生物大分子的制备蛋白质酶的分离纯化专家讲座

1

生物大分子制备2

蛋白质（酶）分离纯化第四章样品全息制备第1页1

生物大分子制备1.1

概述1.2

生物大分子制备前处理1.3

生物大分子分离纯化1.4样品保留第2页1.1概述在生命科学高度发展今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功效研究是探求生命奥秘中心课题，而生物大分子结构与功效研究，必须首先处理生物大分子制备问题，假如没有能够到达足够纯度生物大分子制备工作为前提，结构与功效研究就无从谈起。然而生物大分子分离纯化与制备是一件十分细致而困难工作。第3页⑴生物材料组成极其复杂，经常包含有数百种乃至几千种化合物。⑵许多生物大分子在生物材料中含量极微，分离纯化步骤繁多、流程长。⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内环境时就极易失活，所以分离过程中怎样预防其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。⑷生物大分子制备几乎都是在溶液中进行，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成综合影响，极难准确预计和判断。⑸生物大分子中各种详细物质组成百分比不一样。与化学产品分离制备相比较，生物大分子制备有以下主要特点：第4页生物大分子制备通常可按以下步骤进行：①确定要制备生物大分子目标和要求，是进行科研、开发还是要发觉新物质。②建立对应可靠分析测定方法，这是制备生物大分子关键。③经过文件调研和预备性试验，掌握生物大分子目标产物物理化学性质。④生物材料破碎和预处理。⑤分离纯化方案选择和探索，这是最困难过程。⑥生物大分子制备物均一性（即纯度）判定，要求到达一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。⑦产物浓缩、干燥和保留。第5页分析测定方法主要有两类：即生物学和物理、化学测定方法。生物学测定法主要有：酶各种测活方法、蛋白质含量各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法(紫外/可见、红外和荧光等分光光度法)、电泳法、以及核磁共振等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定愈加紧速、简便。第6页要了解生物大分子物理、化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中溶解性。②

在不一样温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子稳定性。③固态时对温度、含水量和冻干时稳定性。④各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带电情况、在电场中行为、离心沉降时表现、在各种凝胶、树脂等填料中分配系数。⑤其它化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶稳定性和对各种化学试剂稳定性。⑥对其它生物分子特殊亲和力。第7页生物大分子分离纯化方法各种多样，主要是利用它们之间特异性差异，如分子大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其它分子亲和性等。各种方法基本原理能够归纳为两个方面：①利用混合物中几个组分分配系数差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，经过物理力场作用，使各组分分配于不一样区域，从而到达分离目标，如电泳、离心、超滤等。当前纯化蛋白质等生物大分子关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。第8页1.2生物大分子制备前处理1.2.1生物材料选择制备生物大分子，首先要选择适当生物材料。材料起源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。选择材料应含量高、起源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当溶剂中提取，假如所要求成份在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保留。动物材料则需深度冷冻保留。第9页1.2.2细胞破碎不一样生物体或同一生物体不一样部位组织，其细胞破碎难易不一，使用方法也不相同，如动物脏器细胞膜较脆弱，轻易破碎，植物和微生物因为含有较坚固纤维素、半纤维素组成细胞壁，要采取专门细胞破碎方法。(1)机械法：①

研磨：将剪碎动物组织或其它生物材料置于研钵或匀浆器中，加入少许石英砂研磨成匀浆。②

组织捣碎器：这是一个较猛烈细胞破碎方法，通常可先用家用食品加工机械将组织打坏，然后再用10000～0r/min内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织细胞打坏。第10页(2)物理法：①重复冻融法：将待破碎细胞冷至-15℃到-20℃，然后放于室温（或40℃）快速融化，如此重复冻融屡次，因为细胞内形成冰粒使剩下胞液盐浓度增高而引发细胞溶胀破碎。②超声波处理法：此法是借助超声波振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。③压榨法：这是一个温和、彻底破碎细胞方法。在1000×105

Pa～×105

Pa

高压下使细胞悬液经过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。④冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，马上放入冰浴中使之冷却，如此重复屡次，绝大部分细胞能够被破碎。第11页(3)化学与生物化学方法：①自溶法：将新鲜生物材料存放于一定

pH

和适当温度下，细胞结构在本身所含有各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。②溶胀法：细胞膜为天然半透膜，在低渗溶液和低浓度稀盐溶液中，因为存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。③酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，能够专一性地将细胞壁分解。④有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基磺酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也能够与研磨法联合使用。第12页1.2.3生物大分子提取

“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎细胞置于溶剂中，使被分离生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来天然状态不丢失生物活性过程。通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大；远离等电点pH值，溶解度增加。影响提取原因主要有：目标产物在提取溶剂中溶解度大小；由固相扩散到液相难易；溶剂pH值和提取时间等。注意：提取时所选择条件应有利于目标产物溶解度增加和保持其生物活性。第13页蛋白质和酶提取普通以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最惯用溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意几个主要影响原因是：1)盐浓度(即离子强度)：离子强度对生物大分子溶解度有极大影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度溶液中都有较大溶解度，如在纯水中加入少许中性盐，蛋白质溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象产生主要是少许离子活动，降低了偶极分子之间极性基团静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力结果。为了提升提取效率，有时需要降低或提升溶剂极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度(如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4)，能够增加溶液极性。⑴水溶液提取：第14页2)pH值：蛋白质、酶与核酸溶解度和稳定性与pH值相关。过酸、过碱均应尽可能防止，普通控制在pH=6～8范围内，提取溶剂pH应在蛋白质和酶稳定范围内，通常选择偏离等电点两侧。

3)温度：为预防变性和降解，制备含有活性蛋白质和酶，提取时普通在0～5℃低温操作。

4)预防蛋白酶或核酸酶降解作用：加入抑制剂或调整提取液pH、离子强度或极性等方法使对应水解酶失去活性，预防它们对欲提纯蛋白质、酶及核酸降解作用。5)搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物溶解，普通采取温和搅拌为宜，速度太快轻易产生大量泡沫，增大了与空气接触面，会引发酶等物质变性失活。因为普通蛋白质都含有相当数量巯基，有些巯基经常是活性部位必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间二硫键，造成酶活性丧失。在提取液中加入少许巯基乙醇或半胱氨酸以预防巯基氧化。第15页一些和脂类结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，惯用不一样百分比有机溶剂提取。惯用有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂能够与水互溶或部分互溶，同时含有亲水性和亲脂性。有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定百分比有机溶剂水溶液中，在这种情况下，采取稀有机溶液提取经常能够预防水解酶破坏，并兼有除去杂质提升纯化效果作用，如胰岛素提取即是如此。⑵有机溶剂提取第16页因为生物体组成成份是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，所以不可能有一个适合于各类分子固定分离程序，但多数分离工作关键部分基本伎俩是相同。为了防止盲目性，节约试验探索时间，要认真参考和借鉴前人经验，少走弯路。惯用分离纯化方法和技术有：沉淀法（包含：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。1.3生物大分子分离纯化第17页

沉淀是溶液中溶质由液相变成固相而析出过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不但适合用于试验室中，也可用于一些生产目标制备过程，是分离纯化生物大分子，尤其是制备蛋白质和酶时最惯用方法。经过沉淀，将目标生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步分离。沉淀法基本原理是依据不一样物质在溶剂中溶解度不一样而到达分离目标，不一样溶解度产生是因为溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力差异而引发，溶解度大小与溶质和溶剂化学性质及结构相关，溶剂组分改变或加入一些沉淀剂以及改变溶液pH值、离子强度和极性都会使溶质溶解度产生显著改变。1.3.1沉淀法第18页⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶分离纯化。⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子分离纯化。⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去一些不耐热和在一定

pH

值下易变性杂蛋白。⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质沉淀，但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。⑸有机聚合物沉淀：是发展较快一个新方法，主要使用聚乙二醇(Polyethyeneglycol,

PEG)作为沉淀剂。在生物大分子制备中最惯用几个沉淀方法是：第19页在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都能够用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最广还是在蛋白质领域，已经有八十多年历史，其突出优点是：①成本低，不需要尤其昂贵设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质含有稳定作用。1.3.1.1中性盐沉淀（盐析法）第20页蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1～100nm颗粒亲水胶体，减弱了蛋白质分子之间作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中稳定原因有两个：即电荷和水膜。因为中性盐亲水性大于蛋白质和酶分子亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图以下页“图”所表示。⑴中性盐沉淀蛋白质基本原理第21页盐析原理示意图第22页惯用中性盐中最主要是(NH4)2SO4，因为它与其它惯用盐类相比有十分突出优点：⑵中性盐选择1)溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高溶解度，这是其它盐类所不具备。因为酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下(0～4℃)进行。由下表能够看到，硫铵在0℃时溶解度，远远高于其它盐类：

几个盐在不一样温度下溶解度(g/100ml水)0℃20℃80℃100℃(NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.81012)分离效果好：有提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就能够除去75％杂蛋白，纯度提升了4倍。3)不易引发变性，有稳定酶与蛋白质结构作用有酶或蛋白质用2～3mol/L浓度(NH4)2SO4保留可达多年之久。4)价格廉价，废液不污染环境。第23页最惯用是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下迟缓均匀少许屡次地加入，靠近计划饱和度时，加盐速度更要慢一些，尽可能防止局部硫酸铵浓度过大而造成不应有蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采取离心分离，高浓度硫酸铵惯用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫酸铵量可由附录中查出。⑶盐析操作方法第24页⑷盐析曲线制作假如要分离一个新蛋白质和酶，没有文件数据能够借鉴，则应先确定沉淀该物质硫酸铵饱和度。蛋白质量(mg)或酶活力

102030405060708090100硫铵饱和度第25页1)蛋白质浓度：高浓度蛋白质用稍低硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质共沉淀作用。低浓度蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中蛋白质浓度是2.5～3.0％，相当于25～30mg/mL。2)pH值对盐析影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质等电点附近。3)温度影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质溶解度大多数还是随浓度升高而增加。普通情况下，可在室温下进行。但对于一些对温度敏感酶，要求在0～4℃下操作，以防止活力丧失。⑸盐析影响原因第26页1.3.1.2有机溶剂沉淀法基本原理：有机溶剂对于许多蛋白质(酶)、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用沉淀方法之一。其原理主要是：①降低水溶液介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液介电常数，减小溶剂极性，从而减弱了溶剂分子与蛋白质分子间相互作用力，造成蛋白质溶解度降低而沉淀。②因为使用有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水同时从蛋白质分子周围水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子水膜，因而发生沉淀作用。第27页有机溶剂沉淀法优缺点：优点：①分辨能力比盐析法高，即一个蛋白质或其它溶质只在一个比较窄有机溶剂浓度范围内沉淀。②沉淀不用脱盐，过滤比较轻易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛应用。缺点：①对一些含有生物活性大分子轻易引发变性失活，操作需在低温下进行。②有机溶剂选择和浓度计算用于生化制备有机溶剂选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶惯用是乙醇、甲醇和丙酮。为了取得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。第28页①温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度尤其敏感，温度稍高就会引发变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，所以必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须迟缓且不停搅拌以免局部过浓。普通规律是温度越低，得到蛋白质活性越高。②样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用百分比更大有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，能够节约有机溶剂，降低变性危险，但杂蛋白共沉淀作用大。通常使用5～20mg/mL蛋白质初浓度为宜。有机溶剂沉淀影响原因：第29页③pH值：选择在样品稳定pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提升此沉淀法分辨能力。④离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超出5％为宜，使用乙醇量也以不超出原蛋白质水溶液２倍体积为宜，少许中性盐对蛋白质变性有良好保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。沉淀所得固体样品，假如不马上溶解进行下一步分离，则应尽可能抽干沉淀，降低其中有机溶剂含量，如若必要能够装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品生物活性。第30页1.3.1.3选择性变性沉淀法这一方法是利用生物大分子与非目标生物大分子在物理化学性质等方面差异，选择一定条件使杂蛋白等非目标物变性沉淀而得到分离提纯。⑴热变性利用生物大分子热稳定性差异，加热升高温度使非目标生物大分子变性沉淀而保留目标物在溶液中。⑵表面活性剂和有机溶剂变性使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。⑶选择性酸碱变性利用对pH值稳定性不一样而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行分离纯化步骤。第31页利用含有不一样等电点两性电解质，在到达电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，能够利用此法进行初步沉淀分离。因为许多蛋白质等电点十分靠近，而且带有水膜蛋白质等生物大分子仍有一定溶解度，不能完全沉淀析出，所以，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其它沉淀剂一起配合使用，以提升沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目标物。1.3.1.4等电点沉淀法第32页1.3.1.5有机聚合物沉淀法有机聚合物是六十年代发展起来一类主要沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶纯化。其中应用最多是“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)】(PolyethyleneGlycol，简写为PEG)，它亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围分子量，在生物大分子制备中，用较多是分子量为6000～0PEG。本方法优点是：①操作条件温和，不易引发生物大分子变性。②沉淀效能高，使用极少许PEG即能够沉淀相当多生物大分子。③沉淀后有机聚合物轻易去除。第33页

在生物大分子制备过程中，除盐、除少许有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析技术。透析只需要使用专用半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出样品液称为“保留液”，袋（膜）外溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量(MwCO)通常为10KD左右。用

1％

BaCl2

检验

(NH4)2SO4，用1％AgNO3检验NaCl、KCl等。1.3.2透析第34页超出滤即超滤，是一个加压膜分离技术，即在一定压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径特制薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜一边，从而使大分子物质得到了部分纯化。

超滤可广泛用于含有各种小分子溶质各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）浓缩、分离和纯化。1.3.3超滤第35页超滤工作原理示意图受压生物大分子和小分子溶液浓缩生物大分子小分子溶液第36页依据所加操作压力和所用膜平均孔径，可将超滤分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用操作压通常小于4×104Pa，膜平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为4×104

～7×105Pa，膜平均孔径为10-100埃，用于分离大分子溶质。反渗透所用操作压力比超滤更大，常到达35×105～140×105Pa，膜平均孔径最小，普通为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。第37页超滤技术优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术试验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相改变，而且不引发温度、pH改变，因而能够预防生物大分子变性、失活和自溶。在生物大分子制备技术中，超滤主要用于生物大分子脱盐、脱水和浓缩等。超滤法也有一定不足，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，普通只能得到10～50％浓度。第38页超滤技术关键是膜。惯用膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者混合物制成。近年来发展了非纤维型各向异性膜，比如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH1-14都是稳定，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定，能连续用1～2年。超滤膜基本性能指标：水通量(cm3/(cm2·h))；截留率(以百分率％表示)；化学物理稳定性(包含机械强度)等。超滤装置由若干超滤组件组成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。因为超滤法处理液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。第39页

冰冻干燥机是生化与分子生物学试验室必备仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好方法就是冰冻干燥，因为生物大分子轻易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩方法。

冰冻干燥是先将生物大分子水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥原理可用溶剂三相点相图来说明，见下列图：1.3.4冰冻干燥第40页三相点相图第41页当温度在三相点O以下，将压力降至OC线以下，溶剂（通常是水）就能够由固相直接升华为汽相。冰：-40℃上方蒸汽压为0.1mmHg，-60℃上方蒸汽压为0.01mmHg。1克0℃冰变成0℃蒸汽需吸热580千卡，容器外壁上会挂霜。突出优点：①

样品不起泡，不暴沸。②

得到干粉样品不粘壁，易取出。③

冰干后样品是疏松粉末，易溶于水。第42页①

样品要溶于水，不含有机溶剂，不然冰点降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油。②

样品要予先脱盐，不然冰冻后易融化。③

样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大改变，需加入pH稳定剂，如糖类和钙离子等。④

样品溶液浓度不要过稀，比如蛋白质浓度不低于15mg/mL为宜。1.3.4.1适于冰冻干燥样品溶液：第43页⑴

用各种尺寸培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，能够使用安瓿瓶和青霉素小瓶。用烧杯时液层厚度不要超出2cm。⑵

冻干稀溶液时会得到很轻绒毛状固体样品，轻易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔薄膜或吸水纸包住杯口，刺孔不要过小过少，不然会影响冻干速度。1.3.4.2装样品溶液冰冻干燥容器：⑶溶液冰冻：可用干冰-乙醇低温浴速冻，边冻边旋转形成很薄冰冻层，能够大大加紧冻干速度。第44页①

样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干样品粉末。②

若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心小冰块，再稍加延长冻干时间即可。③

冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下停留时间过长而失活。④

停真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要迟缓，以免气流冲散样品干粉。⑤

样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。⑥

真空泵要经常检验油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油。⑷

冻干：第45页1.3.5分离纯化方法选择制备生物大分子方法能够粗略地分类以下：①

以分子大小和形态差异为依据方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。②

以溶解度差异为依据方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。③

以电荷差异为依据方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。④

以生物学功效专一性为依据方法：亲和层析等。第46页1.3.5.1样品早期分离纯化①粗提取液中物质成份十分复杂。②欲制备生物大分子浓度很稀。③物理化学性质相近物质很多。④希望能除去大部分与目标产物物理化学性质差异大杂质。①要快速、粗放。②能较大地缩小体积。③分辨力无须太高。④负荷能力要大。(1)特点：(2)对所选方法要求：第47页吸附；萃取；沉淀法(热变性、盐析、有机溶剂沉淀等)；离子交换（批量吸附、胖柱交换）；亲和层析等。(3)可选取方法：第48页1.3.5.2样品晚期分离纯化(1)可选取方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。(2)要注意一些问题：①盐析后要及时脱盐。②用凝胶过滤时怎样缩小上样体积，因为凝胶层析柱上样体积只能是柱床体积1/10～1/6，也能够使用串联柱以加大柱床体积。③必要时也能够重复使用同一个分离纯化方法，比如：分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两次凝胶过滤、离子交换层析等。第49页④分离纯化步骤前后要有科学安排和衔接，尽可能降低工序，提升效率。比如：吸附不能够放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析上样量能够不受限制，只要不超出柱交换容量即可。⑤分离纯化后期，目标产物纯度和浓度都大大提升，此时对于很多敏感酶极易变性失活，所以操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低温下(如在冷室中)进行。⑥得到最终产品后，必要时要马上冰冻干燥，分装并写明标签，-20℃或-70℃保留。第50页1.4样品保留生物大分子制成品正确保留极为主要，一旦保留不妥，辛辛劳苦制成样品失活、变性、变质，使前面全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。⑴

空气：空气空气影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。⑵

温度：每种生物大分子都有其稳定温度范围，温度升高10℃，氧化反应约加紧数倍，酶促反应增加1～3倍。影响生物大分子样品保留主要原因有：第51页⑶

水份：样品本身所带水份和由空气中吸收水份。水能够参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。⑷

光线：一些生物大分子能够吸收一定波长光，使分子活化不利于样品保留，尤其日光中紫外线能量大，影响最大，样品受光催化反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。所以样品通常都要避光保留。⑸

样品pH：保留液态样品时注意其稳定pH范围，正确选择保留液态样品缓冲剂种类和浓度十分主要。⑹

时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不一样样品有其不一样使用期，所以，保留样品必须写明日期，定时检验和处理。第52页⑴低温下保留：通常要保留于-5～-20℃，-70℃保留最理想。极少数酶能够耐热：如核糖核酸酶能够短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中能够耐受90℃；蔗糖酶在50～60℃能够保持15～30min不失活。还有少数酶对低温敏感，如鸟肝丙酮酸羧化酶。⑵制成干粉或结晶保留：蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长久保留。现以保留蛋白质和酶为例：第53页①惰性生化或有机物质：如糖类、脂肪酸、牛清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持稳定疏水环境。②中性盐：有一些蛋白质要求在高离子强度(1～4mol/L或饱和盐溶液)极性环境中才能保持活性。惯用MgSO4、NaCl、(NH4)2SO4等。使用时要脱盐。③巯基试剂：一些蛋白质和酶表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中氧缓馒氧化为磺酸或二硫化物而变性，保留时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。⑶在保护剂下保留：第54页2蛋白质（酶）分离纯化2.1酶活性测定2.2酶溶液制备2.3酶分离纯化基本过程2.4依据分子大小轻重建立分离纯化方法2.5调整溶解度分离方法2.6按电荷正负性设计分离方法2.7依据亲和作用建立纯化方法2.8依据稳定性差异建立分离纯化方法2.9蛋白质（酶）高效液相色谱分离分析法第55页酶分离提纯包含三个基本步骤：抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；制剂：即将酶制成各种剂型。(1)

要注意预防酶变性失活.(2)

酶分离纯化目标是将酶以外全部杂质尽可能除去，所以，在不破坏所需酶条件下，可使用各种“激烈”伎俩。另外，因为酶和它底物、抑制剂等含有亲和性，当这些物质存在时．酶理化性质和稳定性发生了一定改变，从而提供了更多条件和方法可供采取。(3)

酶含有催化活性。检测酶活性，跟踪酶来龙去脉，为选择适当方法和条件提供直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性．一个好方法和办法会使酶纯度提升倍数大，活力回收高，同时重复性好。依据酶本身特征，在分离纯化工作中必须注意以下问题:第56页2.1酶活性测定酶活力

(EnzymeActivity)

也称酶活性，指酶催化一定化学反应能力。酶活性是研究酶特征、分离纯化以及酶制剂生产和应用时一项不可缺乏指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应反应初速度来表示。酶反应速度（指初速度）可用单位时间内单位体积中底物降低许或产物增加量来表示，其单位为mol/s。2.1.1酶活力单位2.1.2摩尔催化活性/分子活性和转化率（催化中心活力）第57页摩尔催化活性(MolarCatalyticActivity)表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换分子数目。依据米氏方程：Vmax=K0[E]K0=Vmax/[E]K0即为转换率

(也用Kcat表示)，假如每一个酶分子只有一个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性，假如一个酶分子有几个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n。每种酶转换率不一样，下表列出了几个酶转换率：酶转换率(1/s)酶转换率(1/s)碳酸酐酶600,000凝乳蛋白酶100乙酰胆碱脂酶25,000DNA聚合酶Ⅰ5青霉素酶2,000Trp合成酶2乳酸脱氢酶1,000溶菌酶0.5第58页2.1.3比活力

比活力(性)(SpecificActivity)是酶纯度量度，指单位重量蛋白质中所含有酶活力单位数，普通用IU/mg蛋白质来表示。一般来说，酶比活力越高，酶越纯。2.1.4酶活力测定方法酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂浓度以及缓冲液种类和浓度都亲密相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。2.1.4.1终止反应法(StoppedMethod)终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停顿，取出反应物或产物，给予分离，再确定反应物消耗量，或产物形成量，算出酶活性。使酶停顿作用惯用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用SDS使酶失活或加热使酶变性等。产物测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。第59页⑴酶法

酶法是用其它纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定化合物。通常采取偶联法，比如葡萄糖氧化酶催化以下反应：

葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生以下反应:第60页因为4-甲氧联酚在435nm波优点有光吸收峰，所以、只要测定A435，就可知4-甲氧联酚量，可得H2O2量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶)必须过量，不然，将出现下列图情况。普通偶联酶量最少也应在5倍以上。偶联法中偶联酶对反应速度影响第61页再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖＋ATP→葡萄糖-6-P其偶联-指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-P+NADP+→6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+这时即可测定340nm处光吸收增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）活性。酶偶联测定法可用分开也可用连续反应系统进行。第62页(2)化学法化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性。

化学分析法优点是：不需要特殊仪器，普通有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数酶，都可依据底物及产物化学性质，设计详细测定方法，应用范围较广。缺点是：因为测定结果是依据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程全貌，而且在实际操作过程中，取样及停顿时间不轻易准确控制，所以对于反应较快酶反应，结果不够准确。当前，市场上已经有酶反应仪商品，可将不一样时间取样、停顿反应、加入反应试剂、保温、比色或其它测定方法编排成程序，自动依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分析法必须作出新评价。第63页⑶放射性化学法是由含有放射性产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶活性。优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活性测定，尤其适合用于低浓度酶和底物测定。缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪，而且同位素对人体有损伤作用。另外，辐射淬灭会引发测定误差，如3H发射射线很弱，甚至会被纸吸收。第64页2.1.4.2连续反应法(ContinuousMethod)连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等改变用仪器跟踪检测反应进行过程，统计结果，算出酶活性。连续法使用方便，一个样品可屡次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。⑴普通连续法：包含光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适合用于一些反应速度较快酶，自动统计仪普遍使用使该法更轻易被人们所接收。第65页几个连续法例子酶反应观察方法乳酸脱氢酶乳酸+NAD+→丙酮酸+NADH+H+丙酮酸+NADH→乳酸+NAD+340nm波优点有NADH形成340nm波优点有NADH降低糖苷酶(Glycosidase)Methylumbelvifery+glucoside→糖+Methylumbeviferone甲基伞型酮(Methylumbelviferone)发出荧光内纤维素酶纤维素→低聚葡萄糖黏度下降己糖激酶葡萄糖+mgATP→6-P-葡萄糖+ADP+H+pH降低，用pH计非专一性磷脂酶405nm波长有硝基苯酚生成第66页⑵偶联连续法是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测化合物。连续偶联反应必须在酶反应相同条件(pH、温度等)下进行，且加入指示酶以及其它各种物质不能干扰原来酶活力。如醛缩酶(Aldolase)催化1,6-二磷酸果糖生成3-P-甘油醛和磷酸二羟丙酮反应，这些产物都无法直接测出，用磷酸丙糖异构酶(TriosePhosphateIsomerase)作偶联酶(CouplingEnzyme)、甘油-1-P-脱氢酶(Glycerol-1-PhosphateDehydrogenase)作指示酶，依据NADH变成NAD+光谱改变来算出醛缩酶活性。以下列图：第67页醛缩酶以1-P-甘油脱氢酶为指示酶偶联测定酶活性法第68页2.1.4.3酶活力测定中应注意几个问题酶反应和普通化学反应一样，都是在一定条件下进行，但酶反应要比普通化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这么一个决定性原因。所以，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学方法操作要求外，又有它—些特点。首先，测定酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比。初速度确实定普通指：底物消耗量在5％以内，或产物形成量占总产物量15％以下时速度。其次，底物浓度、辅因子浓度必须大于酶浓度

(即过饱和)，不然，底物浓度本身是一个限制因子，此时反应速度是两个原因复变函数。第三，反应必须在酶最适条件（如最适温度、pH和离子强度等）下进行。另外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶激活剂、抑制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓度(E)作图，应得一条经过原点直线，即v为(E)线性函数。第69页初速度确实定是在底物浓度[S]足够条件下，经过[E]改变来确定，以下列图。由图可见，当分别采取不一样酶浓度时，测得反应量对时间改变。求得几个适当初间反应速度（反应量/反应时间）。再用反应速度对酶量作图。由图可见，其中，5min时测得数据可用于求出初速度，若以10min以上数据时，测得酶活性偏低。第70页第71页2.1.4.4酶活性测定实例这是一类专门去除体内超氧阴离子酶，催化反应为:O2·﹣+O2·﹣+2H+→H2O2+O2因为O2

·﹣在溶液中极不稳定，给酶活性测定带来许多不便。当前已经有依据O2·﹣物理性质测定O2·﹣歧化量，从而直接测定

SOD

活力方法。如电子顺磁共振波谱法(ESR)、核磁共振法(NMR)、紫外分光光度法等。这里只介绍以邻苯三酚法测定酶活力为例化学法。邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生超氧阴离子自由基可经过自氧化速率来表示。加入SOD，可抑制自氧化速率，由此计算出酶活力。SOD单位定义为：一定试验条件下（见操作），抑制率到达50%时SOD浓度为1个酶单位。(1)超氧化物歧化酶(SOD)活力测定第72页单位体积活力(u/ml)={([(0.07-样品速率)/0.07]×100%)/50%}

×反应液总体积×(反应液稀释倍数/样液体积)总活力=单位体积活力(u/ml)×原液总体积操作：在试管中加入pH8.250mmol/LTris-HCl缓冲液4.5ml，于25℃保温20min，然后加入预热45mmol/L连苯三酚溶液（对照管用10mol/LHCl代替）10μl，快速摇匀倒入1cm比色杯，每隔30s在325nm处测一次光吸收值，即可测定出连苯三酚自氧化速率，普通要求自氧化速率控制在0.070OD/min。测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不一样仅是在加入缓冲液后再加入10μl待测样品即可。酶活力计算方法：用这种方法测酶活力时，应注意因为连苯三酚和被测样液加入量只有10μl，在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体积按4.5计算。第73页(2)糖苷酶活力测定糖苷酶活力测定多用人工底物，如对硝基苯基糖苷在糖苷水解酶作用下，糖苷键断裂，产生等当量糖和对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下于400nm处有特异吸收，从对硝基苯酚对光吸收标准曲线即可计算出糖苷水解酶活性。操作：试管中加入5mmol/L对硝基苯基糖苷200ul，pH4.60.2mol/L磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸配制缓冲液200ul，37℃预保温10min，再加入χμl待测样品并用水补足到100ul，37℃反应15min，用0.5mol/LNa2CO31ml终止反应(注意空白管用水代替对硝基苯基糖苷和待测样品)，在400nm处测定A值，酶单位定义为在上述测定条件下每分钟释放1μmol对硝基苯酚量为1个单位酶，对照标准曲线，即可计算出酶活力。第74页2.2酶溶液制备酶溶液制备包含三个过程工作，材料预处理和破碎细胞、抽提、抽提液浓缩。2.2.1材料预处理及破碎细胞酶蛋白在细胞内外分布有三种情况：一是释放到细胞外酶，叫胞外酶；二是游离在细胞内酶．叫溶酶；三是牢靠与膜或细胞颗粒结合在—起，叫结酶，后二者合称胞内酶。因为酶蛋白分布不一样，提取方法有所差异。微生物胞外酶，用盐析，或单宁沉淀。有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞内酶需搜集菌体，经破细胞后提取，其中结酶还有个打断酶蛋白和细胞颗粒结合问题。动植物细胞，也有打破细胞问题，对动物材料，应剔除结缔组织、脂肪组织等；对植物材料如种子应去壳，以免单宁等物质着色污染。进行预处理后，就是破碎细胞。细胞破碎有物理和化学方法两大类：第75页2.2.1.1物理粉碎法(1)研磨手磨法是试验室内惯用方法。用石英砂或氧化铝作助磨剂来制备无细胞抽提液。此法简单但效率低，制备量少。球磨法，将干菌体放人球磨机，经数小时研磨，用水或缓冲液抽提。石磨法是选择坚硬石磨，装上动力研磨。细菌磨也是在试验室中使用很好方法。(2)机械捣碎匀浆器和高速组织捣碎器等对细胞作机械破碎。(3)高压法在坚固圆柱体容器内装上菌体与助磨剂，在2-15℃下，于活塞上加压冲击，以破碎细胞。(4)爆破性减压法将菌体悬浮在N2/CO2高压下平衡，37℃振荡数分钟，然后突然减压，使细胞壁、膜破碎。(5)专用波振荡专用波振动经过液体时形成局部减压，叫空化作用，旋涡生成与消失时，产生很大压力，从而使细胞破碎。(6)快速冰冻融化法因为突然冰冻，使胞内水形成结晶及胞内外浓度突然改变，可使一些细胞破碎。第76页2.2.1.2化学法(1)渗透作用将指数生长久菌体用缓冲液洗净，并悬于含蔗糖、EDTA稀Tris缓冲液中，待平衡后离心，加入MgCl2猛烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。(2)干燥处理干燥方法可用空气干燥、真空干燥、冷冻以及脱水干燥。如空气干燥，普通在25-30℃或高到35-40℃气流中吹干，然后将干菌体悬浮于3-5倍水中或缓冲液中，室温搅拌2-3h抽提。(3)自溶向菌体中加醋酸乙酯、甲苯、乙醚及氯仿，使细胞渗透性改变，保温一定时间后，能够使菌体自溶。(4)溶菌酶处理用溶菌酶专一性地分解菌体细胞壁上多糖分子β-1,4-糖苷键，从而破坏细胞壁。(5)酶处理作用于细胞壁酶有白细胞酶、溶菌酶等，用以处理细胞，使酶释放出来。⑹表面活性剂处理

膜结合酶在细胞破碎后极难溶解下来，常借助表面活性剂来处理。在适当pH及离子强度条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜渗透性改变或使之溶解。⑺其它

如当细菌感染噬菌体后，噬菌体附着于菌体细胞壁，造成菌体自溶等。第77页2.2.2抽提因为大多数酶蛋白属于球蛋白，所以，普通可用稀盐、稀酸或稀碱水溶液抽提酶。抽提液详细组成和抽提条件选择，取决于酶溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质连结。2.2.2.1pH选取pH，首先考虑酶稳定性。选取pH不应超出酶pH稳定范围。其次，从抽提效果出发，最好远离待抽提酶等电点。也就是说，酸性蛋白宜用碱性溶液抽提；碱性蛋白宜用酸性溶液抽提。第三，在一些情况下，抽提还兼有切断酶与细胞内其它成份间可能有联络，从这点出发，选取pH4-6为佳。第78页2.2.2.5其它

在细胞破碎以后，一些亚细胞结构也受到损伤，常给抽提系统带来不稳定原因，所以有时还要加入一些物质。比如：加入蛋白酶抑制剂,以预防蛋白酶破坏目标酶；为预防氧化，加入Lys或维生素C、惰性蛋白及底物等。2.2.2.2盐

大多数蛋白质在低浓度盐溶液中有较大溶解度。所以，抽提液普通采取等渗溶液。最普通为0.020-0.050mol/L磷酸缓冲液、0.15mol/LNaCl等；惯用到还有焦磷酸钠和柠檬酸钠缓冲液，有利于切断酶和其它物质联络；据报道，少数情况下用水抽提亦佳，这可能与低渗破坏细胞结构相关。2.2.2.3温度温度通常控制在0-4℃左右。假如酶比较稳定，能够例外，如胃蛋白酶可在37℃保温抽提。2.2.2.4抽提液用量

抽提液用量常采取原料量1-5倍。有时，为了抽提效果好些需要重复抽提时，抽提溶液百分比可能大些。第79页总之，打破细胞后，溶酶普通不难抽提。至于结合酶，其中有些和颗粒结合不太紧，在颗粒结构受损伤时，抽提也不难。比如：α-酮戊二酸脱氢酶、延胡索酸酶，可用缓冲液抽提出来；CytC可用0.145mol/LTCA溶液抽提出来。那些和颗粒结合紧密酶，常以脂蛋白络合物形式存在，其中有在作成丙酮粉以后，就能够抽提出，有却要使用强烈伎俩，如正丁醇等处理。正丁醇兼有高度亲脂性和亲水性（尤其是磷酸盐），能破坏蛋白间结合使酶进入溶液，如琥珀酸脱氢酶。近年来，广泛采取表面活性剂，如胆脂酸盐、Triton、Tween、Teepol、SDS等，抽提呼吸链酶系。链霉菌葡萄糖异构酶抽提，向菌体悬浮液中加入0.1％十二烷基吡啶氯化铵，酶抽出率提升到8倍等（表）。另外，有时使用促溶剂如高氯酸；有时还用酶处理，如脂肪酶、核酸酶、蛋白酶等。第80页表面活性剂对葡萄糖异构酶抽提效果影晌抽提后细胞残渣或固体成份可用离心或过滤除去，离心时，加

入Al(OH)3凝胶或Ca3(PO4)2等物质，有利于除去悬浮胶体物质。表面活性剂类型释出酶活力总酶活力释出(%)无—1.210.611.3十二烷基苯磺酸钠阴离子2.410.123.8十二烷基醇磺酸钠阴离子3.811.233.9十六烷基吡啶氯化铵阴离子8.411.970.6十二烷基吡啶氯化铵阳离子10.411.689.7十六烷基甲基溴化铵阳离子9.911.685.9聚氯乙烯非离子型2.910.926.6第81页2.2.3酶溶液净化与脱色在酶抽提液或发酵液中常含有细胞、细胞碎片等固形物质和蛋白质、粘多糖、脂类和核酸等大分子物质，通常应经过离心或过滤而净化。因为发酵液浓度较大，细胞颗粒微小（细菌细胞只有1-l0μm），相对密度只有1.03，有些细菌细胞表面带负电荷与发酵胶液流动电位电荷相互排斥；因为细胞壁外层多糖、蛋白质等生物大分子与水结合成水化层而形成疏水强稳定颗粒，这些在生产上为酶溶液离心或过滤净化处理带来困难，通常需要使用絮凝剂后才能净化。第82页材料絮凝处理絮凝结果碱性蛋白酶发酵液200ml，pH6.4碱性蛋白酶发酵液对照添加0.26%阳离子聚丙烯酰胺(PAM)分子量为200-300万,终浓度为328-429μl/L,先加25%Al2(SO4)3,终浓度为0.65-0.84%助凝,再加同上PAM先加Al2(SO4)3助凝剂(同上),再加分子量为400-500万,0.0047%PAM,终浓度为105μl/L先加明矾1.5-2.0%或AlCl3·6H2O1%助凝,再加PAM60μl/L絮凝,加Na2HPO41.5%,CaCl22.5%,pH8.0滤速0.8ml/5min滤速4.5ml/5min滤速29ml/5min滤速24ml/5min比硝酸盐凝胶滤速高5倍,滤速500L/h细菌α-淀粉酶1000ml，pH6.9细菌α-淀粉酶1000ml黑曲霉8471糖化酶发酵液100ml，pH4.0对照先加Al2(SO4)325ml,终浓度为0.47%助滤,再加分子量为200万阳离子PAM(0.13%)300ml,终浓度为294μl/L絮凝,先加碱式氯化铝1.7%,PAM0.35%(350μl/L)絮凝先加30%碱式氯化铝4ml,再加分子量为700万PAM0.2%(终浓度74μl/L)搜集滤液20ml絮凝需23min20ml需35min滤速比磷酸盐絮凝高1倍,为81.5ml/min滤速为对照1.7倍,酶活损失<10%赖氨酸发酵液含固形物2.78%，100mlpH5-6高温α-淀粉酶pH6.5-7对照加阳离子PAM(分子量为400万)1.6ml(终浓度为32μl/L)先加30%碱式氯化铝2ml,(终浓度为0.36-0.75%),再加分子量为1,140万阳离子PAM2.5ml(终浓度为20μl/L)上述絮凝液再加1%硅藻土先加Al2(SO4)31%助滤,再加壳聚糖絮凝剂滤速100ml需220min搜集滤液100ml,需60min搜集滤液100ml,需60min滤速提升20倍第83页絮凝剂种类分为无机、有机和天然高分子各种。无机絮凝剂：有些无机絮凝剂如铅盐、铁盐等水解后生成氢氧化物凝胶微粒含有吸附作用和电荷作用，产生絮凝下降，有些无机絮凝剂如醋酸钙、磷酸钙等钙盐及锌盐也含有包围吸附沉淀作用；有机絮凝剂：是一些聚合物，多为水溶性直链状大分子，按其链上所带基团不一样而分为阳离子型、阴离子型和非离子型三种，其中以聚丙烯酰胺使用最广泛，也有用阴离子型和非离子型絮凝剂；天然高分子絮凝剂：主要有壳聚糖，壳聚糖与钙盐或铝盐可促进分离效果。第84页有些工业上用酶还需要脱色。但需考虑：在酶提取分离过程中什么阶段进行脱色处理，使脱色工作量最少，又不因为脱色操作而引入杂质。工业上惯用脱色剂是活性炭。活性炭吸附色素而脱色。活性炭用量、处理时间、温度等对脱色效果和酶回收有影响。另外，不一样方法制得活性炭吸附能力也不一样。吸附能力强活性炭，对酶吸附能力也强。用氯化锌法制得活性炭，吸附能力强，而水蒸气法制备活性炭吸附能力弱，但同时能够除臭。活性炭用量普通为0.1-1.5％，依据色素多少而增减。普通因为活性炭颗粒较小，采取静态吸附法进行脱色。第85页另外，离子交换树脂也用于脱色。其中，大孔径树脂效果很好，但在吸附色素同时，会引发脱色液pH和离子强度改变，必须对树脂进行缓冲化，使之与酶溶液pH和离子强度一致。采取无离子交换作用专用于脱色树脂如DuoliteS30、通用1号等进行脱色，对一些酶液效果很好，通用1号脱色树脂在pH5.5以下吸附色素，而在5％碱液中脱出众素，脱出众素后用水冲至中性，再用两倍树脂体积5％盐酸溶液处理，最终用水洗至pH5.5以下，可再生利用。在不一样材料起源酶溶液中加入不一样脱色剂，能够降低色素。比如：从植物材料提取酶时，常加入0.5-1％吡咯烷酮，在枯草杆菌淀粉酶和蛋白酶盐析时，加入亚硫酸盐(Na2SO3、NaHSO3等)，都能够除去部分色素。第86页2.2.4浓缩提取液或发酵液酶蛋白浓度普通很低，如发酵液中酶蛋白浓度普通为0.1-1％，所以，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩方法很多，如盐析或溶剂沉淀法、超出滤法、离子交换树脂法等，这些方法既是浓缩方法，又是分离纯化伎俩；还有真空浓缩及冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。第87页依据溶液相对纯水熔点升高，冰点下降原理，对少许样品，一是将溶液冻成冰，然后迟缓溶解，这么冰块（不含酶）就浮于表面，酶溶解并集中于下层溶液（约为原体积1/4）；二是让酶溶液慢慢冻结后移去水结成冰。这种方法也会发生离子强度和pH改变。2.2.4.1冷冻干燥法将酶溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最终酶呈干粉状。采取这种方法能使各种酶活性长久保留。但操作需注意几个问题：首先被冻最好是酶水溶液，假如混有有机溶剂，会降低水冰点，在干燥时，样品融化而起泡造成酶变性，同时，会使真空泵失效。其次，假如混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引发pH改变，比如pH7磷酸盐在冷冻时因为NaH2PO4会结晶析出，在溶液完全冷冻以前，pH便变成3.5左右。所以，在冷冻前，需将酶溶液脱盐。第88页2.2.4.3超出滤超出滤是在加压条件下，将酶溶液经过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜，而酶等大分子物质被截留，从而到达浓缩目标。假如采取不一样孔径膜，同时又含有分级分离作用。这种方法含有以下优点：不需加热，更适合用于热敏物浓缩；无相改变、设备简单、操作方便；能在广泛pH条件下操作等。所以，近年来发展很快。2.2.4.2蒸发法通常采取减压蒸发法和试验室惯用超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上极少应用。当前，工业上应用较多是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩酶溶液在高度真空下转变成极薄液膜，液膜经过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而到达浓缩目标。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等各种，依据物料不一样而加以选择。第89页２.2.4.4胶过滤利用SephadexG-250或G-50等吸叹水膨胀，酶被排阻在胶外面原理而进行浓缩。2.2.4.5其它如利用聚乙二醇等浓缩，只适合用于小量样品。超滤膜主要有以下几个类型：(1)平面膜将膜平铺在多孔支持板上，加压下（可带有搅拌）酶溶液从膜面流过，水及小分子溶质透过膜孔而排比，大分子溶质（如酶）被截留。(2)管式膜将管式膜置于多孔硬管外侧或内侧，酶溶液在管内或管外流动，水和小分子溶质透过滤膜，而大分子物质被截留而浓缩。(3)中空纤维

将聚砜作成中空膜，成束中空纤维膜装在圆筒真空超滤器中。第90页2.3酶分离纯化基本过程在上述浓缩液或发酵液中，除含有我们需要酶以外，还不可防止地存在着其它大分子物质和小分子物质，其中小分子物质在以后纯化步骤中会自然而然除去。大分子物质中包含核酸、粘多糖及其它蛋白质。核酸及其相关蛋白能够用硫酸鱼精蛋白、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、三甲基氨十六烷基溴及MnCl2预先沉淀，离心除去、必要时，可用核酸酶。依据不一样材料选择不一样试剂。比如从植物组织中提取乙醇酸氧化酶。可在提取液中0.1-0.2％硫酸鱼精蛋白、使之与核酸及相关蛋白形成复合物而沉淀，然后在4℃采取10,500r/min离心而除去.至于粘多糖，惯用醋酸铅、乙醇、单宁酸及离子型表面活性刑等处理除去，有时也用酶除去。余下酶和杂蛋白，所以，酶分离纯化工作主要是，将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液中除去。现有酶分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上差异而建立。2.3.1酶分离纯化方法选择第91页酶和杂蛋白性质差异大致上可有以下几个方面，依据这些差异，其分离方法可有：(1)依据分子大小、轻重设计方法，如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。(2)依据溶解度大小分离方法，如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。(3)按分子所带正负电荷多少分离方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。(4)按稳定性差异建立分离方法，如选择性热变性法表面变性法等。(5)按亲和作用差异建立分离方法，如亲和层析法等。第92页在工作实践中选择方法时：首先应对被纯化酶理化性质（如溶解度、分子量大小、稳定性和解离时电学性质等）有一个比较全方面了解，这么，就能够知道在分离纯化时能够选取哪些方法和条件，防止使用哪些方法和条件，从而得到好纯化效果；其次，判断采取方法和条件是否得当（判断标准是酶活性高低），一个好方法和条件是比活力提升多，总活力回收多，而重复性好，在纯化工作中，往往不宜重复采取相同步骤和条件，因为这么不能使纯度深入提升，而只能使酶总活力下降；再者要严格控制操作条件，伴随酶逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间相互作用力随之下降，酶更不稳定，所以，更要预防酶变性。第93页在酶分离纯化过程中，每步都须做三件事：第一，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)；然后将测得数据加以整理。

2.3.2酶分离纯化过程中一些数据处理步骤总体积(ml)总蛋白(mg)总活力(IU)比活力(IU/mg)纯化倍数(X)产率(%)1.抽提11036564682.10177.30-2.粗酶10145.547179.84324.401.833.SephadexG-506523.338810.341665.689.404.SPC-504011.436563.453207.3218.105.结晶-6.2829642.344346.3424.50引自《生物化学与生物物理学报》，1993,25(1):27。比如分离纯化番麻(Agaveamericana)蛋白酶主要步骤为：叶片经30％乙醇水溶液压榨提取，用冷丙酮制成干粉，经SephadexG-50柱层析和SP-SephadexC-50纯化，取得结晶，纯化结果如表下表:第94页结晶形成过程是自由能降至最小过程。当自由能降至最小并逐步到达平衡状态时，溶质分子开始结晶作用，平衡状态热力学和动力学参数决定于溶剂和溶质理化特征。当溶液处于过饱和状态时，分子间分散或排斥作用小于分子间相互吸引作用，便开始形成沉淀或结晶，因为溶液过饱和，维持水合物水分子相对降低而且不足，溶质分子相互接触机会增加而聚集，不过，当溶液过饱和速度过快时，溶质分子聚集太快，便会产生无定形沉淀。假如控制溶液迟缓地到达过饱和点，溶质分子就可能排列到晶格中，形成结晶。所以，在操作上必须注意：第一，耍调整溶液，使之迟缓地趋向于过饱和点；第二，调整溶液性质和环境条件，使尽可能多溶质分子相互接触，形成结晶。

2.3.3结晶结晶是指分子经过氢键、离子键或分子间力按规则而且周期性排列一个固体形式，因为各种分子间形成结晶条件不一样，也因为变性蛋白质和酶不能形成结晶，所以，结晶既是一个酶是否纯净标志，又是一个酶和杂蛋白分离方法。结晶基本原理第95页

2.3.3.1结晶条件酶蛋白分子形状和理化性质较复杂，使之在溶液中特征也变得复杂，影响其最小溶解度原因也很多，如电解质浓度、酶蛋白浓度、pH、温度等原因；而且，因为经常出现几个最小溶解度，会产生结晶多形性，从而使结晶条件也十分复杂；这么，每种酶蛋白结晶条件也往往不一样。第96页(1)酶纯度普通来说，酶越纯越轻易取得结晶，长成单晶可能性也越大。除个别情况外，普通酶纯度应到达50％以上。(2)酶蛋白浓度

对大多数酶来说，蛋白质浓度在3-50mg/ml很好。普通来说，酶蛋白浓度越高，有利于分子间相互碰撞而聚合，不过酶蛋白浓度过高，往往形成沉淀；酶蛋白浓度过低，不易形成晶核。(3)晶种有些不易结晶酶，需加入微量晶种才能形成结晶，在加入晶种前，要将溶液调整到适于结晶条件下，加入晶种开始溶解，还要追加沉淀剂，直到晶种不溶解为止，当到达晶种不溶解又没有没有定形物形成时，静置，使晶体生长。(4)温度结晶温度，首先要有利于结晶生成；另首先要不超出酶热稳定性。有些酶对温度很敏感，所以要预防酶失活，从现有资料来看，普通控制在0-4℃范围内，通常在4℃下。低温条件对酶不但溶解度降低，而且酶不易变性。(5)pHpH是酶结晶一个主要条件．有时只相差0.2pH单位时，只能得到沉淀，而得不到结晶，所选择pH应在酶稳定范围内，—般选择在被结晶酶pI值附近。为了取得某种酶蛋白结晶，往往需要进行一些适当预备试验探索。第97页(6)金属离子许多金属能引发或有利于酶结品。不一样酶选取不一样金属离子，在酶结晶过程中惯用Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+等金属离子。在许多情况下，这些离子是酶表现活力所必滞，它们能保持酶分子结构上一些特点。(7)其它除上述原因外，还有一些原因会影响结晶形成。比如：需防霉，在结晶过程中不得有微生物生长，普通在高盐浓度或有乙醇时，能够预防微生物生长，在低离子强度蛋白质溶液中，易生长细菌和霉菌。为此，全部溶液需用超滤膜或细菌漏斗过滤，加入少许甲苯、氯仿或吡啶，能够有效地预防微生物生长。又如，在结晶过程中，普通要预防蛋白酶水解作用。蛋白酶水解作用常引发结晶微观不均一性，影响结晶生成和生长。第98页(1)盐析法采取一些中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、乙酸铵、硫酸镁、氯化钙、硝酸铵、甲酸钠等，在适当条件下．保持酶稳定性，慢慢改变盐浓度进行结晶。其中，最惯用是硫酸铵、硫酸钠。普通是将盐加入到比较浓酶溶液中至溶液呈浑浊为止，然后放置，并迟缓增加盐浓度。(2)有机溶剂法酶溶液中滴加一些有机溶剂，如乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、乙睛、二氧杂环己环、异丙醇、二甲基亚砜等，也能使酶形成结晶。普通在含有少许无机盐和适宜pH条件下，于冰浴中迟缓滴入有机溶剂，并不停搅拌，当酶溶液微浑浊时，在冰箱中放置几小时后，便有可能取得结晶。

2.3.3.2结晶方法第99页(3)微量蒸发扩散法将纯酶溶液装入透析袋，用聚乙二醇吸水浓缩至蛋白质含量为1mg/ml左右，然后加入饱和硫酸铵溶液到10％饱和度左右，再将其分装于比色瓷板小孔内，连同饱和硫酸铵溶液放入密封干燥器内，再在4℃下静候结晶。(