高三生物二轮复习课件专题十三基因工程

基因工程、PCR技术及蛋白质工程专题13大二轮专题复习目录重点一基因工程PCR技术及蛋白质工程【情境任务】【知识盘点】【考题解密】重点二基因工程现代生物科技专题平末端“分子手术刀”限制酶“分子缝合针”DNA连接酶T4DNA连接酶基本工具可产生“分子运输车”载体应用蛋白质工程主要有常用黏性末端E.coliDNA连接酶质粒知识网络现代生物科技专题基因工程基本操作程序目的基因的筛选与获取PCR基因表达载体的构建用限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段DNA连接酶连接形成重组DNA分子将目的基因导入受体细胞植物细胞：动物细胞：微生物细胞：Ca2+转化法目的基因的检测与鉴定分子水平：检测DNA、mRNA、蛋白质个体生物学水平常用的扩增方法步骤常用方法包括花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射法知识网络

重点一基因工程情境一：【任务1】总结基因工程的基本工具的种类及作用特点GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。(1)基因编辑过程可能需要的工具酶是________________________________。限制性核酸内切酶、DNA连接酶情境任务知识盘点考题解密情境任务知识盘点考题解密1.基因工程的基本工具限制性内切核酸酶(限制酶)作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。方法：一般用相同限制酶切割载体和目的基因DNA连接酶E.coliDNA连接酶:T4DNA连接酶:只连接黏性末端缝合黏性末端和平末端（效率较低）载体种类：特点：质粒(常用载体)动植物病毒噬菌体①稳定存在并能自我复制，或整合到受体DNA上同步复制②有一个至多个限制酶切割位点③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选(2)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指？将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因情境二：GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。情境任务知识盘点考题解密(3)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为_______；②为________，其作用是______________________________________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是：_____________________________________________。终止子启动子

提供RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动GFP突变基因转录出mRNA将含有表达载体的细胞筛选出来情境二：情境任务知识盘点考题解密(4)目的基因的表达,科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光,请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是___________________________________________________________________________________________________。 GFP基因虽然发生了突变，但由于存在密码的简并现象(密码子的简并性),突变基因所编码的氨基酸序列并未改变(5)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是________________________________________________________________________________________________________。

将YFP基因插入表达载体，再将构建成功的重组表达载体导入不能发黄色荧光的真核细胞中，观察黄色荧光是否出现情境二：【任务2】总结归纳基因工程的四个操作步骤并讲解详细过程情境任务知识盘点考题解密(1)目的基因的筛选与获取2.基因工程的四个操作步骤①通过构建基因文库来获取目的基因前提：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成③利用PCR特异性地快速扩增目的基因②人工合成目的基因方法：情境任务知识盘点考题解密(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心RNA聚合酶识别和结合的部位(基因的上游)；驱动基因转录出mRNA转录的终点，在转录过程中起调控作用鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来标记基因启动子目的基因终止子限制酶切割位点编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子复制原点是载体DNA复制的起始点,若复制原点被破坏,则载体将不能复制复制原点情境任务知识盘点考题解密(3)将目的基因导入受体细胞只有该步骤没涉及碱基互补配对原则生物种类植物动物微生物常用方法

处理法(感受态细胞法)受体细胞转化过程农杆菌转化法花粉管通道法体细胞或受精卵受精卵Ca2＋将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入显微注射法原核细胞情境任务知识盘点考题解密受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等(4)目的基因的检测与鉴定分子水平的检测个体水平情境任务知识盘点考题解密1.(2023·广东卷，11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(

)A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色D情境任务知识盘点考题解密【解析】裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。情境任务知识盘点考题解密2.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(

)A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接C情境任务知识盘点考题解密【解析】酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。情境任务知识盘点考题解密3.(2023·巴蜀中学适应考)科学家从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，进行克隆，复制了2400年前的DNA。兴趣小组同学模拟了其中部分研究过程，设计了如下实验(Msp

Ⅰ

、BamHⅠ

、Mbo

Ⅰ

、Sma

Ⅰ

为4种限制性内切核酸酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG，如图所示)。请回答以下问题：情境任务知识盘点考题解密(1)从解旋过程进行分析，PCR扩增木乃伊基因与体内DNA复制过程不相同的地方是_____________________________________________________________________________________________________________________(答出两点)。(2)若将图乙中质粒和图甲中木乃伊基因通过同种限制酶处理后，构建重组质粒，应选用的限制酶是_________，选择理由是__________________________________________________________________________________________________。

PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋BamHⅠ

用BamHⅠ来切割目的基因和质粒，切割后能保留完整的目的基因和标记基因(合理即可)(3)经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能正确表达，最可能的原因是__________________________________________________________。(4)据图丙分析，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A、B还应分别含有____________________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________菌落中的细菌。同种限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因与质粒反向连接青霉素、四环素4和6情境任务知识盘点考题解密【解析】

(1)PCR扩增是完全解旋后进行复制，在高温条件下解旋，不需要解旋酶，而体内DNA复制是边解旋边复制，需要解旋酶解旋。(2)能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为G↓GATCC的BamHⅠ

和识别序列为↓GATC的MboⅠ，若使用Mbo

Ⅰ

会同时破坏质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因，所以要用BamHⅠ

来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的青霉素抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)因为目的基因和载体是用同种限制酶切割的，同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接，导致目的基因不能正确表达。(4)用限制酶BamHⅠ

对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素的培养基上生存。所以图丙培养基A和培养基B还应分别含有青霉素、四环素。从检测筛选的结果分析，培养基A中含有菌落4和6，培养基B中不含菌落4和6，故含目的基因的是4和6菌落中的细菌。情境任务知识盘点考题解密4.如图1中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点，图2为某种基因表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。请回答下列问题：情境任务知识盘点考题解密(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_________酶切后的产物连接，理由是_________________________________________________。Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端【解析】经BamHⅠ酶切后得到的黏性末端是GATC－，与Sau3AⅠ酶切后获得的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。情境任务知识盘点考题解密(2)图2中启动子的作用是_____________________________，终止子的作用是________________，抗生素抗性基因的作用是__________________________。RNA聚合酶识别和结合的部位使转录过程停止【解析】启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，与RNA聚合酶结合后，开始进行转录过程；终止子使转录过程停止；抗生素抗性基因表达后，生物具有抗生素抗性，便于重组DNA分子的筛选。便于重组DNA分子的筛选情境任务知识盘点考题解密(3)构建基因表达载体时，还需要用到DNA连接酶。常见的DNA连接酶有_______DNA连接酶和_____DNA连接酶，其中能连接平末端的是______DNA连接酶。E.coliT4T4情境任务知识盘点考题解密(4)若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子(如图3所示)。这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，原因是____________________________________________________________________________________________________________。

甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录甲和丙情境任务知识盘点考题解密5.（2024·全国乙卷·38，15分）PCR技术常用于DNA的扩增与检测。回答下列问题：(1)PCR反应体系中，除模板DNA、引物、dNTP外，还需加入______酶；该酶的特点是______。(2)PCR循环包括变性、复性、延伸三个阶段，其中变性阶段的作用是______；复性阶段引物与模板DNA结合遵循______原则。(3)琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是：DNA分子带______电，在电场中向______极移动；DNA片段越短，迁移速率越______。(4)若用标记的目的基因单链作探针，通过______技术可检测受体细胞中是否导入目的基因。情境任务知识盘点考题解密【答案】(1)TaqDNA聚合酶；耐高温（热稳定性高）。(2)使模板DNA双链解旋为单链；碱基互补配对。(3)负；正；快。(4)DNA分子杂交。情境任务知识盘点考题解密【解析】（1）PCR需要耐高温的DNA聚合酶，Taq酶是从嗜热菌中提取的，能在高温下保持活性。(2)变性阶段通过高温使DNA双链解开；复性阶段引物与模板链的碱基遵循A-T、G-C的配对原则结合。(3)DNA分子磷酸基团带负电，在电场中向正极移动；短片段分子量小，迁移速率更快。(4)探针与受体细胞中的目的基因单链发生碱基互补配对，通过检测杂交信号判断是否导入。情境任务知识盘点考题解密

重点二PCR技术及蛋白质工程情境一：情境任务知识盘点考题解密干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。1993年，我国批准生产重组人干扰素α—1b，它是我国批准生产的第一个基因工程药物，目前主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎。请回答下列问题：(1)干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子中的第十七位氨基酸由半胱氨酸变为丝氨酸，则在—70℃的条件下，干扰素可以保存半年。请你据此事实，阐述利用蛋白质工程技术获得上述耐保存的干扰素的基本思路：写出干扰素的氨基酸序列，替换半胱氨酸为丝氨酸，改变相对应的脱氧核苷酸序列（或合成新基因），再进行基因工程生产所需要的干扰素【任务1】总结蛋白质工程的操作手段、结果及设计流程分别是什么？1.蛋白质工程(2)结果：改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质(1)操作手段：基因改造或合成基因(3)步骤：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。情境任务知识盘点考题解密(2)干扰素新基因可以利用PCR扩增，在PCR缓冲液中要添加适量的Mg2+，其目的是___________________________________。PCR结束后可采用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行鉴定，一定pH下，在电场中，DNA分子会向着___________________________的电极移动，DNA分子在凝胶中的迁移速率与_________________________________（填两种）等因素有关。情境二：激活（耐高温的）DNA聚合酶与它所带电荷相反凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象【任务2】总结PCR技术的原理、条件、过程分别是什么？总结DNA片段电泳鉴定的原理、鉴定方法及注意事项分别是什么？【任务3】总结DNA粗提取与鉴定的原理、鉴定方法、步骤分别是什么？【任务4】情境任务知识盘点考题解密(2)原理：_________________。复制特定DNA片段

DNA半保留复制

2.利用PCR获取和扩增目的基因(1)含义：是一项在生物体外_____________________的核酸合成技术。(3)条件：DNA模板：引物(2种):四种脱氧核苷酸：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸(dNTP)提供DNA复制的模板合成子链DNA的原料TaqDNA聚合酶:缓冲溶液:一般添加Mg2+,激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶(催化形成磷酸二酯键)情境任务知识盘点考题解密(8)产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。(4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物(5)扩增方向：DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸(6)引物：是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸(7)目的：短时间内大量扩增目的基因2.利用PCR获取和扩增目的基因情境任务知识盘点考题解密(9)PCR技术的过程变性复性延伸90℃以上，双链DNA解聚为单链50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。情境任务知识盘点考题解密3.DNA片段的电泳鉴定原理：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关鉴定：凝胶中DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来注意：要避免外源DNA等因素的污染情境任务知识盘点考题解密4.DNA的粗提取与鉴定在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。②DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,能溶于2mol/LNaCl溶液原理：DNA性质：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分鉴定：步骤：研磨→过滤(取上清液)→加入体积相等的、预冷的酒精(体积分数为95%），静置2~3min→搅拌(或离心)→取白色丝状物(或沉淀物）→溶解→鉴定DNA情境任务知识盘点考题解密1.(2023·南京六校联考)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是(

)DA.两轮PCR过程中复性时的温度一样B.单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR的产物——DNA的两条链D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程情境任务知识盘点考题解密【解析】单核苷酸的定点诱变需进行两轮PCR反应，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，为了使引物与模板链准确配对，第二轮PCR的复性温度应比第一轮的高，A错误；单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；由图可知，第二轮PCR需加入另一种侧翼引物，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。情境任务知识盘点考题解密2.(2023·广东，11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（）A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色D情境任务知识盘点考题解密【解析】裂解是使细胞破裂释放出DNA等物质，针对不同的实验材料，可选择不同的方法破坏细胞，如植物细胞可选择研磨的方法，而动物细胞可选择吸水涨破的方法，A正确；将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D错误。情境任务知识盘点考题解密3.(2023·珠海高三期末)反转录PCR又称逆转录PCR(RT－PCR)，是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是（）A.图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物B.RT－PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列C.过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸D.RT－PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的

检测C情境任务知识盘点考题解密【解析】过程③中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即子链沿着模板链的3′→5′方向延伸，C错误。情境任务知识盘点考题解密4.染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白，对得到的DNA片段进行凝胶电泳，结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉后用同样的非特