SDSPAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理

SDS-电泳的根本原理及浓缩胶浓缩样品的原理

SDS■（十二烷基硫酸钠■聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分别

蛋白质的电泳技术

SDS-聚丙烯酰胺凝较电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,

SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级构造，强

复原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在确定浓度的含有强

复原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS・

蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原

有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降

低或消退了各种蛋白质分子之间自然的电荷差异，由于SDS与蛋白

质的结合是按重量成比例的，因此在进展电泳时，蛋白质分子的迁移

速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质

的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX,式

中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，假设将分子量的

标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知

蛋白质在一样条件下进展电泳，依据它的电泳迁移率即可在标准曲线

上求得分子量。

SDS-电泳成功的关键是什么？

①溶液中SDS单体的浓度SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶

束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质

与SDS的充分结合，它们的重量比应当为1：4或1：3。②样品缓

冲液的离子强度由于SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时

SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS

单体才具有较高的平衡浓度。所以，SDS目泳的样品缓冲液离子强度

较低，常为10-100mMo③二硫键是否完全被复原只有二硫键被

完全复原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基

上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Samplebuffer

中的如筑基乙醇的浓度常为4-5%,二硫苏糖醇的浓度常为2-3%o

前者有挥发性，最好使用前参与。

SDS-缓冲液系统的选择，Tris-Glycine.Tris-Tricine.Tris-硼酸盐或

者其他？

一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，但凡不与SDS发生相

互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋的分别和电泳的速

度是格外关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。Tris-

甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。假设要测定糖蛋白的分

子量，最好承受Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15kDa的

蛋白样品，可以使用SDS•尿素系统，也可以承受Tris-tricine缓冲系

统。

积层胶（或称浓缩胶）的作用原理?

在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7时很少解离，其有效泳动

速率很低，而氯离子却有很高的泳动速率，蛋白质的泳动速率介于两者

之间。加上电压以后，作为先导离子的氯离子和跟随离子的甘氨酸离子

分别开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场

强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸离子的泳动,

使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积

相等的稳定态（我不太明白这句话），使这些带电颗粒以一样的速度

泳动，两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品

进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，界面后有一高电压梯

度。由于在移动界面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低，因此氯

离子能快速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳

动速率比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子积存到一起，形

成一条狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓度作用仅取决于样品和

浓缩胶中Tris・HCI的浓度（为什么？），而与样品中蛋白质的最初浓

度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对蛋白样品没有分子筛作用。当

移动的界面到达浓缩胶和分别胶的界面时,凝胶的pH明显增加，导

致甘氨酸大量解离。此时，甘氨酸的有效泳动速率明显增加，超越蛋

白分子，直接在氯离子后移动。由于凝胶孔径变小，蛋白质分子的迁

移速率降低，落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和

pH环境中泳动，并依据其固有的电荷与分子大小进展分别。

SDS-电泳小问答Q：SDS-电泳的

根本原理？

A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS

（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质

的二级和三级构造，强复原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白

质在确定浓度的含有强复原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结

合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量

的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为

特征的负离子团块，从而降低或消退了各种蛋白质分子之间自然的电荷

差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进展电

泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到

200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合

下式：logMW=K-bX,式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为

常数，假设将分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获

得一条标准曲线，未知蛋白质在一样条件下进展电泳，依据它的电泳

迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？

A：在SDS-不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL

缓冲系统，浓缩胶是PH6.7,分别胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris

—甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸

解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两

者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于

导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋

白质分子聚拢到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分别胶后，由

于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接

紧随氯离子之后，同时由于分别胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋

白分子依据其固有的带电性和分子大小进展分别。

所以，pH对整个反响体系的影响是至关重要的，试验中在排解

其他因素之后仍不能很好解决问题的状况，应首要考虑该因素。

Q：样品如何处理？A：

依据样品分别目的不同，主要有三种处理方法：复原SDS处理、非

复原SDS处理、带有烷基化作用的复原SDS处理。

1、复原SDS处理：在复原剂中参与SDS和DTT（或Beta筑基乙醇）

后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分

子，在电泳中，只依据分子量来分别。一股电泳均按这种方式处理，

样品稀释适当浓度，参与上样Buffer,离心，沸水煮5min,再离心

加样。

2、带有烷基化作用的复原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很

好的并经久结实的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕

集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。lOOul样品缓冲液中10ul

的碘乙酸胺，并在室温保温

20%30mino

3、非复原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%

SDS沸水中煮3min,未加复原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不行作

为测定分子量来使用。

Q：SDS-电泳凝胶中各主要成分的作用？

A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳供给载体，其凝固的

好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境亲热相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择PH6.7,分别胶选择pH8.9,选择tris-HCL

系统，具体作用后面介绍；

TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；

十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、

解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

Q：提高SDS-电泳区分率的途径？

A；1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的区分率。建议做法；待

凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4

度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般

凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同

染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳

技术手册》P82-103。

Q：”微笑〃（两边翘起中间凹下）形带缘由？

A：主要是由于凝胶的中间局部凝固不均匀所致，多消灭于较厚的凝

胶中。

处理方法：待其充分凝固再作后续试验。

Q：''皱眉"（两边向下中间鼓起）形带缘由？A：

主要消灭在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡

未排解干净。

处理方法：可在两板间参与适量缓冲液，以排解气泡。

Q：为什么带消灭拖尾现象？A：

主要是样品融解效果不佳或分别胶浓度过大引起的。

处理方法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促

溶剂；电泳缓冲液时间过长，重配制；降低凝胶浓度。

Q：为什么带消灭纹理现象？A：

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理方法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

Q：什么是“鬼带〃，如何处理？

A：''鬼带〃就是在跑大分子构象简洁的蛋白质分子时，常会消灭在泳

道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉

淀，主要由于复原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被

解离的蛋白质分子重折叠结合和亚基重缔合，聚合成大分子，其分子

量要比目标条带大，有时不能进入分别胶C但它却于目标条带有一样

的免疫学活性，在WB反响中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理方法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta筑基乙醇，

以补充缺乏的复原剂：或可加适量EDTA来阻挡复原剂的氧化。

Q：为什么溟酚蓝不能起到指示作用？A：

我们在试验中常会遇到澳酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来

的现象。主要与缓冲液和分别胶的浓度有关。

处理方法：更换正确pH值的Buffer；降低分别胶的浓度。

Q：为什么电泳的条带很粗？A：

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的缘由。

处理方法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确

（6.7h适当降低电压；

Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

A：这种现象一般初学者易消灭。比方电压5