第19讲-微生物酶的发酵生产

1TheproductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism第20讲微生物酶的发酵生产教学目的与要求◆了解酶在不同行业的广泛应用；◆熟悉产酶微生物的种类；◆掌握酶的发酵生产工艺。主要内容1、酶的广泛应用；2、常见产酶微生物；3、产酶微生物的分离筛选；4、酶的类型；5、酶的生产工艺。绿色健康，“酶”力无限医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域

1、酶的广泛应用制造各种药物疾病的治疗疾病的诊断酶在医药方面的应用治疗消化不良、食欲不振的多酶片等利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素。葡萄糖糖化酶用于快速测定血糖和尿糖，脲酶用于测定尿素，以及胆碱酯酶用于测定血液中食物中的胆固醇等。1.1酶在医药方面的应用溶菌酶1.2酶在食品方面的应用在食品加工过程中,如何保持食物的色香味和结构是很重要的问题。酶促反应由于反应条件温和,专一性强,本身无色无味,因而最适宜于食品加工。

酶在食品加工中最大的用途是淀粉加工,乳品加工,果汁加工,烘烤食品以及啤酒发酵等，并且与之有关的各种酶如淀粉酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、凝乳酶、蛋白酶等占酶制剂市场的一半以上。

酶在轻化工业中的用途主要包括：洗涤剂制造（增强去垢能力）、

毛皮工业、

明胶制造、

胶原纤维制造（粘接剂）、

化妆品的生产、

造纸、

感光材料生产、

废水废物处理、饲料加工等。1.3酶在轻工业方面的应用1）、补充畜禽内源酶的不足，增加可消化性；2）、解除饲料中抗营养因子；3）、良好安全性和减少环境污染；1.4酶在饲料中的应用酶在饲料中的应用

酶制剂在国外饲料工业中得到不断应用，不仅提高了饲料原料的转化率，也促进了对饲料的消化。植酸酶（Phytase）

主要用于提高植酸磷的消化率，并相应改善钙和其它矿物元素的利用率。大大降低了动物粪便中磷的排放量，有益环保。1.5酶在环境保护中的三个应用1）、环境监测2）、废水处理过氧化物酶多酚氧化酶3）、可降解材料开发其一是用于环境监测。根据生物传感的原理将固定化酶涂布在电极上做成生物修饰电极,用于监测环境中的一些微量化学物质如苯比咯,氯代芳烃,氟代芳烃,硝酸盐,磷酸盐以及甲醇等。具有方便、快速灵敏等特点。酶在环境保护方面的三个应用

其三是降解材料。

如制革工业中的原料脱毛历来都是用石灰硫化钠法,工序繁重,周期长,污染严重,而且灰碱脱毛后还须蛋白酶软化。但若用蛋白酶脱毛可以改善劳动条件,缩短周期,并使脱毛与软化工序合二为一,最可取的是可以使污水危害大大减轻。

其二是对工业及生活废物,废水进行处理。农业废物如稻草、麦杆以及废纸等纤维素物质可用纤维素酶水解,制成葡萄糖,后者经发酵后可制取多种有用物质。

常用的酶制剂-1常用的酶制剂-2172.常见产酶微生物

CommonmicroorganisminEnzymeProduction2.1基本要求：不是致病菌、安全性可靠；发酵周期短,产酶量高；最好是产生胞外酶的菌种,利于分离；容易培养和管理；产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染；有利于酶的分离和纯化。2.2种类

1）、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)2）、大肠杆菌(Escherichiacoli)3）、黑曲霉(Aspergillusniger)4）、米曲霉(Aspergillusoryzae)5）、青霉(Penicillium)6）、木霉(Trichoderma)7）、根霉(Rhizopus)8）、毛霉(Mucor)9）、链霉菌(Streptomyces)10）、啤酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)11）、假丝酵母(Candida)19(1)大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。形态：短杆或长杆状,革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。应用：工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等20(2)醋酸杆菌（Acetobacter）

菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆)山梨糖(维C中间体）

21(3)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）

直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。22(4)根霉(Rhizopus)

分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。根霉因有假根而得名。分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。代表种：米根霉、黑根霉等。应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。23(5)曲霉(Aspergillus)

分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。代表种：黑曲霉、黄曲霉应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。24(6)酵母啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)

啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁培养基上，菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。

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3.产酶微生物的分离和筛选

1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品；

2)富集培养:投其所好，取其所抗；

3)分离获得微生物的纯培养（pureculture）；

4)初筛：选出产酶菌种，以多为主；

5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。

26蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基274.微生物酶的类型1）、胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。2）、胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。285、酶的发酵生产5.1、一般工艺流程

291）、选择适宜的营养物质2）、营养物的浓度及配比合适3）、物理、化学条件适宜4）、经济节约5）、精心设计、试验比较5.2.1培养基的设计原则5.2酶的发酵工艺条件与控制

305.2发酵条件及控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。通常培养条件：细菌与放线菌：pH7-7.5酵母菌和霉菌：pH4.5-6范围内生长1）、pH值的控制31pH值的控制细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。

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通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。2）、温度的控制有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃黑曲霉的最适生长温度为28～32℃333）、溶解氧的控制在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。调节通气量调节氧的分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质控制溶解氧方法345.3提高酶产量的措施

A添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物一般可以分为3类

酶的作用底物酶的催化反应产物作用底物的类似物1)通过条件控制提高酶产量35B、添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。

将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、

(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。

由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。36C、添加产酶促进剂

产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。

372)、通过基因突变提高酶产量突变：是指生物的遗传性状发生变异，以致影响了生物的正常遗传，可遗传的基因突变发生在结构基因上，往往导致酶的结构和性质发生改变：基因突变引起酶产量提高的方式：

1.诱导型组成型

2.阻遏型去阻遏型38

基因突变可以自发地发生，但自发突变发生的频率低人工突变的方法：a.物理方法包括紫外线、X射线、激光、γ射线及快中子辐射b.化学方法化学诱变剂的种类很多，但有高诱变作用的不多如5‘-溴尿嘧啶、亚硝酸胍c.生物学方法：转座子为诱变因子，其是一种DNA片段，编码与转座有关的蛋白质，能在基因组的许多位点上插入，导致高极性的突变。

393）通过体内基因重组提高酶的产量体内基因重组包括少数获者个别基因的重组，主要通过接合、转导、转化等方法进行；也包括整个染色体的重组，

主要的途径是原生质体融合4041原生质体融合424）体外基因重组提高酶产量体外基因重组，简称DNA重组技术或基因工程基因工程在酶生产中的作用

1、提高微生物中原酶的产量

2、用微生物表达、生产动物或植物的酶基因

3、构建“多酶复合物”或多酶复合体系：

4、通过移除