CN112940135B 融合蛋白、其氨基酸序列、编码核苷酸序列、制备方法和应用 （四川农业大学）

US2003232055A1,2003.12.18本发明提供了一种融合蛋白、其氨基酸序生物技术领域。所述融合蛋白包含或由至少三分子多肽之间具有至少一个连接子或者没有连接子。将多个PAMP分子多肽组装成具有多个和/23.根据权利要求2所述的编码融合蛋白的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸如SEQID6.根据权利要求5所述的微生物或细胞，其特征在于，所述微生物或细胞包括大肠杆利要求11-14任一项所述的融合蛋白的制备方法制备得到的融合蛋白在提高植物抗病性、3[0006]病原相关模式(PAMPs)是指在进化上具有高度的保守性的一些分子，其特征是能4[0008]由于病原菌种类不同和自然存在的突变，PAMP分子多肽天然存在多种突变体，相同且七个不同及其它更多个相同和不同种类的PAMP体种类不做具体限定，可以根据植物的种类或者针对的病原微生物的种类进行适当的改[0016]本发明通过研究植物的PTI免疫机制，借助基因工程的技术将至少三个特异性的PAMP分子多肽经过分子设计和定向组装形成融合蛋白，融合蛋白具有多个和/或多种免疫相同和/或不同的PAMP分子多肽突变体组成，相邻两个PAMP分子多肽突变体之间具有至少5[0022]flg22是细菌鞭毛蛋白N端的一段保守性极高的区域，许多研究证明flg22能够诱有着重要的影响。flg22的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA。(例如1-10个)氨基酸且具有激活FLS2免疫受体[0023]进一步，激活FLS2免疫受体的第一多肽优选为flg22及其同源突变体。具体的，[0024]上述氨基酸序列不同的第一多肽均属于具有相同功能的同源突变体，均能激活FLS2免疫受体，且被证明具有相近的生物活性，具体信息可以参考文章“Plantshaveasensitiveperceptionsystemforthemostconserveddomainofbacterial[0026]nlp20是由20个氨基酸组成多肽分子，是坏死和乙烯诱导肽样蛋白家族(NLPs)中[0028]上述氨基酸序列不同的第二多肽均属于具有相同功能的同源突变体，均能激活PatternfromaWidespreadMicrobialVirulenceFactorTriggersPattern-Induced6[0030]elf18是细菌蛋白延伸因子Tu(EF-Tu)N末端的18个氨基酸的多肽，能够激活受体[0032]上述氨基酸序列不同的第三多肽均属于具有相同功能的同源突变体，均能激活EFR免疫受体，且被证明具有相近的生物活性，具体信息参考文章“TheNTerminusofBacterialElongationFactorTuElicitsInnateImmunityinArabidopsisPlants”[0034]pip1是prePIP1分泌到细胞外空间并在保守C末端区域切割形成的13个氨基酸的[0036]上述氨基酸序列不同的第四多肽均属于具有相同功能的同源突变体，均能激活的同源突变体pep1m2在SEQIDNO.6所示的氨基酸序列的第9位之前产生了八个氨基酸的缺[0040]上述氨基酸序列不同的第五多肽均属于具有相同功能的同源突变体，均能激活7studiesofAtPep1,aplantpeptidesignalinvolvedintheinnateimmune且具有激活CORE1免疫受体的PAMP体CORE1，可高效诱导烟草防御反应。csp22的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示：的同源突变体csp22m1在SEQIDNO.8所示的氨基酸序列的第11位产生了1个氨基酸的替换[0045]上述氨基酸序列不同的第六多肽均属于具有相同功能的同源突变体，均能激活CORE1免疫受体，且被证明具有相近的生物活性，具体信息参考文章“Thehighlyconservedrna-bindingmotifrnp-1ofbacterialcoldshockproteinsis[0048]flgII-28的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示：ESTNILQRMRELAVQSRNDSNSATDREA。[0049]上述氨基酸序列不同的第七多肽均属于具有相同功能的同源突变体，均能激活twodistinctPseudomonassyringaeflagellinepitopesmodulatesthestrengthResponsivenesstoflg22,flgII-28,andcsp22andPseudomonassyringaepv.tomato8[0051]ralf17的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示：NSIGAPAMREDLPK失、替换一个或多个(例如1-10个)氨基酸且具有激活FER免疫受体能力的PAMP多肽。具体[0052]上述氨基酸序列不同的第八多肽均属于具有相同功能的同源突变体，均能激活FERisaRALF-regulatedscaffoldcontrollingplantimmunesignaling”和“HowCrRLK1LreceptorcomplexesperceiveRALFsignals”中对于激活FER免疫受体的多肽[0053]进一步，所述PAMP分子多肽还包括激活植物免疫反应的第九多肽，优选为多肽[0054]pep13是细胞壁糖蛋白GP42中的一个保守的多肽片段。细胞壁糖蛋白在卵菌中广且具有激活植物免疫反应能力的PAMP多肽。具体的，pep13的同明具有相近的生物活性，具体信息参考文章“Pep-13,aplantdefense-inducing[0057]进一步，所述PAMP分子多肽还包括激活植物免疫反应的第十多肽，优选为多肽明具有相近的生物活性，具体信息参考文章“FunctionalmappingofharpinhrpZofPseudomonassyringaerevealsthesitesresponsibleforprotein9氨基酸且具有激活植物免疫反应能力的PAMP多肽。具体的，sys18的同源突变体sys18m1在突变体sys18m2在SEQIDNO.14所示的氨基酸序列的第10位产生了1个氨基酸的替换突变：证明具有相近的生物活性，具体信息参考文章“Structure-activityofdeletedandsubstitutedsystemin.an18-aminoacidpolypeptideinducerofplantdefensive[0068]在本发明的一种优选地实施方式中，所述融合蛋白由三个相同和/或不同的PAMP[0069]在本发明的一种优选地实施方式中，所述融合蛋白由四个相同和/或不同的PAMP[0070]在本发明的一种优选地实施方式中，所述融合蛋白由五个相同和/或不同的PAMP[0071]在本发明的一种优选地实施方式中，所述融合蛋白由六个相同和/或不同的PAMP述七个不同的PAMP分子多肽选自flg22、nlp20、elf18、pip1、pep1、csp22、flgII-28、[0074]对于7个不同的PAMP分子多肽的排列顺序和连接子的具体种类不做具体限定，可[0075]融合蛋白通常需要与蛋白标签一起融合表达。蛋白标签是指利用DNA体外重组技[0077]在本发明的一种实施方式中，由7个不同的PAMP分子多肽分别为flg22、nlp20、[0079]在本发明的一种实施方式中，由7个不同的PAMP分子多肽分别为flg22、nlp20、[0080]所述的同一性的功能性同源序列包括但不限于SEQIDNO.15所示的氨基酸具有基酸序列。白的核苷酸序列。SEQIDNO.16所示的核苷酸序列具有至少8[0089]所述的同源序列包括但不限于SEQIDNO.16所示的核苷酸具有约85％或以上、[0093]本发明第四方面提供了导入了上述编码融合蛋白的核苷酸序列，和/或上述载体[0097]进一步，大肠杆菌的菌种包括但不限于BL21(DE3)、λDE3、RosettaTM、K-12、[0108](a)合成所述核苷酸，优选地在合成之前分析和设计拼接成编码融合蛋白的核苷酸序列；[0109](b)将合成的核苷酸序列转化(优选通过载体转化)至微生物或细胞中，并培养所现的至少三个相同和/或不同的PAMP分子多肽，通过基因工程的技术构建了一个新的基因[0113](a)选取七个不同的PAMP分子多肽的核苷酸序列，利用生物信息学软件GeneiousR9结合Swiss-model在线分析和设计拼接成如SEQIDNO.16所示的编码融合蛋白的核苷酸合蛋白的制备方法制备得到的融合蛋白在提高植物抗病性、诱导植物防御反应和/或抵抗[0121]融合蛋白和/或植物免疫诱抗剂可以与植物细胞膜上受体蛋白相互作用，能够快化学农药的使用。[0124](2)本发明提供的融合蛋白的制备成本相较于PAMP分子多肽的制备成本低，作为[0128]图2所示为拟南芥植物在不同浓度融合蛋白His-MP7和PAMP分子多肽flg22处理下[0129]图3所示为拟南芥植物在100nM融合蛋白His-MP7与不同PAMP分子多肽处理下的胼[0132]图6所示为融合蛋白His-MP7增强玉米植物对禾谷镰刀菌的抗性的实验结果；其为融合蛋白His-MP7抑制稻瘟病菌侵染水稻的生长实测对比；b为融合蛋白His-MP7抑制稻[0137]本发明中，术语“PTI免疫机制”，全称病原物相关分子模式触发免疫(PAMP-TriggeredImmunity)机制，指PAMP信号分子与植物细胞受体识别后激活植物免疫反应的[0147](2)使用在线分析平台ExPASy(https://www.exp[0149](4)利用生物信息学软件GeneiousR9软件，在线分析平台Jcat(http://www.jcat.de)设计编码融合蛋白MP7的核苷酸序列，得到如SEQIDNO:16所示的核苷酸序[0151](1)将SEQIDNO:16所示的核苷酸序列克隆到pET-28b(+)表达载体(Novagen)的大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET-28[0154](4)利用BCA法蛋白质浓度测定试剂盒检测，测得融合蛋白His-MP7的浓度为[0162]实验结果如图3所示：100nM融合蛋白His-MP7免疫激活效果优于所有PAMP分子多[0166]实验结果如图4所示：100nM融合蛋白His-MP7能够诱导植物产生活性氧爆发免疫[0167]上述三个实验证明，较低浓度的融合蛋白His-MP7(100nM)即可高效激活植物免[0171](1)取丁香假单胞菌DC3000菌种接入20mLSOC+str(链霉素)液体培养基，28℃过[0173](3)T3天5株每株的两片叶子作为一个样本，同样打孔取小圆片，加入250μL10mMMgCl2每个样品(一个处理30个样品)各取10μL点在同一个SOC+str(链霉素)固体平板上(用方皿，白His-MP7处理的拟南芥的细菌生长指数为4.05，其白His-MP7处理的叶片病斑面积百分比为12.3加融合蛋白His-MP7处理的叶片病斑面积白His-MP7处理的叶片病斑面积百分比为11.6加融合蛋白His-MP7处理的叶片病斑面积2200229716200果达到72.5试验证明了融合蛋白His-MP[0216](1)将获取的编码上述20种三肽融合蛋白的核苷酸序列分别克隆到pEGX-4T-1表4T-1-TP的大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pEGX-4T-1-Tflg22m1-elf18m1-nlp20m2-csp22m1flg22m1-flg22m1-flg22m1-elf18flg22m1-nlp20m2-csp22m1-pip1m1flg22m1-ralf17m1-csp22-ralf17flg22-elf18-nlp20m2-csp22m1flg22m2-flg22m2-flg22m2-pip1m1flg22m2-nlp20m1-csp22-hrp15flg22-flgII-28-csp2flg22-ralf17m1-hrp15-flflg22-fl