基于miR-155-5p调控PI3K-AKT通路探究芪黄健脾滋肾颗粒对原发性干燥综合征Th17-Treg免疫失衡的影响

基于miR-155-5p调控PI3K-AKT通路探究芪黄健脾滋肾颗粒对原发性干燥综合征Th17-Treg免疫失衡的影响关键词：原发性干燥综合征；miR-155-5p；PI3K/AKT通路；芪黄健脾滋肾颗粒；免疫失衡1引言原发性干燥综合征（PSS）是一种以眼、口、鼻等外分泌腺体受损为主要特征的自身免疫性疾病。患者常伴有干燥性角膜结膜炎、口腔干燥、眼干等症状，严重时可导致视力损害。目前，尽管尚无根治方法，但针对PSS的治疗旨在缓解症状、减少并发症的发生，并提高患者的生活质量。miRNA是一类小分子非编码RNA，通过调控基因表达来参与多种生物学过程。近年来，越来越多的研究表明miRNA在调节免疫反应中发挥着重要作用。例如，miR-155-5p已被证实在调节T细胞分化和功能中发挥关键作用，尤其是在Th17细胞的发育中。本研究旨在探讨miR-155-5p如何通过调控PI3K/AKT信号通路影响原发性干燥综合征患者的免疫状态，特别是Th17/Treg细胞的平衡。此外，本研究还将评估芪黄健脾滋肾颗粒在改善PSS患者免疫失衡方面的潜在效果。2文献综述2.1原发性干燥综合征概述原发性干燥综合征（PSS）是一种常见的自身免疫性疾病，主要影响唾液腺和泪腺。该病的确切病因尚不清楚，但遗传、环境因素以及免疫系统异常可能共同作用。PSS的主要临床表现包括眼干、口干、关节痛和疲劳等。由于PSS的复杂性和多样性，诊断通常依赖于临床症状、实验室检查和组织活检。2.2miRNA与免疫调节miRNA是一类小的非编码RNA分子，它们通过与目标mRNA的3'端非编码区互补配对，从而抑制或促进蛋白质的翻译。近年来的研究揭示了miRNA在调节免疫反应中的重要作用，特别是在T细胞分化和功能中。例如，miR-155-5p已被证实在调节T细胞分化和功能中发挥关键作用，尤其是在Th17细胞的发育中。2.3PI3K/AKT信号通路PI3K/AKT信号通路是一条关键的细胞内信号传导途径，参与调控细胞增殖、存活、迁移和分化等多种生物学过程。在免疫调节中，PI3K/AKT信号通路被证明可以影响T细胞的活化和功能，包括调节Th17和Treg细胞的平衡。2.4芪黄健脾滋肾颗粒芪黄健脾滋肾颗粒是一种中药复方制剂，主要成分包括黄芪、黄芩、山药等。该方剂被广泛用于治疗脾虚湿阻、气阴两虚等证型的疾病。近年来，一些研究表明芪黄健脾滋肾颗粒具有抗炎、抗氧化和免疫调节等作用，但其具体机制尚不完全清楚。2.5研究现状与展望目前，关于miRNA在PSS发病机制中的作用已有一些研究报道，但关于miR-155-5p如何通过调控PI3K/AKT信号通路影响PSS患者免疫状态的研究相对较少。此外，关于芪黄健脾滋肾颗粒在PSS治疗中的具体作用和机制仍需进一步探索。因此，本研究旨在填补这一空白，为PSS的治疗提供新的思路和证据。3材料与方法3.1实验材料3.1.1实验动物本研究选用健康成年雄性C57BL/6小鼠，体重约20±2g，购自中国医学科学院实验动物研究所。所有动物均饲养于SPF级条件下，室温控制在20-25℃，相对湿度保持在50-60%。3.1.2实验药物芪黄健脾滋肾颗粒由黄芪、黄芩、山药等中药材组成，由北京同仁堂股份有限公司提供，按照传统配方比例研磨成粉，制成颗粒剂。实验前将颗粒剂用蒸馏水配制成所需浓度。3.1.3主要试剂使用的主要试剂包括Trizol总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、Westernblot试剂盒等，均购自上海生工生物工程有限公司。3.1.4主要仪器实验中使用的主要仪器包括低温离心机(EppendorfCentrifuge5810R)、恒温培养箱(ThermoForma3111)、荧光定量PCR仪(Bio-RadCFX96)、电泳仪(Bio-RadMini-ProteinII)、凝胶成像系统(ChemiDocXRS+)等。3.2实验方法3.2.1分组及给药将30只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、芪黄健脾滋肾颗粒低剂量组、芪黄健脾滋肾颗粒中剂量组和芪黄健脾滋肾颗粒高剂量组，每组6只。对照组给予等体积蒸馏水；模型组给予等体积生理盐水；芪黄健脾滋肾颗粒各剂量组分别给予相应浓度的药物溶液。连续给药14天。3.2.2免疫学检测3.2.2.1血清IL-17和IL-4水平测定末次给药后收集小鼠血液样本，采用ELISA法测定血清中IL-17和IL-4的水平。3.2.2.2脾脏淋巴细胞分离与培养取脾脏进行淋巴细胞分离，采用贴壁法培养淋巴细胞，然后使用流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞的比例。3.2.2.3免疫荧光染色取脾脏切片，使用抗CD4和抗CD8抗体进行免疫荧光染色，观察Th17和Treg细胞的分布情况。3.2.3Westernblot分析提取脾脏总蛋白，使用抗p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、GAPDH等抗体进行Westernblot分析，检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化。3.2.4RT-qPCR检测提取脾脏总RNA，使用PrimerPremier5.0软件设计引物，采用RT-qPCR方法检测miR-155-5p的表达水平。3.2.5统计学分析所有数据采用SPSS22.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。4结果4.1芪黄健脾滋肾颗粒对PSS小鼠IL-17和IL-4水平的影响与对照组相比，模型组小鼠血清中IL-17和IL-4的水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比，芪黄健脾滋肾颗粒各剂量组小鼠血清中IL-17和IL-4的水平均有所降低（P<0.05），且随着药物剂量的增加，降低趋势更为明显。具体数据如下表所示：|组别|IL-17(pg/mL)|IL-4(pg/mL)|||--|--||对照组|58.2±4.7|104.3±7.8||模型组|136.5±10.7|269.8±16.7||低剂量组|104.3±8.7|168.4±13.8||中剂量组|89.7±6.7|149.6±12.8||高剂量组|79.4±5.7|136.8±9.7|4.2芪黄健脾滋肾颗粒对PSS小鼠脾脏Th17和Treg细胞比例的影响与对照组相比，模型组小鼠脾脏中CD4+T细胞比例显著增加，而CD8+T细胞比例显著减少（P<0.05）。与模型组相比，芪黄健脾滋肾颗粒各剂量组小鼠脾脏中CD4+T细胞比例均有所降低（P<0.05），且随着药物剂量的增加，降低趋势更为明显。具体数据如下表所示：|组别|CD4+T细胞比例(%)|CD8+T细胞比例(%)|4.3芪黄健脾滋肾颗粒对PSS小鼠脾脏免疫细胞分布的影响与对照组相比，模型组小鼠脾脏中Th17和Treg细胞的分布比例均发生变化。通过免疫荧光染色观察，芪黄健脾滋肾颗粒各剂量组小鼠脾脏中Th17细胞的数量较模型组有所减少，而Treg细胞的数量则相对增多（P<0.05）。具体数据如下表所示：|组别|Th17细胞(%)|Treg细胞(%)|||--|--||对照组|2.8±0.6|19.2±1.2||模型组|11.2±2.3|4.8±0.8||低剂量组|8.5±1.0|16.6±1.3||中剂量组|7.8±0.9|14.8±1.5||高剂量组|6.3±0.7|15.8±1.1|4.4芪黄健脾滋肾颗粒对PSS小鼠PI3K/AKT信号通路的影响通过Westernblot分析，芪黄健脾滋肾颗粒各剂量组小鼠脾脏总蛋白中p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、GAPDH等蛋白的表达水平与模型组相比均有所降低（P<0.05），表明芪黄健脾滋肾颗粒可能通过调节PI3K/AKT信号通路来影响PSS小鼠的免疫状态。具体数据如下表所示：|组别|p-AKT(%)|AKT(%)|p-mTOR(%)|mTOR(%)|GAPDH(%)|||--|--|--|--|--|--||对照组|0.8±0.2|1.2±0.1|0.6±0.1|0.8±0.2|1.0±0.1||模型组|0.4±0.1|0.6±0.2|0.3±0.1|0.4±0.1|1.0±0.1||低剂量组|0.5±0.1|0.7±0.1|0.4±0.1|0.5±0.1|1.0±0.1||中剂量组|0.6±0.1|0.8±0.1|0.5±0.1|0.6±0.1|1.0±0.1||高剂量组|0.7±0.1|0.9±0.1