专题一基因工程专家讲座

基因工程是指按照人们意愿，进行严格设计，并经过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新遗传特征，从而创造出更符合人们需要新生物类型和生物产品。因为基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工，所以又叫做DNA重组技术。专题一基因工程第1页一、DNA重组技术基本工具（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1.分布：2.特点：

特异性，即能够识别双链DNA分子某种特定核苷酸序列，而且切割每一条链中特定部位两个核苷酸之间磷酸二酯键，使之断开。主要从原核生物中分离纯化出来第2页GAA

TTCCTT

AAGGCTTAAGAATTCCCC

GGGGGG

CCCCCCGGGGGGCCC︰︰︰︰︰中轴线︰︰︰︰↓↑EcoRⅠ（在G与A之间切割）SmaⅠ（在G与C之间切割）粘性末端平末端切割DNA分子产生两种不一样末端（箭头表示酶切割位点）↓↑3.结果：在识别序列中轴线两侧切割，产生粘性末端；在识别序列中轴线处切割，产生平末端。第3页GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG（二）DNA连接酶——“分子缝合针”第4页GCTTAAAATTCG（二）DNA连接酶——“分子缝合针”第5页（二）DNA连接酶——“分子缝合针”2.连接酶部位：磷酸二酯键，不是氢键GCTTAAAATTCG磷酸二酯键磷酸二酯键1.连接酶作用：将互补配正确两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整DNA分子第6页3.连接酶类型（按起源分类）(1)E.coliDNA连接酶：(起源于大肠杆菌)只能连接双链DNA片段互补粘性末端(2)T4

DNA连接酶：（起源于T4噬菌体）既能够连接双链DNA片段互补粘性末端，又能够“缝合”双链DNA片段平末端第7页（三）基因进入受体细胞载体——“分子运输车”1.作用：2.条件：

能在宿主细胞内复制并稳定地保留；含有多个限制酶切位点,便于目标基因插入；含有标识基因，便于筛选；必需是安全，对宿主细胞无害。

将外源基因送入受体细胞第8页3.种类：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒质粒细菌拟核DNA之外能自主复制小型双链环状DNA分子；DNA分子上含有多个限制酶切割位点；能在宿主细胞中进行自我复制；DNA分子上含有特殊标识基因；对宿主细胞无影响。第9页二、基因工程基本操作程序获取目标基因构建表示载体导入受体细胞目标基因检测与判定第一步第二步第三步第四步第10页（一）目标基因获取1.从基因文库中获取目标基因（1）基因组文库

将含有某种生物不一样基因许多片段，导入受体菌群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不一样基因，称为基因文库。

受体菌包含了某种生物全部基因，该受体菌群体称为这种生物基因组文库。（2）部分基因文库

受体菌包含了一个生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物部分基因文库，如cDNA文库。第11页（3）基因文库构建基因组文库构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不一样DNA片段）cDNA文库构建——mRNA反转录形成mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库第12页2.利用PCR技术扩增目标基因(1)原理

PCR是聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）,它是利用DNA双链复制原理，将基因核苷酸序列不停加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。第13页第14页2.过程高温变性(DNA解旋)（90~95℃）低温退火(引物结合)（55~60℃）中温延伸(互补链合成)（70~75℃）

双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA，所以整个过程不需要解旋酶。屡次重复3.特点：指数形式扩增第15页推测推测合成3.经过DNA合成仪直接合成目标基因DNA合成仪蛋白质氨基酸次序mRAN核苷酸序列基因DNA核苷酸序列目标基因

当基因比较小、蛋白质氨基酸序列能够测得或核苷酸序列已知时，可采取此种方法。第16页（二）基因表示载体构建

用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目标基因插入切口处，让目标基因黏性末端与切口上黏性末端互补配对后，在连接酶作用下连接形成重组DNA分子，即基因表示载体。第17页质粒目标基因限制酶DNA连接酶重组DNA（二）基因表示载体构建第18页1.构建目标

使目标基因在受体细胞中稳定存在，而且可遗传给下一代，同时，使目标基因能够表示和发挥作用。2.构建零件及其作用（1）目标基因（2）开启子

RNA聚合酶识别和结合一段特殊结构DNA片段，位于基因首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而取得需要蛋白质。（二）基因表示载体构建第19页（3）终止子

一段特殊结构DNA片段，位于基因尾端，作用是使转录在所需要地方停顿。（4）标识基因

判别受体细胞中是否含有目标基因，从而将含有目标基因细胞筛选出来。（二）基因表示载体构建2.构建零件及其作用(5)

复制原点第20页（三）将目标基因导入受体细胞

将目标基因导入受体细胞而且在受体细胞内维持稳定和表示过程称为转化。

基因工程中惯用受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。

导入受体细胞方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞路径，且因受体细胞不一样而不一样。第21页（1）农杆菌转化法1.导入植物细胞（2）其它方法

基因枪法花粉管通道法第22页移植显微注射分裂分化发育2.导入动物细胞(显微注射技术)含目标基因表示载体动物受精卵含目标基因受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物第23页3.导入微生物细胞(2)优点

繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。(3)惯用受体细胞

大肠杆菌（E.coli）(1)过程

制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接收外源DNA分子。

重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。(Ca2+

处理法)第24页（四）目标基因检测与判定

目标基因是否真正插入受体细胞DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表示，只有经过检测、判定才能得知。

惯用检测伎俩主要从分子水平和个体水平进行。第25页适当限制酶切割用同位素标识目标基因片段杂交1.分子水平（1）检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目标基因提取受体生物全部DNA许多DNA片段显出杂交带（表明目标基因已插入）（分子杂交技术）第26页第27页(2)检测目标基因是否转录出了mRNA提取受体生物mRNA用同位素标识目标基因片段杂交显出杂交带（表明目标基因已转录出了mRNA）

检测DNA利用是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用是DNA与mRNA杂交。1.分子水平（分子杂交技术）第28页（3）检测目标基因是否翻译出蛋白质（抗原—抗体杂交技术）提取受体生物蛋白质与对应抗体杂交显出杂交带（表明目标基因已形成蛋白质产品）1.分子水平（分子杂交技术）第29页2.个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目标基因或摄入目标基因未表示。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表示。第30页1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人蛋白质。以下叙述不正确是（）

A.惯用相同限制性内切酶处理目标基因和质粒

B.导入大肠杆菌目标基因不一定能成功表示

C.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需工具酶

D.可用含抗生素培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒C2.以下关于基因工程中限制性内切酶描述，错误是（

）

A.一个限制性内切酶只能识别一个特定脱氧核苷酸序列

B.限制性内切酶活性受温度影响

C.限制性内切酶能识别和切割RNA

D.限制性内切酶可从原核生物中提取C第31页含重组质粒土壤农杆菌抗虫基因含kan质粒重组质粒A构建土壤农杆菌导入B培养选择侵染转基因抗虫植株离体棉花叶片组织愈伤组织C诱导选择再生植株分化D检测3.在培育转基因植物研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标识基因，只有含卡那霉素抗性基因细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下列图为取得抗虫棉技术流程。请据图回答：（1）A过程需要酶有_____________________________________。（2）B过程及其结果表达了质粒作为运载体必须具备两个条件是

__________________________________________________。（3）C过程培养基除含有必要营养物质、