番茄SlBMP1基因促进花前枝及抗旱的功能分析

[25]，同样有较大概率与SlBMP1基因互作。3.6荧光素酶互补实验（LCA）分析3.6.1载体构建用第二章内提到的引物扩增番茄cDNA，获得目的片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果正确后连接目的基因与对应载体，经大肠杆菌转化后送菌液测序。测序结果正确，如图3.11、图3.12：图3.11SlBMP1目的片段连接C-LUC载体测序结果Fig3.11SequencingresultsofSlBMP1targetfragmentligatedwithC-LUCvector1000bp1314bp1000bp1314bp图3.12SlMYB16目的片段连接N-LUC载体测序结果Fig3.12SequencingresultsofSlMYB16targetfragmentligatedtoN-LUCvector3.6.2荧光结果使用荧光显微镜，选取注射区域的烟草背面表皮层细胞进行荧光观察，结果显示SlBMP1基因与SlMYB16互作。图3.13荧光结果Fig3.13Fluorescenceresults3.7番茄SlBMP1基因花前枝表型观察结果在西南大学网室种植野生型AC番茄、番茄SlBMP1超表达与敲除株系的T1代，发现超表达株系的花序从生殖生长转化为营养生长，此种现象被称为花前枝。即花序新长出来的营养枝，依然会进行花芽分化。花前枝的比例增加，会造成开花数量减少，果实产量降低，严重影响番茄的品质与产量。SlBMP1基因超表达T2代株系依旧稳定的出现花前枝表型，而敲除株系中并未出现相关性状。实验结果说明SlBMP1基因与花前枝现象相关。

图3.14T1代转基因番茄中花前枝现象（从左至右依次为：野生型植株花序、超表达植株OE-11花序、超表达植株OE-14花序）Fig.3.14FloweringforeshootphenomenoninT1generationtransgenictomato(fromlefttoright:wild-typeinflorescence,over-expressionplantOE-11inflorescence,over-expressionplantOE-14inflorescence)图3.15T2代转基因番茄中花前枝现象（从左至右依次为：野生型植株花序、超表达植株OE-14花序、敲除植株C9-1花序）Fig.3.15FloweringforeshootphenomenoninT2generationtransgenictomato(fromlefttoright:wild-typeinflorescence,over-expressionOE-14inflorescence,knockoutplantC9-1inflorescence)

第4章讨论本研究已经对番茄中含有BTB结构域的基因家族成员进行了生物信息学分析，而后利用反向遗传学策略，通过CRISPR-Cas9技术靶向沉默番茄中候选基因SlBMP1，获得了稳定的突变体，同时构建基因超表达载体，正反同时研究基因功能，系统分析了该基因在干旱胁迫响应中的功能。与正向遗传学相比，反向遗传学的优势在于能够直接关联特定基因与表型。截至目前，在种类繁多的植物基因世界里，拥有BTB结构域且功能得以确认的基因数量十分有限。已被鉴定的这些基因，多数都在植物应对逆境过程中发挥作用。例如，RPT2/NPH3在拟南芥向光性反应里承担关键角色；甘薯和拟南芥中，NPR1分别参与抗病进程；水稻中的OsBTB同样在抗病方面贡献力量。然而，值得关注的是，在番茄的基因研究领域，BTB-MATH类基因始终未曾见诸报道，仍是一片等待探索的未知区域。研究番茄BTB-MATH基因SlBMP1意义重大。而以往对拟南芥中BMP基因的研究也证实其与开花时间相关，BMP基因通过与成花关键转录因子的结合或者介导其泛素化降解达到调控成花情况的作用。本研究将该基因转化到番茄中，结果显示其与干旱胁迫相关，对干旱胁迫呈负向调节作用。通过对实验数据的分析，SlBMP1基因超表达株系在非生物胁迫（干旱）表达出较低的耐受性，而敲除株系表现良好；正常培养下，超量株系依然出现了受干旱胁迫所产生的花前枝表型，而敲除株系并未出现；干旱处理下，超量表达和敲除植株均出现花前枝表型，但敲除株系中的花前枝表型程度较轻，且出现花前枝表型的株系的花序生长势较轻。干旱胁迫下，植株根系将吸收更多的氮素从而促进根系的生长以抵抗干旱胁迫，但对氮素的吸收将阻碍植物根系对硼元素的吸收。硼是植物花芽分化的重要元素，硼元素输送不到顶芽或花序，会引致叶片、叶柄生长素增多，刺激细胞旺盛分裂，导致顶芽生长停滞，在花序前端就会长出叶片或枝条。由于植株不能得到充足的硼元素，叶片同化作用产生的光合产物也就不能正常地输送到植株的各部位，就会在叶柄的周围形成不定芽，在生产实践中影响番茄的花序生长、结果数量及果实大小。从产品形成的角度分析，超表达株系营养生长的缓慢将不利于植株进行光合作用，无法为植株生殖生长提供充足的物质基础，且超表达株系出现花前枝现象，在果实形成期，侧枝继续营养生长将影响果实的质量形成，且花序转变为叶序将减少果实数量，严重影响果实的经济性状。本研究已获得稳定的敲除株系，研究结果应用于实际可以为田间生产降低番茄的花前枝、提高番茄的产量奠定理论基础，也可作为今后番茄及茄科植物农艺性状遗传改良和抗逆性研究的参考。未来研究可结合多组学数据（如代谢组、表观组）拓展基因功能解析，并通过田间试验评估这些基因在复杂环境下的调控效应。

第5章结论与展望在对SlBMP1基因的深入研究中，我们借助生物信息学手段分析发现，该基因的整体长度为1227bp，能够编码出由408个氨基酸组成的产物。通过亚细胞定位预测可知，它主要定位于细胞核。在野生型番茄AC的各个组织，像根、茎、叶、花、果中，都能检测到SlBMP1基因的表达。不过，其表达量在不同组织中有明显差异，在根、果实和花中的表达量处于较高水平，由此推测该基因或许参与到了番茄生长发育的调控过程当中。在本研究里，我们成功地对SlBMP1基因进行了克隆操作。在此基础上，构建了超表达载体和敲除载体，并利用这些载体对番茄进行遗传转化，最终成功获得了转基因植株。非特异性突变鉴定显示本研究成功获得八个超表达株系以及三个以上不同的转基因突变类型。甘露醇模拟干旱处理的实验结果说明SlBMP1基因是抗旱的负调控因子。双荧光素酶蛋白互作实验说明SlBMP1基因与SlMYB16基因存在互作关系。从T1代到T2代的花前枝现象出现情况说明SlBMP1基因的超量表达将促进花前枝表型的形成，而敲除株系减少出现或是不出现花前枝表型。结合前期对互作蛋白的筛选，后续可以进行SlCUL3与SlBMP1基因的互作分析，结合顺式作用元件以及基因家族探究其调控网络。未来研究可结合多组学数据（如代谢组、表观组）拓展基因功能解析，并通过田间试验评估这些基因在复杂环境下的调控效应。番茄作为一种多侧枝的植物，清理侧枝及花前枝极为耗费人力物力，进一步厘清成花相关基因SlBMP1的作用机理及调控网络，应用于番茄育种产业，将促进我国番茄种业发展。

参考文献:中国报告大厅．2024年番茄行业现状分析：全球番茄产量将增长至4700万公吨[R]．2024柏成寿，陆帼一．水分胁迫对番茄幼苗生长影响的研究[J]．园艺学报，1991，（04）：340-344．李金华，王亚玲，潘宇，等．番茄抗旱基因工程研究进展[J]．中国蔬菜菜，2017，（12）：1000-6346．2017．12．004．王海波．海水淡化用pH及电导率在线检测系统研究[D]．杭州电子科技大学，2011．JinhuaLi.,XiaoxingSu.,YinleiWang.,WeiYang.,YuPan.,ChenggangSu.,XingguoZhang.Genome-wideidentificationandexpressionanalysisoftheBTBdomain-containingproteingenefamilyintomato[J].Genes&Genomics,1:1-15,2018.刘鹏飞，张康，李玉琦，等．玉米BTB家族基因的鉴定与表达规律分析[J].植物病理学报,2021，51（02）：268-281．000360．蔚婷．CmBTB4与CmBTB32基因在甜瓜发育中功能的初步分析[D]．内蒙古大学，2023．000136．贺玉梅．辣椒BTB蛋白家族基因鉴定及相关基因响应疫霉菌侵染和非生物胁迫的功能研究[D]．西北农林科技大学，2020．001166．JinHongshi.,ChoiSun-Mee.,KangMin-Jeong.,YunSe-Hun.,KwonDong-Jin.NohYoo-Sun.Salicylicacid-inducedtranscriptionalreprogrammingbytheHAC-NPR1-TGAhistoneacetyltransferasecomplexinArabidopsis.[J];NohBosl.Nucleicacidsresearch.2018AnJian-Ping.,LiRui.,QuFeng-Jia.,YouChun-Xiang.,WangXiao-Fei.,HaoYu-Jin.R2R3-MYBtranscriptionfactorMdMYB23isinvolvedinthecoldtoleranceandproanthocyanidinaccumulationinapple.[J].ThePlantjournal:forcellandmolecularbiology.2018ChahtaneHicham.,ZhangBo.,NorbergMikael.,LeMassonMarie.,ThévenonEmmanuel.,BakóLászló.,BenllochReyes.,HolmlundMattias.,ParcyFrançois.,NilssonOve.,VachonGilles.LEAFYactivityispost-transcriptionallyregulatedbyBLADEONPETIOLE2andCULLIN3inArabidopsis.[J].TheNewphytologist.2018刘婧仪，梁燕，秦蕾，等．番茄花发育分子生物学研究进展[J]．农业生物技术学报，2014，22（03）：351-361．Quinet,M.,Dubois,C.,Goffin,M.-C.;,Chao,J.,Dielen,V.,Batoko,H.,Boutry,M.,Kinet,J.-M.Characterizationoftomato(SolanumlycopersicumL.)mutantsaffectedintheirfloweringtimeandinthemorphogenesisoftheirreproductivestructure.[J].Exp.Bot.2006,57,1381–1390.Mero,C.E.,Honma,S.Inheritanceofaunifloramutantinthetomato.[J].Hered.1982,73,64–68.Lippman,Z.B.,Cohen,O.,Alvarez,J.P.;,Abu-Abied,M.;,Pekker,I.,Paran,I.,Eshed,Y.,Zamir,D.TheMakingofaCompoundInflorescenceinTomatoandRelatedNightshades.[J].PLoSBiol.2008,6,e288.刘洪刚．辽宁地区早春干旱应防止果树缺硼[J]．果树实用技术与信息，2016，（06）：18-19．番茄生长出现花前枝和花前叶．沂州市农业农村局．中华人民共和国农业农村部．Zollman,S.,

Godt,D.,

Prive,G.G.,

Couderc,J.L.,&

Laski,F.A.

(1994).

TheBTBdomain,foundprimarilyinzincfingerproteins,definesanevolutionarilyconservedfamilythatincludesseveraldevelopmentallyregulatedgenesinDrosophila[J].

PNAS,

91,

10717–10721.陈雪婷．番茄转录因子SlWRKY16和SlBBX5的抗旱功能和分子机理解析[D]．西南大学,2022．005072．E.Lechner.,N.Leonhardt.,H.Eisler.,Y.Parmentier.,M.Alioua.,H.Jacquet.,J.Leung.,P.Genschik.MATH/BTBCRL3ReceptorsTargettheHomeodomain-LeucineZipperATHB6toModulateAbscisicAcidSignaling,Developmental[J].DevelopmentalCell,2011,21(6):1116-1128.LiyuanChen.,JooHyunLee.,HenrietteWeber.,TakayukiTohge.,SandraWitt.,SanjaRoje.,AlisdairR.Fernie,HanjoHellmann.ArabidopsisBPMProteinsFunctionasSubstrateAdaptorstoaCULLIN3-BasedE3LigasetoAffectFattyAcidMetabolisminPlants[J].ThePlantCell,2013(6),2253–2264MorimotoK.,OhamaN.,KidokoroS.,MizoiJ.,TakahashiF.,TodakaD.,MogamiJ.,SatoH.,QinF.,KimJS.,FukaoY.,FujiwaraM.,ShinozakiK.,Yamaguchi-ShinozakiK.BPM-