CN112955568B 用于改善文库富集的组合物和方法 （Illumina公司）

2021.04.14PCT/US2019/0463962019.08.13WO2020/036991EN2020.02.20US2002102554A1,2002.08.01US2014243232A1,2014.08.28WO2014008447A1,2014.01.09On-TargetNGSReadsUseofHybridizationImprovesTar24-24.21.一种杂交缓冲液，所述杂交缓冲液包括：0.5％至10％硫酸葡聚糖、0.05mg/mL至0.5mg/mL人Cot-1DNA、1％至15％(v/v)甲酰胺、40mM至80mMKH2PO4-述衔接子包括索引区或唯一分子标识符(UMI)中的至少一个以及通用引物序列；并且其中能够结合至所述衔接子的所述索引区和/或所述唯一分子标识符(UMI)的所述封闭剂的区2.一种杂交缓冲液，所述杂交缓冲液包括：0.5％至10％硫酸葡聚糖、0.05mg/mL至0.5mg/mL人Cot-1DNA、1％至15％(v/v)甲酰胺、40mM至80mMKH2PO4-K2HPO4、0.1分子标识符(UMI)中的至少一个以及通用引物序列；并且其中能够结合至所述衔接子的所述衔接子包括索引区或唯一分子标识符(UMI)中的至少一个以及通用引物序列；并且其中所述未连接的寡核苷酸包括不对应于所述衔接子的所述索引区和/或所述唯一分子标识符3.一种制备富集的文库的方法，所述方法包括形将捕获的文库成员从所述捕获装置洗脱到包括富集的文库成员洗脱液的DNA浓度在1.3pM至2507.如权利要求3至6中任一项所述的方法，所富集的文库成员以至少1.1pM的浓度以及最多可达300pM的9.如权利要求8所述的方法，所述方法包括使用直接流动池加载夹具将所述富集的文34接子。衔接子包括通用引物序列、以及索引区(indexregio子标识符(UMI)中的至少一种。未连接的寡核苷酸包括不对应于衔接子的索引区和/或UMI[0008]本披露还描述了包括使用本文所述的封闭剂的方法和包括本文所述的封闭剂的环状核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性的方式与核酸杂交，通常具有脱氧核糖(例如在脱氧核糖核酸(DNA)中发现)或核糖(例如在核糖核酸(RNA)中发5同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列的一部分(例如通用延伸引物结合位点)互可以允许使用与通用序列的一部分(例如通用引物结合位点)互补的通用引物的群体来复通常是指至少一部分核酸分子被复制或拷贝为至少一个另外的核酸分子的任何动作或过6种离子强度改性剂。循环)以获得高浓度的所需感兴趣多核苷酸的扩增片段。所需感兴趣多核苷酸的扩增片段7是例如通过逆转录酶的作用由RNA模板产生的互补或拷贝DNA。该术语仅指分子的一级结接包括在第一核酸分子的末端和第二核酸分子的末端之间形成共价键。在一些实施例中，价键形成从而形成连接的核酸分子的酶。合适的连接酶可以包括但不限于T4DNA连接酶、平台的实例在例如Bentley等人,Nature[自然]456:53-59(2008)；WO04/018497；WO91/列。8接计数扩增后测序的唯一分子标识符(UMI)来校正随后的扩增偏差(amplification的转座酶。标签片段化导致DNA的片段化和衔接子与双链体片段的两条链的5'末端的连接如通过PCR、连接或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法将另外的序列添加至经衔 由…组成”表示包括在该短语之后列出的任何要素，并且可以包括除了那些列出的要素之外的其他要素，条件是那些其他要素不干扰或有助于对于列出要素本披露中指定的活性或动作。[0034]通过端点对数值范围的表述包括该范围内包含的所有数值(例如，1至5包括1、[0035]对于本文披露的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进9[0041]图1A-图1B是示出在富集期间的杂交捕获的示例性实施例和比较的脱靶(off-衔接子的索引区的封闭剂的区域中具有6或8个胸腺嘧啶的Nextera和TruSeq封闭剂的图组分的分裂的Nextera封闭剂的图示。这些构建体不包括对应于衔接子的索引区的任何碱体不包括对应于衔接子的索引区的任何碱基(由对应于索引区的8-或10-碱基缺口表示)。[0044]图4是使用实例2中所述的封闭剂获得的填充读数富集结果(捕获的中靶DNA的量[0045]图5显示了在对应于索引序列的封闭剂序列的部分的第五位置处包含经修饰的G体的图示，其包括(1)具有与索引区的5'25-30-mer区域互补的第一序列和与索引区的3'闭剂或仅与衔接子的一部分结合的封闭剂获得的填充读数富集述的。图7A显示了在杂交缓冲液中使用不同浓度的硫酸葡聚糖获得的填充读数富集结果。图7B显示了使用100μL杂交体积和四个不同的探针组和三种不同的缓冲液条件(IDT杂交缓冲液，Illumina非增强型杂交缓冲液和Illumina增强型杂交缓冲液)获得的填充读数富集iSeq(图7F)(针对NovaSeq和NextSeq为鉴定的读数百分比(percentreadsidentified，8B显示了与使用IDTxGenLockdown试剂盒方案的IDT外显子组小组结果相比，使用实例6中描述的方法在使用具有xGEN封闭剂的增强型杂交缓冲液的九个探针组中获得的填充读富集由HorizonDiscoverHD701定量多重(QM)DNA标[0049]图9A-图9D显示了示例性工作流程的示意图。eBBN表示使用珠结合的转座体复合于杂交捕获的示例性工作流程的示意图。图9C显示了用于无PCR的杂交捕获的示例性工作流程的示意图。图9D显示了用于具有缩短的杂交时间的无PCR的杂交捕获的示例性工作流[0050]图10显示了使用BN001和BN002(未修饰的封闭剂)；BX003和BX007(G-钳修饰的封[0052]本披露描述了包括封闭剂和/或杂交缓冲液的组合物，以及用于在测序之前改善Mamanova等人,Nat.Methods[自然方法]7:111-118(2010))；美国专利公开号2014/链霉亲和素包被的磁珠可用于结合与来自文库的所需DNA靶杂交的生物素化的探针的生物[0056]尽管DNA与探针的杂交可能是非常特异性的，但是不需要的序列仍保留在杂交捕库成员和与探针具有互补性的文库成员(即，中靶(on-target)文库成员)之间不期望的杂[0057]复杂池中的一个DNA片段中存在的重复内源DNA元件(例如Alu序列或长散布核元源于基因组中非常不同的位置的片段在杂交捕获方法的杂交过程中连接。如果这些DNA片获。可以通过向杂交反应的杂交缓冲液中加入过量的重复元件来减少此类脱靶文库成员。[0058]由于各个文库成员中末端衔接子序列之间的相互作用，也可以捕获脱靶(也称为时，封闭剂与衔接子序列的结合防止脱靶文库制备产物中衔接子序列之间的相互作用(包第二衔接子序列形成双链体)。在一些实施例中，第一衔接子序列可以在文库成员的5'末高于由衔接子序列与包括例如衔接子序列的互补序列的背景核酸形成的[0064]在一些实施例中，封闭剂-衔接子复合物表现出比衔接子-衔接子复合物更大的剂-衔接子寡核苷酸双链体的Tm比具有其完全互补序列的衔接子双链体的Tm高最多可达2个、至少50个、至少100个或至少200个文库成员的衔接子序列的缔合速率(associationrate)高于衔接子序列与包括例如衔接子序列的互补序列的背景核酸的缔合速率。在一些个、至少50个、至少100个或至少200个文库成员的衔接子序列的解离速率(dissociationrate)低于衔接子序列与包括例如衔接子序列的互补序列的背景核酸的解离速率。在一些接子序列与其互补序列之间(包括例如双链衔接子的Watson和Crick链之间)形成的双链未修饰的基团的寡核苷酸作为杂交配偶体(hybridizationpartner)的双链核酸，所述修(LNA)；桥接核酸(bridgednucleicacid，也称为双环核酸或BNA)；三环核酸；肽核酸Pharmaceuticals)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的约束的乙基核酸(constrainedethylnucleicacid)或来自生物合成公司(Biosynthesis,Inc.)(德克萨斯州刘易斯维尔)的2'-O,4'-氨基亚乙基桥连核酸(2'-O,4'-aminoethylenebridgednucleicacid)。在一些实O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-#-D-2'-脱氧核糖呋喃糖基]-9-(2-三氟乙酰氨基乙氧基)-酰胺(2'-OMe-Ac-C-CE亚磷酰体DNA而言在严格条件(0.1×SSC)下提供至少约1.4℃的最佳Tm值增加(“最佳增强的Tmm增强的封闭寡核苷酸中的优选的修饰的数目使封闭剂-衔接子Tm增强的封闭寡核苷酸中的优选的修饰的数目使封闭剂-衔接子寡核苷酸双链体的Tm比具有其精确互补序列的衔接子双链体的Tm高最多可达2℃、高最多可达3℃、高最多可达4℃、最多可达30℃。/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences-BN003包括P5'和V2.A14.METS序列的反向互补序列；如表2A所示，BN004包括P7/和V2.B15.METS序列的反向互补序列。开号2014/0031240描述了用于包含索引(美国专利公开号2014/0031240称为“条形码结构个衔接子完美匹配的一系列封闭剂，2)合成具有与衔接子的条形码结构域配对的N-mer结独特的封闭剂用于多重扩增-这种方法的成本域中(例如，与衔接子的索引区和/或UMI结合的封闭剂区域)可包括至少三个胸腺嘧啶碱与衔接子的索引区和/或UMI结合的封闭剂区域)包括与所述衔接子的索引区和/或所述衔Crick碱基对相互作用(例如，脱氧腺苷(A)-脱氧胸苷(T)或脱氧鸟苷(G)-脱氧胞苷(C))中括经修饰的鸟嘌呤或随机核苷酸(如图5中一个实施例所示)提高了封闭剂对文库成员的亲[0099]经修饰的鸟嘌呤可以是以任何合适方式修饰的鸟嘌呤，包括例如LNA修饰的鸟嘌或UMI的碱基)或包括仅部分对应于衔接子的索引区和/或UMI的碱基(例如，包括仅结合衔列。一些实施例中，封闭剂包括表2A的BN023和BN025。在一些实施例中，封闭剂包括表2A的液”定义为在其中可以形成作为杂交捕获测定的一部分的核苷酸-探针杂交体的任何缓冲至少500,000Da的分子量的葡聚糖)和/或低分子量葡聚糖(例如，具有最高可达10,000Da、在额外温度渐变(temperatureramping)步骤情剂而导致的富集特异性的提高在较短的孵育时间[0115]在一些实施例中，在杂交缓冲液中包含拥挤剂使得富集反应可以在较低浓度的DNA下更快地发生(包括例如在较大相对体积的杂交缓冲液中)。这样的增加可以用于促进相应小体积的杂交缓冲液(例如，小于20μL)。实现这种小体积需要在文库制备后进行样品浓缩步骤(结果是整个测定的时间和成本增加)。在杂交缓冲液中包含拥挤剂的情况下，可以在较低DNA浓度和/或探针浓度下(并且在一些实施例中在较大体积中)更快地实现富集反应。在一些实施例中，在杂交缓冲液中包含拥挤剂允许在杂交之前组合多个文库制备样 或更高。mL或至少0.3mg/mL的量包含人Cot-1DNA。在一些实施例中，杂交缓冲液可以以最多可达最多可达80mM磷酸盐。在一些实施例中，含磷酸盐的缓冲液可包括单碱的磷酸二氢盐(monobasicdihydrogenphosphate)和/或二元碱的磷酸单氢盐(dibasicmonohydrogen交缓冲液可优选包含66.6mMKH2P至少0.9M或至少1M的盐。在一些实施例中，杂交缓冲液可包含最多可达0.2M、最多可达Tween80、十二烷基硫酸钠(SDS)等。在一些实施例中，去污剂可占杂交缓冲液的至少0.5mg/mL人Cot-1DNA、1％至15％(v/v)甲酰胺、40mM至80mMKH2PO4-[0130]在一些实施例中，由文库制备产生的样品由标签片段化反应(tagmentation在一些实施例中，由文库制备产生的样品的组合的DNA浓度将在0.1ng/μ例中，杂交混合物(例如，最终杂交反应)中的DNA浓度将为最多可达0.3[0143]在一些实施例中，该方法可以包括使文库与探针保持接触和/或将杂交混合物在包括形成包括探针(包括例如探针:靶杂交体)和[0148]在一些实施例中，该方法可以进一步包括洗涤捕获的探针(捕获的探针可以包括一些实施例中，洗涤缓冲液可包括铁螯合剂，其包括例如去铁胺甲磺酸(deferoxamine[0151]在一些实施例中，该方法可以进一步包括从捕获装置和/或探针洗脱捕获的文库不包括在杂交捕获之后在对文库成员进行测序之前将所捕获的文库成员暴露于扩增条件成员)。对捕获的文库成员测序的方法通常包括在对文库成员进行测序之前扩增文库成员[0159]杂交和杂交捕获过程中捕获的DNA量可能太低而不能通过荧光或分析方法(例如[0160]此外，通常在杂交捕获之后和在测序之前稀释已经使用PCR扩增的样品。例如，[0167]并且其中能够结合至所述衔接子的所述索引区和/或UMI的所述封闭剂的区域包[0170]2.如封闭剂实施例1所述的封闭剂，其中UMI的所述封闭剂的区域包括与所述衔接子的所述索引区和/或所述UMI中的碱基数目一样[0171]3.如封闭剂实施例1所述剂序列的对应于所述索引区和/或UMI的区域中并且其中所述非通用碱基相对于所述索引区的5'末端位于所述封闭剂序列的第三位修饰相对于不包括所述修饰的相同封闭剂增加获低GC区域的DNA或RNA寡核苷酸；交联的寡核苷酸；经修饰的5-甲基脱氧胞苷(5-甲基-[0181]13.如前述封闭剂实施例中[0186]并且其中所述未连接的寡核苷酸包括不对应于所述衔接子的所述索引区和/或所[0187]2.如分裂封闭剂实施例1所述的封闭所述修饰相对于不包括所述修饰的相同封闭剂增加所述封以捕获低GC区域的DNA或RNA寡核苷酸；交联的寡核苷酸；经修饰的5-甲基脱氧胞苷(5-甲[0191]6.如前述分裂封闭剂实施例中任一项所述的封闭剂，其中所述封闭剂在每个碱[0195]10.如前述分裂封闭剂实施例中任一项所[0203]6.如杂交缓冲液实施例5所述的杂交缓冲液，其中所述杂交缓冲液包括至少达0.1mg/mL、最多可达0.2mg/mL、最多可达0.3mg/mL或最多可达0.5mg/mL的量的Cot-1[0207]10.如杂交缓冲液实施例5至9中[0210]13.如杂交缓冲液实施例5至11中任一项所述的杂交缓冲液，其中所述盐包括[0211]14.如前述杂交缓冲液实施例中任[0212]15.如杂交缓冲液实施例14所述的杂交缓冲液，其中所述杂交缓冲液包括至少[0213]16.如杂交缓冲液实施例14或15所述[0214]17.如杂交缓冲液实施例14至1[0215]18.如前述杂交缓冲液实施例中任一项[0216]19.如杂交缓冲液实施例18所述的杂交缓冲液，其中所述杂交缓冲液包括至少[0217]20.如杂交缓冲液实施例18或19所述[0218]21.如杂交缓冲液实施例18至[0219]22.如前述杂交缓冲液实施例中任一[0226]23.如前述杂交缓冲液实施例中任[0234]24.如前述杂交缓冲液实施例中任[0235]25.如杂交缓冲液实施例24所述的杂交缓冲液，其中所述封闭剂包括Tm增强的寡[0236]26.如杂交缓冲液实施例24或25所述[0237]27.如杂交缓冲液实施例26所述的杂交缓冲液，其中增加所述封闭剂的Tm的多个[0238]28.如前述杂交缓冲液实施例中任一[0241]并且其中能够结合至所述衔接子的所述索引区和/或UMI的所述封闭剂的区域包[0244]29.如前述杂交缓冲液实施例中任一[0247]并且其中所述未连接的寡核苷酸包括不对应于所述衔接子的所述索引区和/或所[0248]30.如杂交缓冲液实施例28或29所述[0253]4.如前述缓冲液方法实施例中任一项所述的方法，其中所述拥挤剂以最多可达[0254]5.如前述缓冲液方法实施例中任一项所述的方法，其中所述杂交缓冲液包括人[0256]7.如缓冲液方法实施例5或6所述的方法，其中所述杂交缓冲液包括最多可达0.1mg/mL、最多可达0.2mg/mL、最多可达0.3mg/mL或最多可达0.5mg/mL的量的人Cot-1[0259]10.如缓冲液方法实施例5至9[0263]14.如前述缓冲液方法实施例中任[0265]16.如缓冲液方法实施例14或15所[0266]17.如缓冲液方法实施例14至16中任一项所述的方法，其中所述磷酸盐包括[0267]18.如前述缓冲液方法实施例中任一项[0268]19.如缓冲液方法实施例17所述的方法，其中所述杂交缓冲液包括至少0.001%[0269]20.如缓冲液方法实施例18或19所[0270]21.如缓冲液方法实施例18至2[0285]24.如前述缓冲液方法实施[0286]25.如缓冲液方法实施例24所述的方法，其中所述封闭剂以至少0.001mM、至少[0288]27.如前述缓冲液方法实施例中任Cot-1DNA和封闭剂的第一组合物和包括甲酰胺和硫酸葡聚糖的第二组合物形成杂交缓冲[0289]28.如前述缓冲液方法实施例中任一项所述[0290]29.如缓冲液方法实施例28所述的方法[0293]32.如缓冲液方法实施例29至31中任一项所述的方法，其中将至少10ng、至少[0295]34.如缓冲液方法实施例29至33[0296]35.如缓冲液方法实施例29至34中[0298]37.如缓冲液方法实施例29至36中[0300]39.如缓冲液方法实施例29至38中任一项[0303]42.如缓冲液方法实施例39至41中任一[0304]43.如缓冲液方法实施例39至42中[0305]44.如缓冲液方法实施例39至43[0306]45.如缓冲液方法实施例37至44中[0307]46.如缓冲液方法实施例37至45中[0308]47.如缓冲液方法实施例39至46或至少70℃。[0309]48.如缓冲液方法实施例39至47中任一可达70℃。[0310]49.如缓冲液方法实施例39至48中[0311]50.如缓冲液方法实施例39至49[0312]51.如缓冲液方法实施例37至5[0313]52.如缓冲液方法实施例51所[0314]53.如缓冲液方法实施例37至52[0315]54.如缓冲液方法实施例53所述的[0316]55.如缓冲液方法实施例53或54所[0317]56.如缓冲液方法实施例53至55[0318]57.如缓冲液方法实施例53至5[0319]58.如缓冲液方法实施例53至57中任一项[0320]59.如缓冲液方法实施例53至58中任一[0321]60.如缓冲液方法实施例53至59中任[0326]65.如缓冲液方法实施例60至64中任一项所述的方法，其中洗脱液的DNA浓度在[0327]66.如缓冲液方法实施例37至65中任[0328]67.如缓冲液方法实施例66所述的[0329]68.如缓冲液方法实施例66所述[0330]69.如缓冲液方法实施例24至68中任一项所述的方法，其中所述封闭剂包括Tm增[0331]70.如缓冲液方法实施例24至69中[0332]71.如缓冲液方法实施例70所述的方法，其中增加所述封闭剂的Tm的多个修饰包括交联的寡核苷酸；经修饰的5-甲基脱氧胞苷(5-甲基-dc)；2,6-二氨基嘌呤；锁核酸[0333]72.如缓冲液方法实施例24至71中任一项所[0335]并且其中能够结合至所述衔接子的所述索引区和/或UMI的所述封闭剂的区域包[0338]73.如缓冲液方法实施例24至72中[0340]并且其中所述未连接的寡核苷酸包括不对应于所述衔接子的所述索引区和/或所[0353]9.如捕获方法实施例4或7所述的方法，所述方法包括将所述文库成员以至少[0356]12.如前述捕获方法实施例中任一项[0364]14.如前述捕获方法实施例中任一项所述的方法，其中所述封闭剂包括Tm增强的[0365]15.如前述捕获方法实施例中任一[0366]16.如捕获方法实施例15所述的方法，其中增加所述封闭剂的Tm的多个修饰包括[0369]并且其中能够结合至所述衔接子的所述索引区和/或UMI的所述封闭剂的区域包[0372]18.如前述捕获方法实施例中任一项[0374]并且其中所述未连接的寡核苷酸包含不对应于所述衔接子的所述索引区和/或所[0384]条目7.如条目6所述的方法，[0387]条目10.如条目6至9中任一项所述的[0388]条目11.如条目10所述的方法，合，其中所述衔接子包括通用引物序列、以及索引区或唯一分子标识符(UMI)中的至少一子标识符(UMI)中的至少一个；并且其中所述未连接的寡核苷酸包括不对应于所述衔接子饰相对于不包含所述修饰的相同封闭剂增加所[0393]条目16.如条目12至15中任一项所述的获低GC区域的DNA或RNA寡核苷酸；交联的寡核苷酸；经修饰的5-甲基脱氧胞苷(5-甲基-最多可达250pM或最多可达300pM的浓度加[0398]条目21.如条目17至20中任一项所述的方法，其中所述杂交缓冲液包括0.5％至[0399]条目22.如条目17至21中任一项所述[0405]非增强型杂交缓冲液在100μL杂交反应中包含以下组分/最终浓度：人Cot-1[0406]增强型杂交缓冲液在100μL杂交反应中包含以下组分/最终浓度：硫酸葡聚糖[0407]在每种情况下，100μL最终反应还含有：浓度为125pM/探针(总探针浓度为至少州圣地亚哥)进行15分钟的捕获靶向DNA。然后使用洗涤缓冲液EEW(增强型富集洗涤缓冲司，加利福尼亚州圣地亚哥)扩增，并使用0.9x固相载体可逆固定化(SolidPhase[0412]该实例描述了在对应于索引和/或UMI的封闭剂的区域中包含胸腺嘧啶的封闭剂交和捕获。对所得的所捕获的DNA进行测序，并使用Enrichmentv3.0BASESPACEApp(Illumina公司，加利福尼亚州圣地亚哥)来计算填充读数富集(PaddedRead[0414]在索引序列位置包括一段T的封闭剂在不对应于索引的封闭剂的区域中需要至少[0415]具有与索引区互补的序列的寡核苷酸需要较少的经修饰核苷酸(测试了8个核苷目的修饰(8个或10个核苷酸)的情况下，具有与索引区互补的序列的封闭剂(最后一个柱)[0419]在增强型杂交缓冲液中使用0.2mM的[0420]不希望被理论所束缚，据信在对应于索引区的封闭剂序列的每第三个碱基处(例个实施例所示，或在对应于索引区的封闭剂序列的第二和/或第四位置处)包含经修饰的G(BN025)和TiLNAS2(BN026)各自包含10个LNA修饰的碱基。TiLNA17(BN027)和TiLNA18(BN028)在对应于索引区的封闭剂的区域中包括通用碱基(脱氧肌苷)，但包括对应于衔接[0424]对所得的捕获的DNA进行测序，并使用Enrichmentv3.0BaseSpaceApp(BN025)和TiLNAS2(BN026)；样品“外部(Outer)”含有表5中的P5LNA(BN023)和P7LNA(BN024)；样品Short8nt包含表5中的TiLNA17(BN027)和TiLNA18(BN028)。包括BN023、示的硫酸葡聚糖浓度的增强型杂交缓冲液进行如实例1中所描述的杂交和捕获。对所得的[0428]使用四个不同探针组评估使用100μL杂交缓冲液体积的富集：编码外显子组寡核有硫酸葡聚糖的杂交缓冲液。结果示于图7B中[0430]将3轮12重文库输入按体积合并至总计30μL，并使用具有IDTxGen封闭剂的强型衔接子封闭剂(表2中的Nextera封闭剂1i5(BN001)和Nextera封闭剂2i7(BN002))的非增强型杂交缓冲液；(3)小(11μL)反应体积(TiE3)的具有增强型衔接子封闭剂(xGen封闭剂)的非增强型杂交缓冲液；(4)大(100μL)反应体积(TiE4)的具有增强型衔接子封闭剂以及在使用增强型杂交缓冲液的Illumina富集测定法中，在九个探针组中评估富集性能中实现高填充读数富集。探针组包括：(1)xGen外显子组研究组(IDT外显子组)(目录号Expanded(Illumina公司，圣地亚哥，目录号FC-141-2007；探针目录号20015656)；(6)1010；探针目录号15069654)；(8)TruSightRNA融合组(TruSightRNAFusionPanel，(OncologyDNAProbesMasterPool，Illumina公司，目录号OP-101-1004；探针目录号20001565)。结果示于图8B中。白色柱(第1列)显示了在具有Nextera快速捕获文库制备(Illumina公司，加利福尼亚州圣地亚哥)的IDTlockdown富集工作流程中IDT外显子组小富集测定法情况下的各组性能。黑色水平线显示在使用Twist富集测定法(Twist或TruSightTumor170工作流程(在OPD1组情况下)(第10列)的对应组的情况下获得的比[0434]对12-基因，535-探针组使用增强型杂交缓冲液和xGen封闭剂通过单杂交富集方案以富集从HorizonDiscoverHD701定量多重(QM)DNA(HorizonDiscoverHD701quantitativemultiplex(QM)DNA)标准产生的文库来检测体细胞变体。图8C中呈现的数据示出了预期的变体频率(x轴)相比于所调用的变体频率(calledvariant尔维尔，爱荷华州)进行杂交。使用TruSeq衔接子连接方法制备靶向DNA，并使用100μL[0440]3.(可选地)将变性的PhiXContr[0442]使用移液器或使用流动池加载夹具将所得样品(在55μL1xHT1缓冲液中)直接加PCR富集方法的测序产量提高至约140x，远大于约40x目标。将无PCR数据下采样(down[0443]实例7B-使用基于珠的Nextera文库的无PCR杂交捕获提高来自短杂交时间的外显[0444]使用与实例7A中相似的条件进行对照实验，但使用利用基于珠的标签片段化小时，参见IDTxGen方案)以及使用NextSeq仪器进行测序而不进行直接流动池加载)作为PCR重复也会降低文库的多样性并且相应的约20x的覆盖度。当从30分钟工作流程中去除域中包括胸腺嘧啶并且在对应于衔接子的非索引区的封闭剂的区域中包括与衔接子互补的碱基；封闭剂BN001和BN002不包含经修饰的碱基，并且包含3'-ddC末端基团。封闭剂于衔接子的非索引区的BN001的区域的修饰形式并包括LNA修饰的碱基；封闭剂还包括3'-间隔物C3而不是3'-ddC。封闭剂BN024和BN026是对应于衔接子的非索引区的BN002的区域[0449]对所得捕获的DNA进行测序，并计算填充读数富集(捕获的中靶DNA的量的量度和RefSeq中的注释编码区的翻译)的完整披露内容通过引用并入本文。在本申请的披露与通过引用并入本文的任何文件的披露之间存在任何不一致的情况下，以本申请的披露为[0004]SLATTER,AndrewF.,等人[0035]caagcagaaga[0048]aatgatacggcgacca[0135]aatgatacggcgaccaccga[0148]gatcggaagagcacacgtct[0174]gatcggaagagcacacgtctgaactccagt[0309]gctgtctcttatacacatc[0318]gctgtctcttatacacatctccgagcccac[0405]caagcagaagacgg[0430]caagcagaagacgg[0464]caagcagaagacgg[0489]caagcagaagacgg[0765]aatgatacggcgacca[0836]aatgataggcgaccaccgag[0845]aatgataggcgaccac[0854]aatgatacggcg