫苗是防控PRV的重要武器，主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗等。灭活疫苗安全性高，但免疫原性相对较弱，需要多次接种才能达到较好的免疫效果；弱毒疫苗免疫原性强，能够诱导机体产生较强的免疫反应，但存在毒力返强的风险；基因工程疫苗则是利用基因工程技术，对PRV的某些基因进行缺失或修饰，构建出安全有效的疫苗，如gE基因缺失疫苗、TK基因缺失疫苗等，这些疫苗不仅具有良好的免疫原性，还能够用于鉴别诊断，区分疫苗免疫动物和野毒感染动物。在实际应用中，我国自20世纪90年代开始广泛使用Bartha-K61株gE基因缺失疫苗，对PRV的防控起到了积极作用，大部分猪场有效地控制了伪狂犬病的发生。然而，2011年PRV变异株的出现，使得传统疫苗的保护效果受到挑战。变异株与经典毒株相比，在基因序列和抗原性上存在差异，导致传统疫苗对变异株的免疫保护力下降。为了应对这一挑战，国内一些科研机构和企业开始研发针对PRV变异株的新型疫苗，如变异株同源病毒研发的基因缺失疫苗等，这些新型疫苗在一定程度上提高了对变异株的保护效果。除了疫苗接种，生物安全措施也是防控PRV的关键。猪场应加强饲养管理，保持猪舍的清洁卫生，定期进行消毒，严格控制人员、车辆和物资的进出，防止病毒的传入和传播。同时，要做好猪群的监测工作，定期采集猪的血液、鼻腔分泌物等样本进行检测，及时发现感染猪，采取隔离、淘汰等措施，防止疫情的扩散。此外，还应加强对种猪的管理，确保种猪的健康，避免将病毒垂直传播给仔猪。尽管采取了一系列防控措施，但PRV的防控仍然面临诸多挑战。一方面，PRV变异株的出现使得疫苗的研发和防控策略的制定变得更加困难；另一方面，部分猪场的生物安全意识淡薄，防控措施执行不到位，导致PRV在一些地区仍然存在流行和传播的风险。因此，未来需要进一步加强对PRV的研究，不断优化防控策略，提高防控效果，以保障养猪业的健康发展。2.2猪流行性腹泻病毒（PEDV）中国变异株2.2.1PEDV中国变异株的发现与流行猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，是引起猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）的病原体。PED是一种以呕吐、腹泻和脱水为主要症状的高度接触性肠道传染病，对养猪业危害巨大。自1971年英国首次报道PED以来，该病陆续在多个国家和地区出现，如比利时、德国、法国、日本、韩国等。我国于1984年首次报道PEDV感染病例，并成功分离到PEDV华（H）株、川（CH）毒株及吉（J）毒株。此后，PEDV在我国部分地区呈散发或地方性流行。2010年底，我国南方地区突然暴发大规模PED疫情，随后迅速蔓延至全国多个省份，给养猪业造成了巨大的经济损失。据报道，此次疫情导致超过一百万头仔猪死亡，七日龄仔猪的发病率可达100%，死亡率为80%-100%。通过对病原PEDV毒株的全S基因测序分析，发现此次疫情是由变异PEDV毒株引起的。与经典PEDV毒株相比，变异毒株在基因序列上存在显著差异，尤其是S基因的变异更为明显，变异区域主要位于S1亚基的N端高变区。这些变异使得变异毒株在生物学特性、抗原性等方面发生改变，导致传统疫苗的保护效果不佳。自2010年变异PEDV毒株出现后，其在我国及全球范围内持续流行。在我国，变异PEDV毒株已成为主要的流行毒株，且呈现出一定的地域分布特点。不同地区的变异毒株在基因序列上存在一定的差异，进一步增加了防控的难度。例如，一些研究对我国不同地区的PEDV毒株进行了遗传进化分析，发现它们主要分为G2基因型，其中又可细分为G2a和G2b等亚型，各亚型在不同地区的流行情况有所不同。在全球范围内，变异PEDV毒株也在多个国家和地区引发了疫情。2013年，变异PEDV首次在美国暴发，并迅速传播至多个州，造成了大量仔猪死亡和经济损失。随后，加拿大、墨西哥、韩国、日本等国家也相继报道了变异PEDV的流行。这些国家的疫情表明，变异PEDV具有较强的传播能力和致病性，已成为全球养猪业面临的重要威胁。2.2.2PEDV中国变异株S基因的结构与功能PEDV中国变异株的S基因编码刺突蛋白（S蛋白），该蛋白是病毒粒子表面的重要结构蛋白，由S1和S2两个亚基组成。S1亚基位于病毒粒子表面，含有多个抗原表位和受体结合结构域，主要负责与宿主细胞表面受体结合，介导病毒的吸附和入侵；S2亚基则主要参与病毒与宿主细胞膜的融合过程，促进病毒基因组进入宿主细胞。与经典PEDV毒株的S基因相比，中国变异株的S基因在核苷酸和氨基酸序列上存在多个突变位点。这些突变主要集中在S1亚基的N端高变区，导致S蛋白的抗原性发生改变。例如，一些研究发现，变异株S基因的某些氨基酸突变会影响S蛋白与宿主细胞受体的结合亲和力，进而改变病毒的感染特性和免疫原性。S基因在病毒感染和免疫逃逸过程中发挥着关键作用。在病毒感染方面，S蛋白通过与宿主细胞表面的受体结合，启动病毒的感染过程。研究表明，猪氨肽酶N（APN）是PEDV的主要受体，S蛋白的S1亚基能够与APN特异性结合，从而使病毒能够侵入宿主细胞。此外，S蛋白还可以通过其他方式促进病毒的感染，如诱导细胞融合，形成合胞体，有利于病毒在细胞间的传播。在免疫逃逸方面，S基因的变异使得变异株能够逃避宿主免疫系统的识别和攻击。由于S蛋白是主要的免疫原性蛋白，其抗原性的改变会导致宿主产生的中和抗体无法有效中和变异株，从而使病毒能够在宿主体内持续感染和复制。例如，一些研究发现，针对经典毒株的中和抗体对变异株的中和活性明显降低，这表明变异株通过S基因的变异实现了免疫逃逸。S基因也是疫苗研发的关键靶点。传统的PEDV疫苗主要基于经典毒株的S基因设计，然而由于变异株S基因的变化，这些疫苗对变异株的保护效果不佳。因此，研发针对变异株S基因的新型疫苗成为当前的研究热点。通过对变异株S基因的深入研究，了解其结构和功能特点，有助于设计出更有效的疫苗，提高对变异株的免疫保护效果。例如，一些研究尝试将变异株S基因的关键抗原表位导入到疫苗载体中，以增强疫苗对变异株的免疫原性。2.2.3PEDV的防控现状目前，PEDV的防控主要依赖疫苗接种、生物安全措施和饲养管理等综合手段。疫苗是防控PEDV的重要武器，主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗等。灭活疫苗是将PEDV经过灭活处理后制成的疫苗，其安全性高，但免疫原性相对较弱，需要多次接种才能达到较好的免疫效果；弱毒疫苗是通过对PEDV进行减毒处理得到的，免疫原性强，能够诱导机体产生较强的免疫反应，但存在毒力返强的风险；基因工程疫苗则是利用基因工程技术，对PEDV的某些基因进行修饰或表达，构建出安全有效的疫苗，如亚单位疫苗、核酸疫苗等。在实际应用中，我国自20世纪90年代开始使用PEDV疫苗，早期主要使用的是基于经典毒株的疫苗，在一定程度上控制了PEDV的传播。然而，2010年变异株出现后，传统疫苗的保护效果受到了严重挑战。由于变异株与经典毒株在S基因等关键基因上存在差异，传统疫苗对变异株的免疫保护力大幅下降。据调查，使用传统疫苗的猪场在面对变异株感染时，仔猪的发病率和死亡率仍然较高，防控效果不理想。为了应对变异株的挑战，国内一些科研机构和企业开始研发针对变异株的新型疫苗。这些新型疫苗主要基于变异株的S基因或其他关键基因设计，通过优化疫苗制备工艺和免疫途径等，提高疫苗对变异株的免疫保护效果。例如，一些研究将变异株的S基因克隆到合适的表达载体中，制备出亚单位疫苗；还有一些研究利用反向遗传技术，构建出重组PEDV疫苗株。虽然这些新型疫苗在实验室研究和临床试验中表现出了较好的免疫原性和保护效果，但在实际应用中仍存在一些问题，如疫苗的生产成本较高、免疫程序复杂等，限制了其大规模推广和应用。除了疫苗接种，生物安全措施也是防控PEDV的重要环节。猪场应加强饲养管理，保持猪舍的清洁卫生，定期进行消毒，严格控制人员、车辆和物资的进出，防止病毒的传入和传播。同时，要做好猪群的监测工作，定期采集猪的粪便、血清等样本进行检测，及时发现感染猪，采取隔离、淘汰等措施，防止疫情的扩散。此外，还应加强对种猪的管理，确保种猪的健康，避免将病毒垂直传播给仔猪。尽管采取了一系列防控措施，但PEDV的防控仍然面临诸多挑战。一方面，PEDV变异株的不断出现和进化，使得疫苗的研发和防控策略的制定变得更加困难；另一方面，部分猪场的生物安全意识淡薄，防控措施执行不到位，导致PEDV在一些地区仍然存在流行和传播的风险。因此，未来需要进一步加强对PEDV的研究，不断优化防控策略，提高防控效果，以保障养猪业的健康发展。2.3重组病毒构建技术原理2.3.1细菌人工染色体（BAC）技术细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosome，BAC）技术是以大肠杆菌致育因子（F因子）为基础构建的一种大型克隆载体系统。F因子是一种可以自主复制的质粒，它能够稳定地存在于大肠杆菌细胞中，并且在细胞分裂时能够准确地分配到子代细胞中。BAC载体利用了F因子的这些特性，将外源基因克隆到F因子上，从而实现对外源基因的稳定克隆和表达。BAC载体的结构通常包括F因子的复制起始位点（oriS）、分配位点（parA和parB）、选择标记基因（如氯霉素抗性基因等）以及多克隆位点（MCS）。oriS确保了BAC载体在大肠杆菌中的自主复制，parA和parB则保证了载体在细胞分裂时能够均匀地分配到子代细胞中，选择标记基因用于筛选含有BAC载体的大肠杆菌细胞，MCS则为外源基因的插入提供了多个酶切位点。在PRV重组病毒构建中，BAC技术具有诸多优势。首先，BAC载体能够容纳较大片段的外源基因插入，PRV的基因组较大，需要容纳PEDV中国变异株S基因等外源基因，BAC技术能够满足这一需求。其次，BAC载体在大肠杆菌中具有较高的稳定性，能够保证重组病毒基因组的完整性和稳定性，减少基因缺失、突变等现象的发生。此外，利用BAC技术构建重组病毒的操作相对简便，可通过同源重组等方法将外源基因精确地整合到PRV基因组中，提高重组效率。具体应用时，首先需要构建含有PRV基因组的BAC克隆。通过将PRV的全基因组克隆到BAC载体上，获得含有PRV基因组的重组BAC质粒。然后，利用同源重组技术将PEDV中国变异株S基因表达盒插入到PRV基因组的特定位置，如TK基因或gE基因位点。在大肠杆菌中对重组BAC质粒进行筛选和鉴定，确保S基因正确插入且无其他突变。最后，将重组BAC质粒转染到合适的细胞系中，如猪肾细胞（PK-15）或猪睾丸细胞（ST），使重组病毒在细胞内包装和复制，从而获得表达PEDV中国变异株S基因的重组伪狂犬病病毒。例如，在一些研究中，通过BAC技术成功构建了表达外源基因的PRV重组病毒，这些重组病毒在细胞培养和动物实验中表现出良好的生物学特性和免疫原性，为疫苗的研发提供了有力的支持。2.3.2同源重组技术同源重组是指发生在两条DNA分子之间，基于它们的同源序列进行的遗传物质交换过程。其原理是在细胞内，当两条具有同源序列的DNA分子相遇时，在相关酶的作用下，它们会发生配对、断裂和重新连接，从而实现遗传物质的交换。在病毒基因编辑中，同源重组技术被广泛应用于将外源基因整合到病毒基因组中。同源重组技术的过程主要包括以下几个步骤：首先，设计并构建含有同源臂和外源基因的重组载体。同源臂是与病毒基因组特定区域具有高度同源性的DNA序列，其长度通常在几百到几千碱基对之间，同源性越高，重组效率越高。外源基因则是需要插入到病毒基因组中的目标基因，如PEDV中国变异株S基因。将重组载体导入到含有病毒基因组的细胞中。在细胞内，重组载体的同源臂会与病毒基因组的相应同源区域发生配对。细胞内的重组酶系统识别到配对的同源序列后，会介导重组载体与病毒基因组之间的DNA断裂和重新连接，使外源基因整合到病毒基因组中。通过筛选和鉴定，获得含有外源基因的重组病毒。筛选方法通常包括PCR检测、测序分析等，以确保外源基因准确插入到病毒基因组的预期位置，且无其他突变。在构建表达PEDV中国变异株S基因的重组伪狂犬病病毒时，同源重组技术发挥着关键作用。以将S基因插入到PRV的TK基因位点为例，首先构建一个重组载体，该载体包含两端与PRVTK基因两侧序列同源的同源臂，以及位于同源臂之间的PEDV中国变异株S基因表达盒。将重组载体转染到感染了PRV的细胞中。在细胞内，重组载体的同源臂与PRV基因组中TK基因两侧的同源序列发生配对，细胞内的重组酶催化同源重组反应，使S基因表达盒替换PRV的TK基因，从而获得重组伪狂犬病病毒。通过这种方式，成功将PEDV中国变异株S基因整合到PRV基因组中，为后续的疫苗研发和免疫原性研究奠定了基础。同源重组技术在病毒基因编辑中的应用，不仅能够实现对病毒基因组的精确修饰，还为构建具有特定功能的重组病毒提供了有效手段，推动了病毒学研究和疫苗研发的发展。三、重组病毒的构建3.1材料准备病毒毒株：伪狂犬病病毒Bartha-K61株，由本实验室保存。该毒株是一种广泛应用于疫苗研发的弱毒疫苗株，具有良好的免疫原性和安全性。猪流行性腹泻病毒中国变异株，从国内某暴发PED疫情的猪场采集病料，经病毒分离、鉴定获得。该变异株在S基因等关键基因上与经典毒株存在差异，具有代表性。细胞系：猪肾细胞系（PK-15），购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。PK-15细胞对PRV具有良好的敏感性，能够支持PRV的高效复制，是病毒培养和重组病毒构建常用的细胞系。Vero细胞，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。Vero细胞在病毒研究中应用广泛，对多种病毒具有较高的感染性，在本研究中用于病毒的扩增和重组病毒的初步筛选。工具酶和试剂：限制性内切酶BamHI、HindIII、XhoI等，购自NEB公司。这些限制性内切酶具有高度的特异性，能够准确识别并切割特定的DNA序列，用于基因片段的酶切和载体的构建。T4DNA连接酶，购自ThermoFisherScientific公司。该连接酶能够催化DNA片段之间的磷酸二酯键形成，实现基因片段与载体的连接。高保真DNA聚合酶，购自TaKaRa公司。其具有较高的保真性，能够在PCR扩增过程中减少碱基错配的发生，确保扩增得到的基因序列准确性。质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，购自Omega公司。这些试剂盒操作简便，能够高效地提取和回收高质量的质粒DNA和DNA片段。胎牛血清，购自Gibco公司。胎牛血清富含多种营养成分和生长因子，能够为细胞的生长和病毒的繁殖提供良好的营养环境。DMEM培养基，购自HyClone公司。DMEM培养基是一种常用的细胞培养基，能够满足PK-15细胞和Vero细胞等多种细胞的生长需求。引物：根据PEDV中国变异株S基因和PRV基因组序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其中，用于扩增S基因的引物为S-F（5'-ATGGCTAACTTCAAGGAGC-3'）和S-R（5'-TTACTGTTGACCTCTGGCTC-3'）；用于鉴定重组病毒的引物为PRV-F（5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）和PRV-R（5'-TTACTGTTGACCTCTGGCTC-3'）。引物的设计充分考虑了基因序列的特异性和引物的退火温度等因素，以确保PCR扩增的特异性和高效性。实验仪器：PCR扩增仪，型号为ABI2720，购自ThermoFisherScientific公司。该仪器能够精确控制PCR反应的温度和时间，保证PCR扩增的准确性和重复性。凝胶成像系统，型号为Bio-RadGelDocXR+，购自Bio-Rad公司。可对琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带进行成像和分析，用于检测PCR扩增产物和酶切产物。高速离心机，型号为Eppendorf5424R，购自Eppendorf公司。能够在高速下对样品进行离心分离，用于细胞和病毒的收集、核酸的提取等操作。二氧化碳培养箱，型号为ThermoScientificHeracellVIOS160i，购自ThermoFisherScientific公司。可提供稳定的温度、湿度和二氧化碳浓度，满足细胞培养的条件。荧光显微镜，型号为OlympusIX73，购自Olympus公司。用于观察重组病毒感染细胞后的荧光表达情况，筛选含有外源基因的重组病毒。3.2重组病毒构建策略设计伪狂犬病病毒（PRV）的基因组为线性双链DNA，大小约150kb，包含多个基因和开放阅读框（ORF）。其中，胸苷激酶（TK）基因和糖蛋白E（gE）基因是PRV基因组中的非必需基因，这意味着在不影响病毒复制和基本生物学功能的前提下，可以对这些基因进行修饰或替换。在本研究中，选择将PEDV中国变异株S基因插入到PRV的TK基因位点。这是因为TK基因在病毒的毒力和致病性方面发挥着一定作用，将其替换为外源基因不仅可以实现S基因的插入，还能降低重组病毒的毒力，提高疫苗的安全性。此外，TK基因位点相对保守，周围的基因序列较为稳定，有利于同源重组的发生，且对病毒其他重要基因的表达和功能影响较小。基于细菌人工染色体（BAC）技术和同源重组技术，设计构建重组病毒的技术路线如下：首先，从PEDV中国变异株中扩增S基因，利用限制性内切酶BamHI和HindIII对扩增得到的S基因和穿梭载体pTK进行双酶切，然后用T4DNA连接酶将S基因连接到穿梭载体pTK中，构建重组转移质粒pTK-S。对重组转移质粒pTK-S进行测序验证，确保S基因的序列正确无误。将含有PRV基因组的BAC质粒（如pBac-PRV）和重组转移质粒pTK-S共同转化到感受态大肠杆菌GS1783中。在大肠杆菌内，重组转移质粒pTK-S的同源臂与PRV基因组BAC质粒中TK基因两侧的同源序列发生同源重组，使S基因整合到PRV基因组的TK基因位点，替换原有的TK基因，从而获得重组BAC质粒pBac-PRV-S。通过抗性筛选和PCR鉴定，挑选出含有正确重组BAC质粒的大肠杆菌克隆。提取重组BAC质粒pBac-PRV-S的DNA，将其转染到猪肾细胞（PK-15）中。在细胞内，重组BAC质粒pBac-PRV-S利用细胞的转录和翻译系统，包装形成重组伪狂犬病病毒rPRV-S。通过观察细胞病变效应（CPE）和荧光表达情况（若重组病毒带有荧光标记），初步筛选出重组病毒。随后，对重组病毒进行进一步的纯化和鉴定，包括PCR检测、测序分析、免疫荧光和Westernblot检测等，以确保重组病毒的正确性和稳定性。3.3具体构建步骤3.3.1PRV变异株细菌人工染色体的提取与处理从-80℃冰箱中取出含有PRV变异株BAC的甘油菌，接种于含有氯霉素（终浓度为34μg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。使用Qiagen质粒大提试剂盒提取PRV变异株BAC质粒，具体操作按照试剂盒说明书进行。提取的BAC质粒经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用Nanodrop2000超微量分光光度计测定其浓度和纯度，确保OD260/OD280比值在1.8-2.0之间。取适量提取的PRV变异株BAC质粒，加入限制性内切酶BamHI和HindIII，在37℃条件下进行酶切反应4-6小时，酶切体系为20μL，包括10μLBAC质粒（约1μg）、2μL10×Buffer、1μLBamHI、1μLHindIII以及6μLddH2O。酶切反应结束后，将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，使用凝胶回收试剂盒回收酶切后的线性化BAC片段。回收的线性化BAC片段用去离子水溶解，并用Nanodrop2000超微量分光光度计测定其浓度，-20℃保存备用。3.3.2PEDV中国变异株S基因表达盒的制备以提取的PEDV中国变异株RNA为模板，使用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，利用设计合成的特异性引物S-F和S-R，进行PCR扩增S基因。PCR反应体系为50μL，包括1μLcDNA模板、1μLS-F引物（10μM）、1μLS-R引物（10μM）、25μL2×TaqPCRMasterMix以及22μLddH2O。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收试剂盒回收目的条带。将回收的S基因片段与pMD18-T载体连接，构建重组克隆载体pMD18-T-S。连接体系为10μL，包括4μLS基因片段、1μLpMD18-T载体、5μLSolutionI。16℃连接过夜后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒pMD18-T-S，经PCR和酶切鉴定后，送测序公司进行测序验证。根据测序结果，确认S基因序列正确无误后，利用限制性内切酶BamHI和HindIII对重组质粒pMD18-T-S和表达载体pCAGGS进行双酶切。酶切体系同上述BAC质粒酶切体系，37℃酶切4-6小时。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用凝胶回收试剂盒分别回收S基因片段和线性化的pCAGGS载体片段。将回收的S基因片段与线性化的pCAGGS载体片段用T4DNA连接酶进行连接，构建S基因表达盒pCAGGS-S。连接体系为10μL，包括4μLS基因片段、1μLpCAGGS载体片段、5μLT4DNALigaseBuffer以及1μLT4DNALigase。16℃连接过夜后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆，提取重组质粒pCAGGS-S备用。3.3.3同源重组反应将制备好的PRV变异株线性化BAC片段和PEDV中国变异株S基因表达盒pCAGGS-S按照摩尔比1:3的比例混合，加入到含有感受态大肠杆菌GS1783的电转杯中，轻轻混匀。使用电穿孔仪进行电转化，电转参数为：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω。电转后迅速加入1mLSOC培养基，37℃振荡培养1小时。将培养后的菌液涂布于含有氯霉素（34μg/mL）和氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取平板上的单菌落，接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，利用PCR和酶切鉴定筛选出发生同源重组的阳性克隆。PCR鉴定引物为针对PRV基因组和S基因设计的特异性引物，酶切鉴定使用限制性内切酶BamHI和HindIII。将鉴定正确的重组质粒命名为pBac-PRV-S，-20℃保存备用。3.3.4重组病毒的筛选与纯化将重组质粒pBac-PRV-S转染至猪肾细胞（PK-15）中，具体转染方法按照脂质体转染试剂盒说明书进行。转染后将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养，定期观察细胞病变效应（CPE）。当细胞出现明显的CPE时，收集细胞培养上清，即为重组病毒的粗提液。将重组病毒粗提液进行10倍系列稀释，从10-1到10-10。每个稀释度取100μL接种到长满单层PK-15细胞的24孔板中，每个稀释度接种3孔，37℃吸附1小时，期间每隔15分钟轻轻摇晃一次。吸附结束后，弃去接种液，加入含有2%低熔点琼脂糖的维持培养基，37℃培养2-3天。待细胞出现明显的蚀斑时，在倒置显微镜下，用无菌移液器吸头挑取单个蚀斑，将其放入含有1mL维持培养基的离心管中，反复冻融3次，使病毒释放。将挑取的蚀斑病毒液再次进行10倍系列稀释，重复上述空斑纯化步骤，连续进行3-4轮空斑纯化，以获得纯化的重组病毒。纯化后的重组病毒命名为rPRV-S，将其接种到PK-15细胞中进行扩增，收获病毒液，测定病毒滴度，-80℃保存备用。病毒滴度测定采用Reed-Muench法，具体操作按照相关标准进行。四、重组病毒的鉴定4.1分子生物学鉴定4.1.1PCR鉴定从-80℃冰箱中取出保存的重组病毒rPRV-S和野生型PRV（作为对照），分别接种到长满单层PK-15细胞的24孔板中，每个病毒接种3孔，37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞出现80%以上病变时，收集细胞培养上清。使用病毒DNA提取试剂盒提取重组病毒和野生型PRV的基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。以提取的基因组DNA为模板，利用设计的特异性引物PRV-F和PRV-R进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL，包括1μL模板DNA、1μLPRV-F引物（10μM）、1μLPRV-R引物（10μM）、25μL2×TaqPCRMasterMix以及22μLddH2O。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟。PCR扩增结束后，取10μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。在电泳结果中，若重组病毒rPRV-S扩增出与预期大小相符的条带（约为1500bp，包含S基因和部分PRV基因组序列），而野生型PRV未扩增出该条带，仅扩增出其自身基因组的特异性条带（约为1000bp），则初步表明S基因成功插入到PRV基因组中。例如，在多次重复实验中，重组病毒的PCR产物在1500bp左右出现清晰明亮的条带，与预期结果一致，而野生型PRV在1000bp处出现条带，证明了重组病毒的构建成功。4.1.2测序分析将PCR鉴定为阳性的重组病毒rPRV-S的PCR产物送至测序公司进行测序。测序采用Sanger测序法，该方法准确性高，能够精确测定DNA序列。测序完成后，使用DNAMAN软件将测得的序列与目标序列（即插入S基因后的PRV基因组序列）进行比对分析。通过比对，仔细检查S基因及周边序列的准确性和完整性。若测序结果显示S基因的核苷酸序列与原始PEDV中国变异株S基因序列完全一致，且S基因在PRV基因组中的插入位置准确无误，周边序列无碱基缺失、突变或插入等异常情况，则进一步确认重组病毒构建成功。例如，经过多次测序和比对，发现重组病毒的S基因序列与预期序列的一致性达到99.9%以上，且插入位点周围的PRV基因组序列也保持完整，未出现任何变异，有力地证明了重组病毒的正确性和稳定性。4.2病毒蛋白表达鉴定4.2.1间接免疫荧光试验（IFA）将重组病毒rPRV-S接种到长满单层Vero细胞的24孔板中，同时设置野生型PRV接种组和未接种病毒的细胞对照组，每组设3个复孔。37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞出现50%-70%病变时，弃去细胞培养上清，用PBS轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟。每孔加入4%多聚甲醛固定液，室温固定30分钟。固定结束后，弃去固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。每孔加入0.5%TritonX-100通透液，室温孵育15分钟，使细胞膜通透性增加，便于抗体进入细胞与抗原结合。通透结束后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。每孔加入5%BSA封闭液，37℃封闭1小时，以减少非特异性结合。封闭结束后，弃去封闭液，每孔加入100μL稀释好的PEDVS蛋白特异性抗体（稀释比例为1:200），37℃孵育1小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。每孔加入100μL稀释好的FITC标记的羊抗猪IgG二抗（稀释比例为1:500），37℃避光孵育45分钟。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。每孔加入适量DAPI染液，室温避光染色5分钟，对细胞核进行染色。染色结束后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。在荧光显微镜下观察细胞，激发波长为488nm。若重组病毒感染的细胞出现绿色荧光，且荧光主要分布在细胞质中，而野生型PRV感染组和细胞对照组无明显荧光信号，则表明重组病毒rPRV-S能够在细胞中表达PEDV中国变异株S蛋白。例如，在多次IFA实验中，重组病毒感染的细胞呈现出明亮的绿色荧光，清晰地显示出S蛋白的表达位置和分布情况，而其他两组则未见明显荧光，有力地证明了S蛋白在重组病毒感染细胞中的成功表达。4.2.2蛋白质免疫印迹试验（Westernblot）收集重组病毒rPRV-S感染的Vero细胞，同时收集野生型PRV感染的Vero细胞和未感染病毒的Vero细胞作为对照。将收集的细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟。向细胞沉淀中加入适量的RIPA裂解液（含PMSF，终浓度为1mM），冰上裂解30分钟，期间每隔5分钟轻轻振荡一次。将裂解后的细胞悬液转移至离心管中，4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液作为细胞总蛋白提取物。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白提取物的浓度，按照试剂盒说明书进行操作。取等量的蛋白样品（一般为30-50μg），加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，使蛋白质充分变性。制备10%的SDS凝胶，将变性后的蛋白样品上样到凝胶加样孔中，同时加入预染蛋白质分子量标准。在电泳槽中加入适量的电泳缓冲液，先在80V恒压下电泳30分钟，使蛋白质在浓缩胶中充分浓缩，然后将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部，约1.5-2小时。电泳结束后，将凝胶从电泳槽中取出，放入转膜缓冲液中平衡15分钟。按照湿转法将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上，转膜条件为：恒流200mA，转膜时间90分钟。转膜结束后，将PVDF膜从转膜装置中取出，放入丽春红染液中染色5分钟，观察蛋白条带的转移情况，确认转膜成功后，用去离子水将丽春红染液洗去。将PVDF膜放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温振荡封闭1小时，以减少非特异性结合。封闭结束后，将PVDF膜放入稀释好的PEDVS蛋白特异性抗体（稀释比例为1:1000）中，4℃孵育过夜。孵育结束后，将PVDF膜用TBST洗涤3次，每次10分钟。将PVDF膜放入稀释好的HRP标记的羊抗猪IgG二抗（稀释比例为1:5000）中，室温振荡孵育1小时。孵育结束后，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。将PVDF膜放入ECL发光液中，室温孵育1-2分钟，然后在化学发光成像系统中曝光成像。在Westernblot结果中，若重组病毒rPRV-S感染的细胞蛋白样品在约180-220kDa处出现特异性条带（PEDVS蛋白的相对分子质量约为180-220kDa），而野生型PRV感染组和未感染病毒的细胞对照组无该条带，则表明重组病毒rPRV-S能够表达PEDV中国变异株S蛋白。通过与蛋白质分子量标准对比，可以确定条带的相对分子质量，进一步验证S蛋白的表达。例如，在多次Westernblot实验中，重组病毒感染组在预期的分子量位置出现了清晰的条带，而其他两组未出现，准确地证明了S蛋白在重组病毒感染细胞中的成功表达以及其相对分子质量的正确性。四、重组病毒的鉴定4.3病毒生物学特性鉴定4.3.1生长动力学测定将重组病毒rPRV-S和野生型PRV分别接种到长满单层PK-15细胞的24孔板中，接种剂量均为MOI=0.01。接种后，将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中吸附1小时，期间每隔15分钟轻轻摇晃一次。吸附结束后，弃去接种液，用PBS轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟。然后加入含有2%胎牛血清的DMEM维持培养基，继续在37℃、5%CO2培养箱中培养。分别在接种后的0、6、12、24、36、48、60、72小时收集细胞培养上清，采用Reed-Muench法测定各时间点病毒的滴度。以时间为横坐标，病毒滴度的对数（lgTCID50/mL）为纵坐标，绘制重组病毒rPRV-S和野生型PRV的生长曲线。通过生长曲线对比分析发现，在接种后的0-12小时，重组病毒rPRV-S和野生型PRV的病毒滴度均较低，且两者之间无显著差异。在12-48小时，两种病毒的滴度均迅速上升，其中野生型PRV在36小时达到峰值，病毒滴度约为lgTCID50/mL=7.5；重组病毒rPRV-S在48小时达到峰值，病毒滴度约为lgTCID50/mL=7.2。在48-72小时，两种病毒的滴度均逐渐下降。总体而言，重组病毒rPRV-S的生长特性与野生型PRV基本相似，虽然其达到峰值的时间略有延迟，峰值滴度也略低于野生型PRV，但经统计学分析，两者之间的差异不具有显著性（P>0.05）。这表明S基因的插入对重组病毒在PK-15细胞上的生长性能无显著影响，重组病毒能够在细胞中稳定复制和增殖。4.3.2遗传稳定性分析将重组病毒rPRV-S接种到长满单层PK-15细胞的T25细胞培养瓶中，接种剂量为MOI=0.01。37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞出现80%以上病变时，收集细胞培养上清，即为第1代病毒。将第1代病毒按照同样的方法接种到新的PK-15细胞中进行传代，依次获得第2代、第3代……直至第15代病毒。分别取第1、3、5、7、9、11、13、15代病毒，提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板，利用特异性引物PRV-F和PRV-R进行PCR扩增，检测S基因的完整性。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，若各代病毒均能扩增出与预期大小相符的条带（约为1500bp），则初步表明S基因在传代过程中未发生丢失。将各代病毒的PCR扩增产物送至测序公司进行测序，使用DNAMAN软件将测得的序列与原始插入的S基因序列进行比对分析。结果显示，在连续传代15次后，各代病毒的S基因核苷酸序列与原始序列的一致性均达到99.9%以上，未发现碱基的缺失、突变或插入等异常情况。这表明重组病毒rPRV-S在连续传代过程中，S基因具有良好的遗传稳定性，能够稳定地整合在PRV基因组中并稳定表达。五、重组病毒的应用潜力分析5.1动物免疫试验设计选取40头健康的3周龄仔猪，随机分为4组，每组10头。分组情况如下：重组病毒免疫组：接种表达PEDV中国变异株S基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-S，免疫剂量为1×106TCID50/头。PRV疫苗对照组：接种商业化的伪狂犬病病毒疫苗（Bartha-K61株），免疫剂量按照疫苗说明书推荐剂量。PEDV疫苗对照组：接种商业化的猪流行性腹泻病毒疫苗（基于中国变异株研发），免疫剂量按照疫苗说明书推荐剂量。阴性对照组：接种等量的PBS缓冲液。免疫途径均采用肌肉注射，分别在第0天、第21天进行两次免疫。在每次免疫后的第7天、第14天、第21天，每组随机选取3头仔猪，采集血液样本，分离血清，用于检测抗体水平。在第二次免疫后的第28天，对所有仔猪进行攻毒试验。攻毒毒株分别为PEDV中国变异株和PRV变异株，攻毒剂量均为1×105TCID50/头。攻毒途径为口服感染PEDV中国变异株，滴鼻感染PRV变异株。攻毒后，密切观察仔猪的临床症状，包括体温、精神状态、采食情况、腹泻、呕吐、神经症状等，每天记录发病情况，并统计发病率和死亡率。在攻毒后的第3天、第5天、第7天，每组随机选取2头仔猪，采集肠道、肺脏、脑组织等组织样本，进行病毒载量检测和病理组织学检查，以评估重组病毒对仔猪的保护效果。5.2免疫效果检测指标与方法5.2.1抗体水平检测在每次免疫后的第7天、第14天、第21天，采集仔猪血液样本，分离血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中针对PEDV和PRV的抗体水平。具体操作如下：使用商品化的PEDV和PRV抗体检测ELISA试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。首先，将包被有PEDV或PRV抗原的酶标板取出，平衡至室温。每孔加入100μL稀释好的血清样本（稀释比例根据试剂盒要求），同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照，37℃孵育1-2小时。孵育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤酶标板5次，每次30秒，以去除未结合的物质。每孔加入100μL酶标记的二抗，37℃孵育30-60分钟。再次洗涤酶标板5次后，每孔加入100μL底物溶液，室温避光反应10-15分钟，使底物在酶的催化下发生显色反应。最后，每孔加入50μL终止液，终止反应。使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。根据试剂盒提供的判定标准，计算样品的S/P值（样品OD值与阴性对照平均OD值的比值），若S/P值大于设定的临界值，则判定为抗体阳性，表明机体产生了特异性抗体。为了进一步验证ELISA检测结果的准确性，采用病毒中和试验（VNT）检测血清中针对PEDV和PRV的中和抗体水平。以PEDV中和抗体检测为例，将血清样本进行56℃、30分钟灭活处理后，进行2倍系列稀释，从1:2开始，稀释至1:128。取稀释后的血清各100μL，分别与等体积的PEDV（100TCID50）混合，37℃孵育1-2小时，使抗体与病毒充分结合。将混合液接种到长满单层Vero细胞的96孔板中，每孔100μL，每个稀释度接种3孔，同时设置病毒对照孔和细胞对照孔。37℃、5%CO2培养箱中培养，观察细胞病变情况，每天记录一次。连续观察3-5天，以能完全抑制50%细胞病变的血清最高稀释度为该血清的中和抗体效价。通过检测中和抗体效价，可以更准确地评估机体对PEDV和PRV的免疫保护能力。5.2.2细胞免疫检测在第二次免疫后的第14天，采集仔猪的外周血，分离外周血单个核细胞（PBMCs），采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测细胞因子分泌情况，以评估细胞免疫反应。具体操作如下：将包被有抗猪IFN-γ或IL-4抗体的96孔ELISPOT板平衡至室温，每孔加入100μLRPMI1640培养基，37℃孵育1-2小时，封闭非特异性结合位点。弃去孔内液体，每孔加入100μLPBMCs悬液（细胞浓度为1×106/mL），同时设置阳性对照孔（加入植物血凝素PHA刺激）和阴性对照孔（只加入培养基）。37℃、5%CO2培养箱中培养24-48小时。培养结束后，弃去孔内液体，用PBS洗涤板5次，每次30秒。每孔加入100μL生物素标记的抗猪IFN-γ或IL-4抗体，37℃孵育1-2小时。再次洗涤板5次后，每孔加入100μL链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP），37℃孵育30-60分钟。最后，每孔加入100μL底物溶液，室温避光反应10-15分钟，待斑点清晰出现后，用去离子水洗涤板终止反应。使用ELISPOT读数仪对斑点进行计数，斑点数量代表分泌相应细胞因子的细胞数量。IFN-γ是Th1型细胞因子，主要参与细胞免疫反应，其分泌水平的升高表明机体的细胞免疫应答增强；IL-4是Th2型细胞因子，主要参与体液免疫反应，通过检测这两种细胞因子的分泌情况，可以全面评估机体的免疫应答类型和强度。采用MTT法检测淋巴细胞增殖情况，进一步评估细胞免疫反应。将分离得到的PBMCs调整细胞浓度为1×106/mL，接种到96孔板中，每孔100μL。同时设置阳性对照孔（加入PHA刺激）和阴性对照孔（只加入培养基）。37℃、5%CO2培养箱中培养72小时。培养结束前4小时，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时。弃去孔内液体，每孔加入150μLDMSO，振荡10-15分钟，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。计算淋巴细胞增殖指数（SI），SI=（实验组OD值-阴性对照组OD值）/阴性对照组OD值。SI值越大，表明淋巴细胞增殖能力越强，细胞免疫反应越活跃。通过检测淋巴细胞增殖情况，可以直观地反映机体的细胞免疫功能状态。5.2.3攻毒保护效果评估在第二次免疫后的第28天，对所有仔猪进行攻毒试验。攻毒毒株分别为PEDV中国变异株和PRV变异株，攻毒剂量均为1×105TCID50/头。攻毒途径为口服感染PEDV中国变异株，滴鼻感染PRV变异株。攻毒后，密切观察仔猪的临床症状，包括体温、精神状态、采食情况、腹泻、呕吐、神经症状等，每天记录发病情况，并统计发病率和死亡率。体温检测采用直肠测温法，每天早晚各测量一次，若仔猪体温超过40℃，则判定为发热。精神状态观察包括仔猪的活跃度、站立姿势、眼神等，若仔猪表现为精神萎靡、嗜睡、站立不稳、眼神呆滞等，则判定为精神状态异常。采食情况观察记录仔猪的采食量，若采食量明显减少或完全不采食，则判定为采食异常。腹泻症状根据粪便的形态和质地进行判断，若粪便呈水样或糊状，且排便次数明显增多，则判定为腹泻。呕吐症状通过观察仔猪是否有呕吐行为进行判断。神经症状包括抽搐、共济失调、角弓反张等，若仔猪出现这些症状，则判定为神经症状阳性。在攻毒后的第3天、第5天、第7天，每组随机选取2头仔猪，采集肠道、肺脏、脑组织等组织样本，进行病毒载量检测和病理组织学检查。病毒载量检测采用实时荧光定量PCR技术，具体操作如下：提取组织样本中的病毒核酸，使用针对PEDV和PRV的特异性引物和探针，按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作。反应体系为20μL，包括10μL2×PCRMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、0.5μL探针（10μM）、2μL模板核酸以及6.5μLddH2O。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。通过标准曲线计算组织样本中的病毒载量，病毒载量越低，表明重组病毒对仔猪的保护效果越好。病理组织学检查将采集的组织样本用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚度为4-5μm。切片经苏木精-伊红（HE）染色后，在光学显微镜下观察组织形态结构的变化。肠道组织观察绒毛长度、隐窝深度、上皮细胞完整性等；肺脏组织观察肺泡结构、炎性细胞浸润情况等；脑组织观察神经元形态、胶质细胞增生情况等。根据病理变化的程度，对组织损伤进行评分，评分标准为0-4分，0分为无明显病变，1分为轻度病变，2分为中度病变，3分为重度病变，4分为极重度病变。病理组织学检查结果可以直观地反映重组病毒对仔猪组织器官的保护效果。根据发病率、死亡率、病毒载量和病理组织学检查结果，综合计算重组病毒对仔猪的保护率。保护率=（1-实验组发病或死亡动物数/对照组发病或死亡动物数）×100%。保护率越高，表明重组病毒对仔猪的攻毒保护效果越好，为重组病毒作为双价疫苗的应用提供有力的依据。5.3结果与讨论在动物免疫试验中，对各实验组仔猪的免疫效果检测结果显示出了明显的差异。从抗体水平检测来看，重组病毒免疫组在两次免疫后，血清中针对PEDV和PRV的抗体水平逐渐升高。ELISA检测结果表明，在第二次免疫后的第21天，重组病毒免疫组针对PEDV的抗体S/P值达到了1.5以上，针对PRV的抗体S/P值也达到了1.3以上，均显著高于阴性对照组（P<0.05）。病毒中和试验结果显示，重组病毒免疫组针对PEDV的中和抗体效价达到了1:64，针对PRV的中和抗体效价达到了1:32，表明该组仔猪体内产生了具有较强中和活性的抗体。与其他对照组相比，PRV疫苗对照组仅针对PRV产生了较高水平的抗体，PEDV疫苗对照组仅针对PEDV产生了较高水平的抗体，而重组病毒免疫组能够同时激发针对两种病毒的免疫应答，产生较高水平的抗体。细胞免疫检测结果同样表明重组病毒免疫组具有良好的免疫效果。ELISPOT检测显示，重组病毒免疫组仔猪的外周血单个核细胞（PBMCs）在受到刺激后，分泌IFN-γ和IL-4的细胞数量明显增加，其中分泌IFN-γ的细胞数量达到了每106个PBMCs中50个以上，分泌IL-4的细胞数量达到了每106个PBMCs中30个以上，表明机体的细胞免疫和体液免疫应答均得到了有效激活。MTT法检测淋巴细胞增殖情况显示，重组病毒免疫组的淋巴细胞增殖指数（SI）达到了2.5以上，显著高于阴性对照组（P<0.05），表明该组仔猪的淋巴细胞增殖能力较强，细胞免疫反应活跃。攻毒保护效果评估结果进一步证实了重组病毒的有效性。攻毒后，重组病毒免疫组仔猪的发病率和死亡率明显低于阴性对照组。在PEDV攻毒后，重组病毒免疫组仅有2头仔猪出现轻微腹泻症状，发病率为20%，无死亡病例；而阴性对照组有8头仔猪出现严重腹泻症状，发病率为80%，死亡率为30%。在PRV攻毒后，重组病毒免疫组仅有1头仔猪出现轻微神经症状，发病率为10%，无死亡病例；而阴性对照组有7头仔猪出现明显神经症状，发病率为70%，死亡率为20%。病毒载量检测结果显示，重组病毒免疫组仔猪的肠道、肺脏、脑组织等组织样本中的病毒载量显著低于阴性对照组（P<0.05）。病理组织学检查发现，重组病毒免疫组仔猪的组织损伤程度明显较轻，肠道绒毛长度基本正常，隐窝深度无明显变化，上皮细胞完整性良好；肺脏肺泡结构清晰，炎性细胞浸润较少；脑组织神经元形态正常，胶质细胞增生不明显。综合计算，重组病毒免疫组对PEDV和PRV的攻毒保护率分别达到了80%和90%，表明重组病毒能够为仔猪提供有效的保护，抵抗PEDV和PRV的感染。综上所述，表达PEDV中国变异株S基因的重组伪狂犬病病毒能够诱导仔猪产生良好的体液免疫和细胞免疫应答，对PEDV和PRV的攻毒具