《农作物品种SSR标记检测结果分析与判定规范》

1农作物品种SSR标记检测结果分析与判定规范本文件规定了利用SSR荧光标记方法对农作物品种进行检测所产生结果的分析方法与作出判断的基本规范要求。本文件适用于农作物品种鉴定SSR荧光标记分型结果及品种鉴定结果的分析与判断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.11农作物种子检验规程第11部分:品种质量品种真实性鉴定3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1简单重复序列simplesequencerepeat(SSR)是一类由几个核苷酸(一般为1个~6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。3.2品种真实性验证varietygenuinenessverification与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实送验样品与标注名称是否相符;在不适用于标准样品的情况下,可用对照样品进行比较。3.3品种真实性身份鉴定varietygenuinenessidentification通过与标准样品SSR指纹数据比对或筛查,确定送验样品的真实品种名称。3.4Bin每个SSR位点的等位变异大小及其范围。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(basepair)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)rfu:相对荧光单位(relativefluorescenceunits)。Tap酶:耐热DNA聚合酶(Taq_DNApolymerase)5分型结果的分析5.1分型结果的基本要求5.1.1样本分型图谱清晰,特异峰荧光信号强度大于100rfu,无明显非特异峰。5.1.2每一组分子量内标回归曲线正常,且每一个分子量内标峰标定正确。5.1.3等位变异的碱基大小在Bin设置范围之内。25.1.4参照样品的基因分型结果正确,空白对照无等位变异峰.5.2异常峰的分析5.2.1pull_up峰5.2.1.1pull_up峰是在同一电泳孔中,由于扩增产物荧光信号强度较高,超过了仪器对不同荧光光谱的校正阈值,不同荧光光谱互叠造成的假峰.5.2.1.2pull_up峰尖与主峰峰尖位置完全重合,峰型与主峰峰型一致,峰荧光信号强度明显低于主峰.5.2.1.3pull_up峰为假峰,不能读取.在分析基因型数据前,先检查原始数据图谱是否存在pull_up峰,如果存在并影响到特异峰的识别,应先进行pull_up峰的消除.5.2.1.4pull_up峰可通过调整光谱校正参数、降低扩增产物荧光信号强度来消除.5.2.1.5pull_up峰示意图如图1所示.特异峰特异峰特异峰pull-up峰pullpull-up峰图1pull_up峰示意图5.2.2非特异峰5.2.2.1非特异峰可包括染料峰、荧光污染峰和伪峰.5.2.2.2染料峰是由于荧光染料脱离相应引物,单独通过毛细管时产生的;荧光污染峰是由于抗菌素、维生素、多环芳香族化合物、荧光助色物质、各种纺织染料等在500nm~600nm有荧光而产生的;伪峰主要由气泡、尿素结晶或电压波动引起.5.2.2.3染料峰通常较宽,并占有分型所用染料的光谱,可通过对PCR产物的纯化去除;荧光污染峰通常比较宽,拥有较宽的荧光光谱范围,可通过有机提取法消除;伪峰通常尖耸且出现在4种颜色的相同位置,可通过重复实验消除.5.2.2.4非特异峰不是正常扩增产物,可通过人工修正删除该峰的命名.5.2.2.5非特异峰示意图如图2所示.图2非特异峰示意图5.2.3影子峰5.2.3.1在SSR分型图谱中,一个目标等位变异峰前片段长度增加/减少一个重复单位的位置出现一个信号较弱的峰为影子峰.绝大部分影子峰是由于SSR扩增中出现复制滑脱,减少一个重复单位而产生,一般峰荧光信号强度不超过目的等位变异峰的15%.5.2.3.2当一个样品的分型图谱中,全部或大部分SSR的每个等位变异峰前片段长度增加/减少一个重3复单位的位置出现一个小峰,峰荧光信号强度与目的等位变异峰比值小于15%,判断为影子峰.5.2.3.3当分型图谱中将影子峰显示为等位变异时,可通过人工修正删除该峰的命名.5.2.3.4影子峰可通过降低扩增时的样品DNA量或降低电泳上样量等来调节.5.2.3.5影子峰示意图如图3所示.图3影子峰示意图5.2.4连续峰5.2.4.1在SSR分型图谱中,由于SSR扩增中发生复制滑移,出现的3个以上的峰为连续峰.连续峰相邻峰之间片段大小相差一个重复单位.5.2.4.2峰荧光信号强度随碱基数增加而变强,一般片段最长的峰荧光信号强度和峰面积最大.5.2.4.3连续峰读取时一般读片段最大峰的碱基数;连续峰的荧光信号强度是其所有峰的荧光信号强度总和.5.2.4.4连续峰可通过重新设计引物,降低扩增片段长度来减少.5.2.4.5连续峰示意图如图4所示.图4连续峰示意图5.2.5n+1峰5.2.5.1n+1峰是PCR反应过程中由于Taq酶在扩增片段末端自动加一个腺苷酸导致的基因分型中出现片段大小相差1碱基的的两个峰.5.2.5.2n+1峰可根据不同位点的扩增情况,选择读左峰或者读右峰的碱基大小,一般将左峰和右峰设置在同一个Bin内.5.2.5.3n+1峰的片段大小和峰值的荧光信号强度一般采集左峰.当右峰荧光信号强度是左边峰的1倍以上时,n+1峰的荧光信号强度以右边峰为准.5.2.5.4n+1峰可通过减少DNA模板量或引物浓度,增加Taq酶浓度或采用高保真DNA聚合酶等消除.5.2.5.5n+1峰示意图如图5所示.5.2.6微变异峰5.2.6.1与完全重复的等位变异峰仅有细微差别的等位变异峰称为微变异峰.微变异峰一般与等位变异峰相差1碱基以内.5.2.6.2由于PCR扩增、毛细管电泳实验偏离产生的微变异峰,可分析其与前后已命名的Bin片段的偏4图5n+1峰示意图离情况,对微变异峰进行校正,人工修正命名.5.2.6.3微变异峰可以通过更换PCR试剂、电泳缓冲液、胶和稳定室温来减少.5.2.7多等位变异5.2.7.1当试验样品来自2个或2个以上的个体,在二倍体杂交种中出现3个及以上的等位变异峰或在常规种中出现2个及以上的等位变异峰,为多等位变异.5.2.7.2当样品一致性较好时,不同个体之间基因型一致,各位点基因型为1个峰(纯合子)或2个荧光信号强度一致的峰(杂合子).当样品一致性较差时,不同个体之间基因型不完全一致,混合样品基因型可能出现多等位变异峰.5.2.7.3在单个位点上出现多等位变异峰时,结合峰图,一般采集荧光信号强度最强的两个峰.5.2.7.4混合样品基因型在DNA指纹比对时,由于样品一致性造成的多等位变异,导致位点比对结果无法确定时,需对一致性差的位点进行个体检测,综合个体基因型和混合样品基因型进行位点比对.5.2.7.5混合样品出现多等位变异基因型分析示意图如图6所示.图6多等位变异基因型分析示意图5.2.8高低峰5.2.8.1在SSR分型图谱中,由于等位变异之间非等效扩增或者混合样品一致性较差,形成的荧光信号强度不等的2个等位变异峰.5.2.8.2由于等位变异间非等效扩增形成的高低峰的峰差较为固定,由样品一致性差引起的高低峰的峰差会随着样品一致性的变化而变化.5.2.8.3在高低峰基因型采集时,杂交种一般设置20%阈值,常规种一般设置30%阈值.5.2.8.4高低峰中,荧光信号强度较低的峰的rfu值低于设定阈值时,该等位变异峰值不予采集.5.2.8.5高低峰示意图如图7所示.6位点判定6.1将送验样品与标准样品或对照样品逐个位点进行比较,确定比较位点差异.每个位点判定结果包括6.2送验样品与标准样品或对照样品在某个位点等位基因型完全一致,该位点比较结果判断为相同.对5图7高低峰示意图于常规种,送验样品与对照样品在某个位点有共同的等位变异,但由于遗传未稳定,有不同的等位变异时,一般判定为相同,有特殊规定的,可从其规定.对于杂交种,送验样品与对照样品在某个位点有一个等位变异不同,该位点比较结果判断为不同.对于常规种,送验样品与对照样品在某个位点等位变异完全不同,该位点比较结果判断为不同.6.3送验样品与对照样品之一在某个位点中存在数据缺失,该位点比较结果判断为缺失.缺失位点数据是否需要再次实验完善,可根据对检测结果判定的影响以及应用场景来确定.当缺失位点数不影响检测结果判定时,数据可以缺失;当缺失位点数据影响到检测结果判定时,数据需要完善.6.4送验样品与对照样品采用混合样品进行检测,由于样品异质性,送验样品与对照样品之一存在某个位点上高低峰或者多等位变异时,可进行个体检测.检测个体数一般为30个,有特殊规定值的,可从其规定.根据个体基因型仍无法判断位点比对结果的,即为该位点无法判定.当无法判定位点数可能影响检测结果判定时,应在检测结果中说明.7结果判定7.1结果判定应符合GB/T3543.11的规定.宜根据不同的应用场景采用不同的表述方式和判定规则.7.2品种真实性身份验证.送验样品与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实品种与标注名称是否相符,属于同一品种比较,判定阈值采用试验容许误差,容许误差一般设定为2个位点,有特殊规定的,可从其规定.比对位点差异在容许误差以内的,判定为品种真实性符合要求;超出容许误差的,判定为品种真实性不符合要求.7.3品种真实性身份鉴定.送验样品经SSR标记检测并通过标准样品DNA指纹数据比对平台筛查比较或与指定品种比较,鉴定送验样品的真实品种名称,属于品种间比较.比对差异位点为0时,判定为两者不排除是同一品种;比对差异位点在1~2时,不确定两者为同一品种;当比对差异位点大于2时,排除两者为同一品种.差异位点数有特殊规定的,可从其规定.7.4品种创