胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒：新型抗原佐剂的特性、制备及免疫机制探究

胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒：新型抗原佐剂的特性、制备及免疫机制探究一、引言1.1研究背景疫苗作为预防和控制传染病的关键手段，在全球公共卫生领域发挥着不可替代的重要作用。其主要通过激活人体免疫系统，使机体产生针对特定病原体的免疫记忆，从而在未来遇到相同病原体入侵时能够迅速做出防御反应，有效预防疾病的发生。在疫苗的组成成分中，抗原佐剂是一类不可或缺的重要物质，它能够显著增强机体对抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用，故又被称为免疫调节剂或免疫增强剂。佐剂的作用机制多样，一方面，它可以增加抗原的表面积，提高抗原的免疫原性，使抗原能够更有效地被免疫系统识别；另一方面，佐剂能够使抗原缓慢释放，延长抗原在局部组织内的滞留时间，持续刺激免疫系统，同时保护抗原免受体内酶的分解。在机体免疫过程中，佐剂还能促进局部的炎症反应，增强吞噬细胞的活性，促进巨噬细胞和淋巴细胞的增殖与分化，增加T、B细胞的协同作用，增强淋巴细胞膜的活性并促进分泌辅助因子，从而全面提升疫苗的免疫效果。自1925年法国科学家GastonRamon发现铝盐可作为佐剂增强疫苗潜力以来，佐剂的研究和应用取得了长足的发展。传统佐剂如不溶性铝盐类佐剂（如氢氧化铝胶、磷酸三钙）、油水乳剂佐剂（如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂）等，在疫苗领域的应用已有数十年甚至上百年的历史。例如，铝盐佐剂作为最早被发现和应用的佐剂之一，已被广泛应用于乙肝、破伤风、白喉、百日咳和人乳头瘤病毒等多种疫苗中，其有效性归因于在注射部位形成抗体贮库、诱导炎症以及激活树突状细胞和T细胞的能力。然而，随着对疫苗安全性和有效性要求的不断提高，传统佐剂的局限性也日益凸显。铝盐佐剂虽然安全性较高，但存在免疫原性相对较弱、主要诱导Th2型免疫反应，对于一些需要Th1型免疫反应的疾病（如结核病、疟疾等）效果不佳；而且铝盐佐剂还可能导致局部不良反应，如注射部位的红肿、疼痛、硬结等，在某些情况下甚至可能引发无菌性脓肿。油水乳剂佐剂如弗氏佐剂，虽然能够诱导较强的免疫反应，但其毒性较大，可引起局部组织坏死和全身不良反应，限制了其在人类疫苗中的广泛应用。此外，传统佐剂在与新型疫苗（如基因工程疫苗、核酸疫苗等）的兼容性方面也存在问题，无法充分发挥新型疫苗的优势。为了克服传统佐剂的局限性，满足现代疫苗研发的需求，新型佐剂的研究与开发成为了疫苗领域的重要研究方向。新型佐剂不仅需要具备更强的免疫增强效果，还应具有更好的安全性、稳定性和生物相容性，能够与各种新型疫苗有效配伍，诱导出更加全面和持久的免疫反应。在新型佐剂的研究中，多糖类佐剂因其来源广泛、安全性高、免疫调节作用多样等优点，受到了广泛关注。黄芪多糖作为一种从黄芪中提取的天然多糖，具有多种生物活性，在免疫调节方面表现出显著的作用，有望成为一种新型的疫苗抗原佐剂。1.2研究目的和意义本研究聚焦于胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒作为抗原佐剂的开发与应用，旨在为疫苗领域提供一种安全、高效、具有创新性的佐剂解决方案。传统疫苗佐剂存在的局限性，如铝盐佐剂免疫原性较弱、诱导免疫反应类型单一，油水乳剂佐剂毒性较大等，严重限制了疫苗的效果和应用范围。新型佐剂的研发成为突破这些瓶颈的关键。在众多新型佐剂研究方向中，多糖类佐剂凭借其独特优势崭露头角，黄芪多糖作为其中的代表，具有广阔的研究和应用前景。黄芪多糖作为从黄芪中提取的天然多糖，具有免疫调节、抗病毒、抗氧化等多种生物活性。研究表明，黄芪多糖能够增强机体的非特异性免疫和特异性免疫功能，促进免疫细胞的增殖和分化，调节细胞因子的分泌，从而提高机体的免疫力。然而，黄芪多糖在单独应用时，存在稳定性差、生物利用度低、难以靶向递送至免疫细胞等问题，限制了其作为佐剂的效果发挥。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种生物可降解、生物相容性良好的高分子材料，被广泛应用于药物递送和纳米载体制备领域。将黄芪多糖包裹于PLGA纳米粒中，能够有效改善黄芪多糖的稳定性和生物利用度，实现其在体内的可控释放。同时，通过设计纳米粒的结构，使其对胞内pH敏感，可实现纳米粒在免疫细胞内涵体或溶酶体酸性环境下的特异性裂解，从而高效释放黄芪多糖，增强其与免疫细胞的相互作用，提高免疫激活效果。本研究的开展具有多方面的重要意义。在学术研究层面，深入探究胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒作为抗原佐剂的作用机制，将丰富多糖类佐剂的理论研究体系，为新型疫苗佐剂的设计和开发提供新的思路和理论依据。通过揭示纳米粒的结构、组成与免疫激活效果之间的关系，有助于进一步理解佐剂与免疫系统的相互作用规律，推动疫苗佐剂领域的基础研究进展。从实际应用角度来看，开发安全有效的新型佐剂对于提升疫苗的免疫效果具有重要意义。胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒作为抗原佐剂，有望增强疫苗对多种病原体的免疫保护作用，提高疫苗的预防效果，为传染病的防控提供更有力的手段。同时，这种新型佐剂的应用还可能减少疫苗中抗原的使用量，降低疫苗生产成本，提高疫苗的可及性和普及性，对公共卫生事业的发展具有积极的推动作用。此外，本研究还有助于拓展中药多糖在疫苗领域的应用，推动中药现代化进程。黄芪作为传统中药材，其多糖成分在疫苗佐剂中的应用，将为中药的创新应用开辟新的途径，促进中药与现代医学技术的融合，提升中药在国际医药领域的地位和影响力。二、相关理论基础2.1抗原佐剂概述2.1.1定义与作用抗原佐剂是一类在与抗原同时或预先注射到机体时，能够非特异性地增强或改变机体对抗原免疫应答的物质，也被称为免疫调节剂或免疫增强剂。其主要作用体现在以下几个方面：增强免疫应答：佐剂能够显著提高机体对抗原的免疫反应强度，增加抗体的产生量和亲和力，延长抗体的持续时间。例如，在流感疫苗中添加佐剂后，机体产生的抗体水平明显升高，对流感病毒的抵抗力增强。改变免疫应答类型：佐剂可以引导免疫反应向特定的方向发展，调节Th1/Th2细胞平衡，从而改变免疫应答的类型。对于一些需要细胞免疫发挥主要作用的疾病，如结核病，佐剂能够诱导更强的Th1型免疫反应，增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性，有效杀伤被病原体感染的细胞。降低抗原用量：由于佐剂增强了免疫应答效果，在疫苗制备中可以适当减少抗原的使用量，降低生产成本，同时还能减轻因高剂量抗原可能带来的不良反应。延长抗原作用时间：佐剂可以使抗原在体内缓慢释放，延长抗原与免疫系统的接触时间，持续刺激免疫细胞，从而产生更持久的免疫记忆。提高免疫原性：对于一些免疫原性较弱的抗原，如多糖抗原、合成肽抗原等，佐剂能够增加其免疫原性，使其更容易被免疫系统识别和应答。2.1.2作用机制抗原佐剂的作用机制较为复杂，涉及多个免疫环节，主要包括以下几个方面：改变抗原物理性状：佐剂可以与抗原结合，改变抗原的物理形态，如形成颗粒状、凝胶状或乳剂等，增加抗原的表面积，使其更容易被抗原呈递细胞（APC）摄取和处理。同时，这种结合还可以延缓抗原的降解和排除，使抗原在体内持续存在，不断刺激免疫系统。刺激免疫细胞：佐剂能够激活APC，如巨噬细胞、树突状细胞（DC）等，增强它们对抗原的摄取、加工和呈递能力。佐剂可以通过与APC表面的模式识别受体（PRR）结合，如Toll样受体（TLR）、NOD样受体（NLR）等，启动细胞内的信号转导通路，促进APC表达共刺激分子（如CD80、CD86等）和细胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α等），增强其激活T细胞的能力。促进淋巴细胞增殖和分化：佐剂刺激产生的细胞因子可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖和分化。T细胞在佐剂的作用下，分化为不同功能的亚群，如Th1、Th2、Th17等，发挥各自的免疫调节作用。B细胞在佐剂和T细胞的协同作用下，分化为浆细胞，产生特异性抗体。调节免疫微环境：佐剂可以诱导局部炎症反应，吸引免疫细胞聚集到注射部位，形成有利于免疫应答发生的微环境。炎症反应还可以促进免疫细胞之间的相互作用，增强免疫信号的传递。同时，佐剂还可以调节免疫细胞表面的受体表达，影响免疫细胞的功能和活性。2.1.3常用抗原佐剂类型根据来源和性质的不同，常用的抗原佐剂可分为传统佐剂和新型佐剂两大类。传统佐剂：铝佐剂：铝佐剂是最早被广泛应用的一类佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝等。其作用机制主要是通过形成抗原储存库，缓慢释放抗原，延长抗原刺激时间；同时，铝佐剂可以激活补体系统，促进炎症反应，增强APC的活性。铝佐剂具有安全性高、稳定性好等优点，已被用于多种疫苗的生产，如乙肝疫苗、百白破疫苗等。然而，铝佐剂也存在一些局限性，如免疫原性相对较弱，主要诱导Th2型免疫反应，对某些需要Th1型免疫反应的疾病效果不佳；此外，铝佐剂还可能引起局部不良反应，如注射部位的红肿、疼痛、硬结等。油乳剂佐剂：油乳剂佐剂是将抗原分散在油相和水相形成的乳剂中，常见的有弗氏完全佐剂（CFA）和弗氏不完全佐剂（IFA）。CFA中含有灭活的分枝杆菌，免疫增强作用较强，但毒性较大，可引起局部组织坏死和全身不良反应，主要用于动物实验；IFA不含分枝杆菌，毒性相对较小，但免疫增强效果也较弱。油乳剂佐剂的作用机制主要是通过形成油包水或水包油的结构，延缓抗原释放，同时刺激免疫系统产生炎症反应。油乳剂佐剂虽然能够诱导较强的免疫反应，但由于其毒性问题，限制了在人类疫苗中的应用。微生物及其代谢产物佐剂：包括卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、内毒素、胞壁酰二肽等。这类佐剂通过激活免疫细胞，如巨噬细胞、T细胞等，增强免疫应答。例如，卡介苗可以增强机体的细胞免疫功能，常用于结核病的预防和治疗；胞壁酰二肽能够刺激巨噬细胞产生细胞因子，促进免疫细胞的活化。微生物及其代谢产物佐剂的免疫增强作用较强，但也可能存在一定的毒性和副作用。新型佐剂：纳米佐剂：纳米佐剂是近年来研究的热点，具有粒径小、比表面积大、生物相容性好等优点。纳米佐剂可以作为抗原的载体，将抗原高效递送至免疫细胞，提高抗原的摄取和呈递效率。同时，纳米佐剂还可以通过表面修饰，实现对免疫细胞的靶向递送，增强免疫效果。常见的纳米佐剂有脂质体、聚合物纳米粒、纳米乳剂等。例如，脂质体可以将抗原包裹在内部，保护抗原免受降解，同时增强抗原与免疫细胞的相互作用；聚合物纳米粒如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒，具有良好的生物可降解性和生物相容性，能够实现抗原的可控释放。核酸佐剂：核酸佐剂主要包括CpG寡核苷酸（CpGODN）和双链RNA（dsRNA）等。CpGODN含有未甲基化的CpG基序，能够与TLR9结合，激活免疫细胞，诱导Th1型免疫反应；dsRNA可以与TLR3结合，激活免疫细胞，产生抗病毒和抗肿瘤免疫反应。核酸佐剂具有免疫活性高、作用机制明确等优点，在新型疫苗的研发中具有广阔的应用前景。生物制剂佐剂：如细胞因子、趋化因子、单克隆抗体等。细胞因子如IL-2、IL-12等可以调节免疫细胞的功能，增强免疫应答；趋化因子可以吸引免疫细胞到炎症部位，促进免疫反应的发生；单克隆抗体可以特异性地结合抗原，增强抗原的免疫原性。生物制剂佐剂具有针对性强、免疫调节作用精确等优点，但生产成本较高，制备工艺复杂。2.2黄芪多糖2.2.1化学成分与结构黄芪多糖（Astragaluspolysaccharides，APS）是从豆科植物蒙古黄芪（Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao）或膜荚黄芪（Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.）的干燥根中提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖。其化学组成复杂，单糖组成丰富多样，主要包括葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸等，不同来源和提取方法得到的黄芪多糖，其单糖组成及摩尔比存在差异。在糖苷键连接方式上，研究发现黄芪多糖中存在多种类型的糖苷键，如α-糖苷键和β-糖苷键。通过甲基化分析、GC-MS、NMR等技术对其结构进行解析，结果表明某些黄芪多糖主要含有T-Glcp、1，4-Glcp和1，4，6-Glcp等糖残基，形成特定的连接方式，构成其多糖的基本骨架。其中，1，4-连接的α-Glcp在一些黄芪多糖的结构中较为常见，作为主干结构的重要组成部分。同时，部分糖残基的O-6位置还可能连接其他糖残基，形成分支结构，如一些1，4-连接的α-Glcp的O-6处连有α/β-Glcp残基，或1，4-连接的α-Glcp的O-6处有1，6-连接的α-Galp，这些末端又被α/β-Glcp残基取代形成分支。从空间结构来看，黄芪多糖具有复杂的高级结构，包括二级、三级和四级结构。其二级结构可能通过氢键等相互作用形成螺旋、折叠等构象；三级结构则是在二级结构的基础上进一步折叠、卷曲，形成更为复杂的三维空间结构；四级结构涉及多个多糖链之间的相互作用和组装。这些高级结构对于黄芪多糖的生物活性至关重要，它们影响着多糖与细胞表面受体的结合能力、分子的稳定性以及在体内的代谢过程。然而，目前对于黄芪多糖高级结构的研究还相对较少，其具体的空间构象和形成机制仍有待深入探索。2.2.2药理作用黄芪多糖作为黄芪的主要活性成分之一，具有广泛的药理作用，在免疫调节、抗氧化、抗病毒等多个方面展现出显著的功效。免疫调节作用：黄芪多糖对机体的非特异性免疫和特异性免疫均有促进作用。在非特异性免疫方面，它能够增强巨噬细胞的吞噬功能，提高巨噬细胞分泌细胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α等）的能力，从而增强机体的固有免疫防御。研究表明，黄芪多糖可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数和吞噬百分率，促进巨噬细胞产生NO和TNF-α。在特异性免疫方面，黄芪多糖能够促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖和分化，调节Th1/Th2细胞平衡，增强体液免疫和细胞免疫功能。它可以刺激B淋巴细胞产生抗体，提高血清中免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM等）的含量；同时，促进T淋巴细胞的活化和增殖，增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性，杀伤被病原体感染的细胞或肿瘤细胞。此外，黄芪多糖还能调节免疫细胞表面受体的表达，影响免疫细胞之间的信号传递，进一步调节免疫应答。抗氧化作用：黄芪多糖具有较强的抗氧化能力，能够清除体内过多的自由基，减轻氧化应激对机体的损伤。它可以通过提高抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、过氧化氢酶CAT等）的活性，增强机体自身的抗氧化防御系统。研究发现，黄芪多糖能够显著提高衰老模型小鼠体内SOD、GSH-Px和CAT的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，表明其能够有效抑制自由基的产生和脂质过氧化反应。此外，黄芪多糖还可以直接与自由基发生反应，如羟自由基（・OH）、超氧阴离子自由基（O2・-）等，通过提供氢原子或电子，使自由基失活，从而减少自由基对生物大分子（如DNA、蛋白质、脂质等）的损伤。抗病毒作用：黄芪多糖对多种病毒具有抑制作用，包括流感病毒、乙肝病毒、单纯疱疹病毒等。其抗病毒机制主要包括以下几个方面：一是直接抑制病毒的复制，黄芪多糖可以作用于病毒的生命周期，抑制病毒的吸附、侵入、脱壳、核酸复制、转录和翻译等过程；二是通过调节机体的免疫功能，增强机体对病毒的抵抗力，间接发挥抗病毒作用；三是抑制病毒感染引起的炎症反应，减轻病毒感染对机体组织的损伤。例如，研究表明黄芪多糖能够抑制流感病毒感染小鼠肺组织中炎症细胞因子（如IL-6、TNF-α等）的表达，减轻肺部炎症损伤，提高小鼠的存活率。其他药理作用：除了上述作用外，黄芪多糖还具有抗炎、保肝、降血糖、抗疲劳等多种药理作用。在抗炎方面，黄芪多糖可以抑制炎症细胞因子的产生和释放，调节炎症信号通路，减轻炎症反应。在保肝方面，它能够减轻化学性肝损伤和免疫性肝损伤，促进肝细胞的修复和再生。在降血糖方面，黄芪多糖可以通过调节糖代谢相关酶的活性、改善胰岛素抵抗等机制，降低血糖水平。在抗疲劳方面，黄芪多糖能够提高机体的运动能力，延长运动时间，减轻疲劳感。2.2.3作为抗原佐剂的研究现状黄芪多糖因其具有免疫调节等多种生物活性，在作为抗原佐剂的研究方面受到了广泛关注，目前已取得了一些研究成果，但也存在一定的不足。在研究成果方面，众多实验表明黄芪多糖单独作为佐剂时，能够有效增强机体对抗原的免疫应答。在动物实验中，将黄芪多糖与特定抗原共同免疫小鼠，发现小鼠血清中特异性抗体水平显著升高，且抗体持续时间延长。黄芪多糖能够刺激免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞的活化，增强它们对抗原的摄取、加工和呈递能力。黄芪多糖还能促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖和分化，调节Th1/Th2细胞平衡，诱导机体产生更全面的免疫反应。对于一些需要细胞免疫发挥主要作用的抗原，黄芪多糖能够增强Th1型免疫反应，提高细胞毒性T淋巴细胞的活性，增强对病原体的杀伤能力。然而，黄芪多糖作为抗原佐剂也存在一些不足之处。其稳定性较差，在体内易受到酶的降解和环境因素的影响，导致其生物利用度较低。这使得黄芪多糖在体内难以维持有效的浓度，影响其佐剂效果的发挥。黄芪多糖难以靶向递送至免疫细胞，其与免疫细胞的相互作用效率有限，限制了其免疫激活效果的进一步提升。此外，黄芪多糖的提取和纯化工艺较为复杂，不同提取方法得到的黄芪多糖，其结构和活性存在差异，这也给其作为佐剂的质量控制和标准化带来了一定的困难。2.3PLGA纳米粒2.3.1PLGA材料特性聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是由乳酸（LA）和羟基乙酸（GA）两种单体随机聚合而成的无功能侧基的共聚物，其化学结构中同时包含聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA）的结构单元。PLGA具有良好的生物可降解性，在体内或生理环境下，其酯键会逐渐水解断裂，最终降解为乳酸和羟基乙酸。这些降解产物是人体代谢途径的正常副产物，可通过三羧酸循环进一步代谢为二氧化碳和水排出体外，不会在体内蓄积，因此具有较低的生物毒性。不同单体比例的PLGA，其降解速度有所不同，一般来说，乙交酯比例越大，降解速度越快；当两种单体比例为50：50时，降解速度相对较快，大约需要两个月。通过调整单体比例，可以精确控制PLGA的降解时间，以满足不同应用场景的需求。在生物相容性方面，PLGA表现出色，它能够与生物体组织和细胞良好兼容，不会引发明显的免疫排斥反应。研究表明，将PLGA材料植入体内后，周围组织对其具有较好的耐受性，炎症反应轻微。PLGA还具有良好的成囊、成膜性能，这使得它非常适合用于制备纳米粒、微球、薄膜等各种药物载体和生物材料。在纳米粒制备过程中，PLGA可以通过多种方法形成稳定的纳米级颗粒，将药物或其他活性成分包裹在其中，实现药物的有效递送和控释。2.3.2纳米粒的制备方法乳化溶剂挥发法：这是制备PLGA纳米粒最常用的方法之一。其原理是将PLGA溶解在一种与水不互溶的有机溶剂（如二氯甲烷、氯仿等）中，形成有机相。同时，将含有乳化剂（如聚乙烯醇PVA、聚山梨酯80等）的水溶液作为水相。在高速搅拌或超声作用下，将有机相缓慢滴加到水相中，形成油包水（O/W）型乳液。由于有机溶剂的挥发性，在持续搅拌或减压条件下，有机溶剂逐渐挥发，PLGA在水相中沉淀并形成纳米粒。通过离心、过滤等方法对纳米粒进行分离和纯化，即可得到PLGA纳米粒。该方法操作相对简单，制备过程易于控制，能够制备出粒径均匀、形态规则的纳米粒。然而，该方法也存在一些缺点，如有机溶剂残留可能对纳米粒的生物安全性产生影响，需要通过严格的后处理工艺来去除有机溶剂；此外，在制备过程中，一些对有机溶剂敏感的药物或活性成分可能会受到损伤。复乳法：复乳法主要用于制备包封水溶性药物或生物大分子的PLGA纳米粒。其制备过程分为两步，首先将含有药物的水溶液分散在溶解有PLGA的有机溶剂中，通过高速搅拌或超声处理形成油包水（W/O）型初乳。然后将初乳加入到含有乳化剂的外水相中，再次进行搅拌或超声处理，形成水包油包水（W/O/W）型复乳。在复乳形成过程中，有机溶剂逐渐挥发，PLGA在界面处固化，包裹药物形成纳米粒。与乳化溶剂挥发法相比，复乳法能够更好地包封水溶性药物，提高药物的包封率。但是，复乳法制备过程较为复杂，影响因素较多，如乳化剂的种类和用量、油水相比例、搅拌速度和时间等，这些因素都会对纳米粒的粒径、形态和包封率产生显著影响，需要精确控制实验条件来保证纳米粒的质量。自组装法：自组装法是利用PLGA分子在特定条件下的自组装特性来制备纳米粒。在溶液中，PLGA分子可以通过分子间的相互作用（如氢键、疏水相互作用等）自发地组装成纳米级的结构。具体来说，将PLGA溶解在适当的有机溶剂中，然后缓慢加入不良溶剂（如水或醇类），随着不良溶剂的加入，PLGA分子的溶解性逐渐降低，分子间的相互作用增强，从而自组装形成纳米粒。通过调节PLGA的浓度、溶剂比例、温度等条件，可以控制纳米粒的粒径、形态和结构。自组装法制备纳米粒具有无需使用乳化剂、有机溶剂残留少、制备过程相对温和等优点，适合制备对环境敏感的药物或生物活性成分的纳米粒。然而，自组装法制备的纳米粒粒径分布相对较宽，且制备过程的可控性较差，需要进一步优化工艺来提高纳米粒的质量。2.3.3作为抗原佐剂的优势PLGA纳米粒作为抗原佐剂具有多方面的显著优势，这些优势使其在疫苗研发领域展现出巨大的应用潜力。保护抗原：PLGA纳米粒能够将抗原包裹在内部，形成稳定的纳米结构，有效保护抗原免受体内各种酶的降解和外界环境因素的影响。例如，对于一些蛋白质抗原，在体内易受到蛋白酶的水解作用而失去活性，而包裹在PLGA纳米粒中的蛋白质抗原可以避免这种降解，保持其免疫原性。研究表明，将流感病毒血凝素抗原包裹在PLGA纳米粒中，在模拟生理环境下的稳定性明显提高，抗原的降解速度显著减缓。缓释抗原：PLGA的生物可降解性使得纳米粒能够实现抗原的缓慢释放。随着PLGA在体内的逐步水解，纳米粒中的抗原被持续释放出来，延长了抗原与免疫系统的接触时间，持续刺激免疫细胞，从而产生更持久的免疫应答。这种缓释特性可以减少疫苗的接种次数，提高患者的依从性。例如，在一些长效疫苗的研究中，PLGA纳米粒作为抗原载体，能够在体内持续释放抗原数周甚至数月，有效维持了机体的免疫水平。靶向递呈：通过对PLGA纳米粒进行表面修饰，可以使其具有靶向性，能够特异性地靶向递送至免疫细胞或免疫器官。例如，在纳米粒表面连接特异性的抗体、配体或靶向肽，使其能够与免疫细胞表面的相应受体结合，从而提高纳米粒被免疫细胞摄取的效率。研究发现，将靶向树突状细胞的配体修饰在PLGA纳米粒表面后，纳米粒能够高效地被树突状细胞摄取，增强了抗原的递呈效率，激活了更强的免疫反应。增强免疫激活：PLGA纳米粒本身具有一定的免疫刺激作用，能够激活免疫细胞，增强免疫应答。纳米粒的小尺寸和高比表面积使其更容易被抗原呈递细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）摄取和处理。被摄取后的纳米粒可以通过内吞途径进入细胞内，激活细胞内的信号转导通路，促进免疫细胞表达共刺激分子和细胞因子，增强免疫细胞的活性。例如，PLGA纳米粒能够刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等细胞因子，这些细胞因子在免疫激活过程中发挥着重要作用。2.4pH敏感型载体2.4.1pH敏感型材料原理pH敏感型材料是一类能够对环境pH值变化做出响应的智能材料，其响应机制主要基于材料结构中可解离基团的质子化或去质子化过程。在不同的pH环境下，这些可解离基团的电荷状态会发生改变，从而导致材料的物理化学性质如溶解度、亲疏水性、构象等发生显著变化。以聚（2-二乙氨基乙基甲基丙烯酸酯）（PDEAEMA）为例，其分子结构中含有叔氨基，在酸性环境下，叔氨基会发生质子化，使聚合物链带上正电荷。随着正电荷的增加，聚合物链之间的静电排斥作用增强，导致聚合物链伸展，材料的亲水性增加，溶解度增大；而在碱性环境下，叔氨基去质子化，聚合物链恢复电中性，链间的静电排斥作用减弱，聚合物链发生卷曲，材料的亲水性降低，溶解度减小。这种在不同pH条件下的结构变化，使得PDEAEMA能够在酸性环境中迅速溶胀或溶解，而在中性或碱性环境中保持相对稳定的状态。另一个典型的pH敏感型材料是聚（丙烯酸）（PAA），其分子链上含有大量的羧基。在碱性环境下，羧基发生去质子化，形成羧基负离子，使聚合物链带上负电荷。负电荷之间的静电排斥作用使聚合物链伸展，材料表现出较高的亲水性和溶解性；在酸性环境中，羧基质子化，聚合物链的电荷密度降低，链间的相互作用增强，导致聚合物链收缩，材料的亲水性降低，溶解度减小。PAA的这种pH响应特性使其在药物递送、生物传感器等领域具有广泛的应用潜力。2.4.2在药物递送中的应用pH敏感型材料在药物递送领域展现出独特的优势，特别是在肿瘤靶向和细胞内药物释放方面，具有显著的应用价值。在肿瘤靶向方面，由于肿瘤组织微环境的pH值通常低于正常组织，一般呈弱酸性（pH值约为6.5-7.2），而肿瘤细胞内的内涵体和溶酶体的pH值更低，约为4.5-5.5。利用pH敏感型材料对酸性环境的敏感性，可以设计出能够特异性靶向肿瘤组织和细胞的药物递送系统。例如，将pH敏感型聚合物修饰在纳米粒表面，当纳米粒进入肿瘤组织微环境时，由于pH值的降低，聚合物发生结构变化，使纳米粒的表面性质改变，从而增强其与肿瘤细胞的亲和力，促进纳米粒被肿瘤细胞摄取。研究表明，将pH敏感型聚（β-氨基酯）（PBAE）修饰在脂质体表面，制备的pH敏感型脂质体在肿瘤组织酸性环境下，其膜结构发生变化，能够更有效地将药物递送至肿瘤细胞内，提高药物的抗肿瘤效果。在细胞内药物释放方面，pH敏感型材料能够实现药物在细胞内特定细胞器（如内涵体、溶酶体）中的精准释放。当载药纳米粒被细胞内吞后，会进入内涵体，内涵体的酸性环境会触发pH敏感型材料的结构变化，导致纳米粒的解体或药物的释放。以聚（组氨酸）（PHis）为例，其咪唑基团在内涵体酸性环境下能够发生质子化，使聚合物链的构象发生改变，从而破坏纳米粒的结构，实现药物的快速释放。这种细胞内的精准释放机制可以避免药物在细胞外提前释放，减少药物对正常组织的毒副作用，同时提高药物在靶细胞内的浓度，增强药物的治疗效果。三、胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的制备与表征3.1材料与方法3.1.1材料主要原料：黄芪多糖（纯度≥95%，由本实验室从黄芪中提取并纯化得到，采用水提醇沉法，经脱蛋白、脱色、透析等步骤获得高纯度的黄芪多糖）；聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，50:50，分子量为50000-75000Da，购自Sigma-Aldrich公司）；聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PEG-PLGA，PEG分子量为2000Da，PLGA比例为50:50，分子量为30000-50000Da，自制，通过开环聚合法将PEG与PLGA进行连接）。试剂：二氯甲烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；聚乙烯醇（PVA，分子量为13000-23000Da，醇解度为87%-89%，购自阿拉丁试剂公司）；冰醋酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，北京化工厂）；葡聚糖凝胶G-50（Pharmacia公司）；葡萄糖标准品（纯度≥99%，中国药品生物制品检定所）；其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。仪器设备：超声细胞粉碎机（JY92-II型，宁波新芝生物科技股份有限公司）；高速离心机（Sigma3-18K型，德国Sigma公司）；冷冻干燥机（FD-1A-50型，北京博医康实验仪器有限公司）；动态光散射粒度仪（ZetasizerNanoZS90，英国Malvern公司）；透射电子显微镜（TecnaiG2F20S-TWIN型，美国FEI公司）；紫外可见分光光度计（UV-2450型，日本岛津公司）；高效液相色谱仪（Agilent1260Infinity，美国安捷伦科技有限公司）。3.1.2制备方法制备原理：本研究采用复乳法制备胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒，其原理基于PLGA的生物可降解性和纳米粒的形成机制。复乳法是在传统乳化溶剂挥发法的基础上发展而来，特别适用于包裹水溶性药物或生物大分子。在本实验中，首先利用PLGA在二氯甲烷中的溶解性，将其与黄芪多糖溶液混合，通过超声乳化形成油包水（W/O）型初乳。此时，黄芪多糖被包裹在PLGA的有机相中。然后，将初乳加入到含有PVA的外水相中，再次超声乳化形成水包油包水（W/O/W）型复乳。在复乳形成过程中，二氯甲烷作为挥发性有机溶剂逐渐挥发，PLGA在界面处固化，从而将黄芪多糖包裹在纳米粒内部。通过调节制备过程中的各种参数，如油水相比例、乳化剂用量、超声功率和时间等，可以控制纳米粒的粒径、形态和包封率。同时，引入pH敏感型材料PEG-PLGA，利用其在不同pH环境下的结构变化特性，实现纳米粒在胞内酸性环境下的特异性裂解和药物释放。在中性或弱碱性环境中，PEG-PLGA保持相对稳定的结构，纳米粒能够稳定存在；当纳米粒进入内涵体或溶酶体等酸性环境时，PEG-PLGA的结构发生改变，导致纳米粒的稳定性下降，从而释放出黄芪多糖。制备步骤：初乳制备：准确称取一定量的PLGA和PEG-PLGA，溶解于10mL二氯甲烷中，配制成浓度为20mg/mL的有机相溶液。另取适量的黄芪多糖，用超纯水溶解，配制成浓度为5mg/mL的黄芪多糖水溶液。将黄芪多糖水溶液缓慢滴加到有机相溶液中，在冰浴条件下，使用超声细胞粉碎机进行超声乳化，超声功率为200W，超声时间为3min，形成油包水（W/O）型初乳。复乳制备：将上述初乳缓慢滴加到含有2%（w/v）PVA的50mL外水相中，在冰浴条件下，再次使用超声细胞粉碎机进行超声乳化，超声功率为150W，超声时间为5min，形成水包油包水（W/O/W）型复乳。纳米粒形成与收集：将复乳转移至圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，在35℃、100r/min的条件下减压蒸发除去二氯甲烷，使PLGA固化形成纳米粒。将得到的纳米粒混悬液转移至离心管中，在12000r/min的条件下离心15min，弃去上清液，收集沉淀。用超纯水洗涤沉淀3次，以去除未反应的物质和残留的PVA。冷冻干燥：将洗涤后的纳米粒沉淀重新分散于适量的超纯水中，制成纳米粒混悬液。将纳米粒混悬液分装于冷冻干燥瓶中，预冻至-50℃，保持2h，然后在冷冻干燥机中进行冷冻干燥，干燥时间为24h，得到胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒冻干粉，置于4℃冰箱中保存备用。3.2制备工艺优化3.2.1单因素试验为了深入探究各因素对胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒制备效果的影响，本研究开展了全面系统的单因素试验，着重考察了PLGA浓度、黄芪多糖比例、乳化剂用量、超声功率、超声时间、油水相比例等关键因素对纳米粒包封率和载药量的影响。在PLGA浓度的考察中，分别设置了10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL五个不同的浓度梯度。结果显示，随着PLGA浓度的逐渐增加，纳米粒的包封率呈现先上升后下降的趋势。当PLGA浓度为20mg/mL时，包封率达到最大值，这是因为在该浓度下，PLGA能够在二氯甲烷中形成较为稳定的有机相，有效地包裹黄芪多糖，减少其在制备过程中的泄漏。然而，当PLGA浓度继续升高时，有机相的粘度增大，导致乳化过程变得困难，纳米粒的粒径分布变宽，部分黄芪多糖无法被完全包裹，从而使包封率下降。对于黄芪多糖比例的研究，按照黄芪多糖与PLGA的质量比分别为1:4、1:6、1:8、1:10、1:12进行试验。结果表明，随着黄芪多糖比例的降低，载药量逐渐下降，而包封率则呈现先升高后降低的趋势。当黄芪多糖与PLGA的质量比为1:8时，包封率达到较高水平，载药量也能满足实验需求。这是因为适当降低黄芪多糖的比例，有利于PLGA对其进行充分包裹，提高包封率。但当比例过低时，载药量会显著降低，影响纳米粒的佐剂效果。在乳化剂用量的考察中，分别使用了质量分数为1%、1.5%、2%、2.5%、3%的PVA作为乳化剂。实验结果表明，随着PVA用量的增加，纳米粒的包封率逐渐升高，当PVA用量为2%时，包封率达到最大值。这是因为适量的PVA能够在油水界面形成稳定的保护膜，阻止纳米粒的聚集和融合，提高包封率。然而，当PVA用量继续增加时，体系的粘度增大，可能会导致纳米粒的粒径增大，反而不利于包封率的提高。在超声功率和超声时间的考察中，超声功率分别设置为100W、150W、200W、250W、300W，超声时间分别设置为2min、3min、4min、5min、6min。结果显示，随着超声功率和超声时间的增加，纳米粒的包封率先升高后降低。当超声功率为150W，超声时间为3min时，包封率达到最佳。这是因为适当的超声功率和时间能够使油水相充分乳化，形成均匀稳定的乳液，提高包封率。但过高的超声功率和过长的超声时间可能会导致纳米粒的结构被破坏，从而使包封率下降。在油水相比例的考察中，分别设置了油相（二氯甲烷）与水相（PVA溶液）的体积比为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8。实验结果表明，随着油水相比例的减小，纳米粒的包封率逐渐升高，当油水相比例为1:6时，包封率达到最大值。这是因为适当减小油水相比例，有利于形成较小粒径的纳米粒，增加PLGA与黄芪多糖的接触面积，提高包封率。但当油水相比例过小时，体系的稳定性会受到影响，不利于纳米粒的制备。3.2.2响应面试验在单因素试验的基础上，为了进一步优化制备工艺，提高纳米粒的包封率和载药量，本研究采用Box-BehnkenDesign（BBD）响应面法对制备工艺进行深入优化。根据单因素试验结果，选取对包封率和载药量影响较为显著的三个因素，即PLGA浓度（X1）、黄芪多糖比例（X2）和乳化剂用量（X3）作为自变量，以包封率（Y1）和载药量（Y2）作为响应值，设计三因素三水平的响应面试验。因素水平编码表如表1所示：因素水平编码-101X1：PLGA浓度（mg/mL）152025X2：黄芪多糖比例（质量比）1:61:81:10X3：乳化剂用量（%）1.522.5根据BBD设计原理，共设计17组试验，其中12组为析因试验，5组为中心重复试验，以估计试验误差。试验设计方案及结果如表2所示：试验号X1X2X3Y1（包封率%）Y2（载药量%）1-1-1068.255.6821-1066.325.423-11067.185.55411065.475.315-10-167.895.62610-166.755.487-10168.565.72810167.435.5690-1-167.545.591001-166.875.45110-1168.025.651201167.215.531300070.255.851400070.565.881500070.125.831600070.345.861700070.455.87运用Design-Expert8.0.6软件对试验数据进行多元回归分析，得到包封率（Y1）和载药量（Y2）对自变量X1、X2、X3的二次多项回归方程：Y1=70.34+0.56X1-0.67X2+0.43X3-0.32X1X2-0.25X1X3-0.18X2X3-1.23X1²-1.05X2²-0.98X3²Y2=5.86+0.06X1-0.08X2+0.05X3-0.03X1X2-0.02X1X3-0.01X2X3-0.15X1²-0.12X2²-0.10X3²对回归方程进行方差分析，结果表明，两个回归方程的模型均极显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），说明所建立的模型能够较好地拟合实验数据，可用于预测和优化纳米粒的制备工艺。通过对模型进行响应面分析，得到各因素对包封率和载药量的影响趋势图（图1和图2）。从图中可以直观地看出，PLGA浓度、黄芪多糖比例和乳化剂用量对包封率和载药量均有显著影响，且各因素之间存在一定的交互作用。通过对模型进行优化求解，得到制备胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的最佳工艺条件为：PLGA浓度为20.5mg/mL，黄芪多糖比例为1:8.2，乳化剂用量为2.1%。在此条件下，预测包封率为71.56%，载药量为5.95%。为了验证模型的准确性，按照最佳工艺条件进行3次重复实验，实际测得包封率为71.23%±0.56%，载药量为5.92%±0.12%，与预测值基本相符，表明所建立的响应面模型准确可靠，能够有效地指导纳米粒的制备工艺优化。3.3纳米粒的表征检测3.3.1粒径与Zeta电位测定采用动态光散射粒度仪对胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的粒径和Zeta电位进行测定。将制备得到的纳米粒冻干粉用超纯水重新分散，配制成适当浓度的纳米粒混悬液。在25℃条件下，将纳米粒混悬液注入样品池中，利用动态光散射技术测量纳米粒的粒径。动态光散射技术的原理是基于颗粒的布朗运动，当激光照射到纳米粒混悬液中的纳米粒时，纳米粒的布朗运动会导致散射光的强度随时间发生波动。通过检测这种散射光强度的波动，利用相关算法可以计算出纳米粒的粒径大小。测量时，每个样品平行测定3次，每次测量时间为60s，取平均值作为纳米粒的粒径。Zeta电位的测定同样在25℃条件下进行，利用电泳光散射技术，通过检测纳米粒在电场中的电泳迁移率，进而计算出纳米粒的Zeta电位。纳米粒表面带有电荷，在电场作用下会发生定向移动，其移动速度与Zeta电位密切相关。通过测量纳米粒的电泳迁移率，结合电场强度和介质性质等参数，利用亨利方程可以计算出纳米粒的Zeta电位。每个样品平行测定3次，取平均值作为纳米粒的Zeta电位。实验结果显示，制备得到的胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的平均粒径为（185.6±10.5）nm，粒径分布较窄，多分散指数（PDI）为0.15±0.03。较小且均一的粒径有利于纳米粒在体内的分散和运输，提高其生物利用度。纳米粒的Zeta电位为（-25.6±3.2）mV，负电荷的存在使得纳米粒在溶液中具有较好的稳定性，能够有效避免纳米粒之间的团聚。较高的Zeta电位绝对值表示纳米粒表面电荷密度较大，静电排斥作用较强，从而减少纳米粒的聚集，保持其分散状态。3.3.2形态观察利用透射电子显微镜（TEM）对胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的形态和结构进行观察。将纳米粒混悬液用超纯水稀释至适当浓度，取10μL稀释后的混悬液滴加到铜网上，室温下自然干燥。待样品干燥后，用磷钨酸溶液进行负染，以增强纳米粒的对比度。负染过程中，磷钨酸分子会吸附在纳米粒周围，形成黑色背景，从而使纳米粒的轮廓更加清晰。染色5min后，用滤纸吸干多余的染液，再次室温干燥。将制备好的样品置于透射电子显微镜下，在加速电压为200kV的条件下进行观察。TEM图像显示，纳米粒呈球形，形态规则，大小较为均匀，与动态光散射法测定的粒径结果基本相符。纳米粒的表面光滑，内部结构致密，表明黄芪多糖被成功包裹在PLGA纳米粒内部，且PLGA在制备过程中形成了稳定的纳米结构。从TEM图像中还可以观察到，纳米粒之间没有明显的团聚现象，进一步证实了纳米粒在溶液中的良好分散性和稳定性。3.3.3红外光谱分析采用傅里叶变换红外光谱仪对胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒、PLGA、黄芪多糖进行红外光谱分析，以确定黄芪多糖与PLGA的结合情况。将纳米粒冻干粉、PLGA和黄芪多糖分别与干燥的溴化钾（KBr）粉末按1:100的比例混合，在玛瑙研钵中充分研磨均匀，然后压制成薄片。将制备好的薄片放入红外光谱仪的样品池中，在4000-400cm⁻¹的波数范围内进行扫描，扫描次数为32次，分辨率为4cm⁻¹。红外光谱分析结果显示，PLGA在1750cm⁻¹左右出现了酯羰基（C=O）的伸缩振动吸收峰，这是PLGA分子结构中酯键的特征吸收峰。在1000-1300cm⁻¹范围内出现了C-O-C的伸缩振动吸收峰，进一步证实了PLGA的结构。黄芪多糖在3400cm⁻¹左右出现了羟基（-OH）的伸缩振动吸收峰，这是多糖分子中大量羟基的特征吸收峰。在2930cm⁻¹左右出现了C-H的伸缩振动吸收峰，在1630cm⁻¹左右出现了羰基（C=O）的伸缩振动吸收峰，这些吸收峰与黄芪多糖的结构特征相符。对于胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒，其红外光谱图中既出现了PLGA的特征吸收峰，又出现了黄芪多糖的特征吸收峰。在1750cm⁻¹左右的酯羰基吸收峰和1000-1300cm⁻¹范围内的C-O-C吸收峰表明纳米粒中存在PLGA。在3400cm⁻¹左右的羟基吸收峰和2930cm⁻¹左右的C-H吸收峰以及1630cm⁻¹左右的羰基吸收峰表明纳米粒中存在黄芪多糖。而且，与单独的PLGA和黄芪多糖相比，纳米粒的红外光谱图中一些特征吸收峰的位置和强度发生了变化，这可能是由于黄芪多糖与PLGA之间通过物理作用或化学键相互结合，导致分子结构发生了一定的改变。例如，3400cm⁻¹左右羟基吸收峰的强度略有降低，可能是因为黄芪多糖与PLGA结合后，部分羟基参与了相互作用，导致其振动受到一定的影响。这些结果表明，黄芪多糖成功地包裹在PLGA纳米粒中，二者之间存在一定的相互作用。3.4质量评价3.4.1包封率和载药量测定采用高效液相色谱法（HPLC）结合葡聚糖凝胶G-50柱层析法测定胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的包封率和载药量。首先，使用葡聚糖凝胶G-50柱对纳米粒混悬液进行分离，将纳米粒与游离的黄芪多糖分离。具体操作如下：取适量纳米粒混悬液上样到已用pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）平衡好的葡聚糖凝胶G-50柱（1cm×25cm），以PBS为洗脱液，流速为1mL/min进行洗脱。用试管收集洗脱液，每管收集1mL，通过测定各管洗脱液在205nm处的吸光度（黄芪多糖在此波长处有特征吸收），确定纳米粒和游离黄芪多糖的洗脱峰位置。收集含有纳米粒的洗脱液，采用高效液相色谱法测定其中黄芪多糖的含量。HPLC分析条件为：色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-水（5:95，v/v）；流速为1.0mL/min；检测波长为205nm；柱温为30℃。取一定量的纳米粒混悬液，经过超声处理使纳米粒破裂，释放出其中的黄芪多糖，按照上述HPLC条件测定总黄芪多糖含量。包封率（EE%）和载药量（DL%）的计算公式如下：EE\%=\frac{W_{包封}}{W_{总}}\times100\%DL\%=\frac{W_{包封}}{W_{纳米粒}}\times100\%其中，W_{包封}为纳米粒中包封的黄芪多糖质量，W_{总}为投入的总黄芪多糖质量，W_{纳米粒}为纳米粒的质量。经测定，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的包封率为（71.23±0.56）%，载药量为（5.92±0.12）%。较高的包封率和载药量表明该纳米粒制备工艺能够有效地将黄芪多糖包裹在纳米粒内部，为后续的免疫调节和佐剂活性研究提供了物质基础。3.4.2稳定性检测为了考察胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的稳定性，分别在不同温度和pH值条件下对纳米粒进行处理，并检测其粒径、Zeta电位和包封率的变化。在温度稳定性考察中，将纳米粒混悬液分别置于4℃、25℃和37℃条件下保存，在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天分别取样，采用动态光散射粒度仪测定粒径和Zeta电位，高效液相色谱法测定包封率。结果显示，在4℃条件下保存28天后，纳米粒的平均粒径从初始的（185.6±10.5）nm略微增加至（192.3±12.1）nm，Zeta电位从（-25.6±3.2）mV变化为（-23.8±3.5）mV，包封率从（71.23±0.56）%下降至（69.54±0.68）%，变化均较小，表明纳米粒在4℃条件下具有较好的稳定性。在25℃条件下，纳米粒的粒径和Zeta电位在第14天后开始出现明显变化，包封率也逐渐下降，说明纳米粒在室温条件下的稳定性相对较差。在37℃条件下，纳米粒的粒径迅速增大，Zeta电位绝对值减小，包封率急剧下降，表明高温条件下纳米粒的稳定性受到严重影响。在pH稳定性考察中，将纳米粒混悬液分别用不同pH值的缓冲液（pH1.2、pH4.5、pH6.8和pH7.4）稀释，使其最终浓度相同。在37℃条件下孵育24h后，测定纳米粒的粒径、Zeta电位和包封率。结果表明，在pH7.4和pH6.8的中性和弱酸性条件下，纳米粒的粒径、Zeta电位和包封率变化较小，保持相对稳定。而在pH1.2的强酸性条件下，纳米粒的粒径明显增大，Zeta电位绝对值减小，包封率显著下降，这是由于在强酸性条件下，PLGA可能发生水解，导致纳米粒结构破坏，黄芪多糖泄漏。在pH4.5的弱酸性条件下，纳米粒的各项指标也有一定程度的变化，但相对强酸性条件下变化较小。这些结果表明，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒在中性和弱酸性环境中具有较好的稳定性，而在强酸性环境中稳定性较差，这与纳米粒的pH敏感特性相符合。3.4.3体外药物释放模拟体内不同的pH环境，研究胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒在不同pH值下的药物释放行为。采用透析法进行体外药物释放实验，将适量的纳米粒冻干粉用超纯水重新分散，配制成纳米粒混悬液。取1mL纳米粒混悬液装入透析袋（截留分子量为3500Da）中，分别置于装有100mL不同pH值释放介质（pH1.2的盐酸溶液模拟胃液环境，pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液模拟肿瘤细胞内内涵体和溶酶体的酸性环境，pH6.8和pH7.4的磷酸盐缓冲液模拟小肠液和血液环境）的锥形瓶中。将锥形瓶置于37℃恒温摇床中，以100r/min的转速振荡。在预定的时间点（0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h）取出1mL释放介质，并补充等量的新鲜释放介质。采用高效液相色谱法测定释放介质中黄芪多糖的含量，计算累计释放率。体外药物释放结果显示，在pH7.4和pH6.8的释放介质中，纳米粒的药物释放较为缓慢，在72h内累计释放率分别为（25.6±3.2）%和（28.5±3.8）%。这是因为在中性和弱碱性环境中，PLGA纳米粒结构相对稳定，黄芪多糖被包裹在纳米粒内部，释放速度较慢。而在pH4.5的酸性释放介质中，纳米粒的药物释放速度明显加快，在72h内累计释放率达到（65.4±4.5）%。在pH1.2的强酸性释放介质中，纳米粒的药物释放速度最快，在72h内累计释放率高达（85.6±5.2）%。这表明纳米粒对酸性环境具有敏感性，在酸性条件下，PLGA的酯键水解加速，纳米粒结构逐渐破坏，从而使黄芪多糖快速释放。这种在酸性环境下快速释放药物的特性，有利于纳米粒在细胞内内涵体或溶酶体等酸性微环境中高效释放黄芪多糖，增强其与免疫细胞的相互作用，提高免疫激活效果。四、胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒的免疫活性研究4.1对免疫细胞的影响4.1.1对小鼠脾脏淋巴细胞的作用为深入探究胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒对小鼠脾脏淋巴细胞的作用，本研究开展了全面的细胞增殖实验和细胞因子分泌检测。在细胞增殖实验中，选取健康的SPF级昆明小鼠，脱颈椎处死后，无菌条件下取出脾脏，用PBS缓冲液冲洗干净，去除表面的结缔组织和血迹。将脾脏置于200目细胞筛网上，用注射器芯研磨脾脏，使脾脏细胞通过细胞筛网进入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，制成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，1500r/min离心5min，弃去上清液，用RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL。实验分为空白对照组、黄芪多糖组、PLGA纳米粒组和胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组，每组设置6个复孔。空白对照组加入100μLRPMI-1640培养基，黄芪多糖组加入100μL含有50μg/mL黄芪多糖的RPMI-1640培养基，PLGA纳米粒组加入100μL含有与胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒中PLGA等量的PLGA纳米粒混悬液，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组加入100μL含有50μg/mL黄芪多糖的胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒混悬液。将细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48h。在培养结束前4h，每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h。培养结束后，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），根据OD值计算细胞增殖率，计算公式为：细胞增殖率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/空白对照组OD值×100%。实验结果显示，空白对照组的细胞增殖率为100%，黄芪多糖组的细胞增殖率为（125.6±5.3）%，PLGA纳米粒组的细胞增殖率为（110.2±4.1）%，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的细胞增殖率为（145.8±6.5）%。与空白对照组相比，黄芪多糖组、PLGA纳米粒组和胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的细胞增殖率均显著提高（P<0.05）。其中，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的细胞增殖率显著高于黄芪多糖组和PLGA纳米粒组（P<0.05）。这表明胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒能够显著促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，且其促进作用优于单独的黄芪多糖和PLGA纳米粒。在细胞因子分泌检测方面，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞培养上清液中白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）的含量。按照上述细胞增殖实验的分组和培养条件，将细胞培养48h后，收集细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。首先，将ELISA板用包被缓冲液稀释的捕获抗体包被，4℃过夜。次日，弃去包被液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。然后，加入封闭液，37℃孵育1h。孵育结束后，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。接着，加入稀释好的细胞培养上清液，37℃孵育1h。孵育结束后，弃去上清液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。再加入生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h。孵育结束后，弃去检测抗体，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。随后，加入亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）结合物，37℃孵育30min。孵育结束后，弃去结合物，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。最后，加入底物溶液，37℃避光孵育15-20min，加入终止液终止反应，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。根据标准曲线计算细胞培养上清液中IL-2、IL-4和IFN-γ的含量。检测结果表明，空白对照组的IL-2含量为（25.6±3.2）pg/mL，IL-4含量为（18.5±2.1）pg/mL，IFN-γ含量为（30.2±3.5）pg/mL。黄芪多糖组的IL-2含量为（45.8±4.5）pg/mL，IL-4含量为（25.6±3.1）pg/mL，IFN-γ含量为（45.6±4.2）pg/mL。PLGA纳米粒组的IL-2含量为（35.4±3.8）pg/mL，IL-4含量为（22.3±2.5）pg/mL，IFN-γ含量为（38.5±3.9）pg/mL。胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的IL-2含量为（65.4±5.2）pg/mL，IL-4含量为（35.8±4.0）pg/mL，IFN-γ含量为（60.2±5.5）pg/mL。与空白对照组相比，黄芪多糖组、PLGA纳米粒组和胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的IL-2、IL-4和IFN-γ含量均显著升高（P<0.05）。其中，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的IL-2、IL-4和IFN-γ含量显著高于黄芪多糖组和PLGA纳米粒组（P<0.05）。IL-2和IFN-γ是Th1型细胞因子，主要参与细胞免疫反应，能够增强T淋巴细胞的活性和杀伤能力；IL-4是Th2型细胞因子，主要参与体液免疫反应，能够促进B淋巴细胞的增殖和分化。上述结果表明，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒能够显著促进小鼠脾脏淋巴细胞分泌Th1型和Th2型细胞因子，调节Th1/Th2细胞平衡，增强机体的细胞免疫和体液免疫功能。4.1.2对小鼠腹腔巨噬细胞的作用为深入探究胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒对小鼠腹腔巨噬细胞的作用，本研究从巨噬细胞吞噬能力和一氧化氮（NO）分泌两个关键指标展开分析。巨噬细胞吞噬能力的检测采用经典的中性红吞噬实验。选取健康的SPF级昆明小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL4%无菌硫代乙醇酸钠溶液，以诱导巨噬细胞的聚集。3天后，小鼠腹腔注射2mL预冷的PBS缓冲液，轻轻按摩腹部，使腹腔内的巨噬细胞充分悬浮。然后，用注射器抽取腹腔液，转移至离心管中，1500r/min离心5min，弃去上清液，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL。实验分为空白对照组、黄芪多糖组、PLGA纳米粒组和胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组，每组设置6个复孔。空白对照组加入100μLRPMI-1640培养基，黄芪多糖组加入100μL含有50μg/mL黄芪多糖的RPMI-1640培养基，PLGA纳米粒组加入100μL含有与胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒中PLGA等量的PLGA纳米粒混悬液，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组加入100μL含有50μg/mL黄芪多糖的胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒混悬液。将细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。培养结束后，每孔加入50μL0.075%中性红溶液，继续培养3h。培养结束后，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min。然后，每孔加入150μL细胞裂解液（乙酸：乙醇=1:1），振荡10min，使细胞内的中性红充分释放。使用酶标仪在540nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），根据OD值计算吞噬指数，计算公式为：吞噬指数=实验组OD值/空白对照组OD值。实验结果显示，空白对照组的吞噬指数为1.00，黄芪多糖组的吞噬指数为（1.35±0.08），PLGA纳米粒组的吞噬指数为（1.20±0.06），胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的吞噬指数为（1.60±0.10）。与空白对照组相比，黄芪多糖组、PLGA纳米粒组和胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的吞噬指数均显著提高（P<0.05）。其中，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的吞噬指数显著高于黄芪多糖组和PLGA纳米粒组（P<0.05）。这表明胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，且其增强作用优于单独的黄芪多糖和PLGA纳米粒。巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，其吞噬能力的增强有助于更有效地清除病原体和异物，从而增强机体的免疫防御功能。在一氧化氮分泌检测方面，采用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量。按照上述巨噬细胞培养的分组和条件，将细胞培养24h后，收集细胞培养上清液，按照硝酸还原酶法试剂盒说明书进行操作。首先，将细胞培养上清液与等量的Griess试剂（A液：1%对氨基苯磺酸；B液：0.1%萘乙二胺盐酸盐，使用前等体积混合）混合，室温下避光反应10-15min。然后，使用酶标仪在540nm波长处测定各孔的OD值。根据亚硝酸钠标准曲线计算细胞培养上清液中NO的含量。NO是巨噬细胞活化后产生的一种重要的免疫效应分子，具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性。检测结果表明，空白对照组的NO含量为（10.2±1.5）μmol/L，黄芪多糖组的NO含量为（25.6±3.2）μmol/L，PLGA纳米粒组的NO含量为（18.5±2.5）μmol/L，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的NO含量为（35.8±4.5）μmol/L。与空白对照组相比，黄芪多糖组、PLGA纳米粒组和胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的NO含量均显著升高（P<0.05）。其中，胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒组的NO含量显著高于黄芪多糖组和PLGA纳米粒组（P<0.05）。这表明胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒能够显著促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO，增强巨噬细胞的免疫活性。NO的大量分泌可以通过多种途径发挥免疫调节作用，如直接杀伤病原体、调节炎症反应和促进免疫细胞的活化等，从而进一步增强机体的免疫功能。4.2佐剂活性研究4.2.1动物实验设计为了深入探究胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒作为抗原佐剂的活性，本研究选用6-8周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠，体重在18-22g之间，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养于温度为（23±2）℃、相对湿度为（50±10）%的环境中，自由摄食和饮水，适应环境1周后进行实验。将小鼠随机分为5组，每组10只，具体分组如下：对照组：注射0.9%生理盐水。抗原组：注射100μL含有10μg鸡卵清蛋白（OVA）的生理盐水溶液。黄芪多糖组：注射100μL含有10μgOVA和50μg黄芪多糖的生理盐水溶液。PLGA纳米粒组：注射100μL含有10μgOVA和与胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒中PLGA等量的PLGA纳米粒混悬液，其中PLGA纳米粒的制备方法与胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒相同，但不包裹黄芪多糖。纳米粒佐剂组：注射100μL含有10μgOVA和50μg黄芪多糖的胞内pH敏感型黄芪多糖PLGA纳米粒混悬液。采用肌肉注射的方式进行免疫，免疫程序为0周、2周和4周各免疫1次。在第0周免疫后的第7天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天，分别从每组小鼠的眼眶静脉丛采血，分离血清，用于检测血清中OVA特异性抗体水平。在第42天最后一次免疫后的第7天，处死小鼠，无菌取出小鼠的脾脏和腹股沟淋巴结，用于后续的免疫指标检测。4.2.2免疫指标检测淋巴结内树突细胞成熟度检测：采用流式细胞术检测腹股沟淋巴结内树突细胞（DC）的成熟度。将取出的腹股沟淋巴结剪碎，用PBS缓冲液冲洗，制成单细胞悬液。将单细胞悬液过70μm细胞筛，去除组织碎片。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。取100μL细胞悬液，加入荧光标记的抗小鼠CD11c、CD80、CD86抗体，4℃避光孵育30min。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次3min。将细胞重悬于500μLPBS缓冲液中，使用流式细胞仪检测CD11c^+CD80^+CD86^+双阳性树突细胞的比例。CD11c是树突细胞的特异性标志物，CD80和CD86是树突细胞成熟的标志性分子，其表达水平的升高表明树突细胞的成熟度增加。血清中OVA特异性抗体水平检测：采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中OVA特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。首先，将OVA用包被缓冲液稀释至10μg/mL，包被ELISA板，每孔100μL，4℃过夜。次日，弃去包被液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。然后，加入封闭液，每孔200μL，37℃孵育1h。孵育结束后，弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。接着，将不同稀释度的小鼠血清加入ELISA板中，每孔100μL，37℃孵育1h。孵育结束后，弃去血清，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG、IgG1和IgG2a抗体，每孔100μL，37℃孵育1h。孵育结束后，弃去抗体，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。最后，加入底物溶液，每孔100μL，37℃避光孵育15-20min，加入终止液终止反应，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。根据标准曲线计算血清中OVA特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体的含量。IgG1主要介导Th2型免疫反应，IgG2a主要介导Th1型免疫反应，通过检测IgG1和IgG2a抗体的水平，可以评估Th1/Th2免疫反应的倾向性。Th1/Th2免疫反应倾向性分析：采用ELISA法检测血清中Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）的水平。按照上述ELISA实验的步骤，将捕获抗体包被ELISA板，加入稀释好的小鼠血清和生物素标记的检测抗体，孵育、洗涤后加入亲和素-HRP结合物和底物溶液，最后测定各孔的OD值，根据标准曲线计算细胞因子的含量。通过比较Th1型细胞因子和Th2型细胞因子的水平，可以判断免疫反应的倾向性。小鼠淋巴细胞增殖能力检测：采用MTT法检测小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力。将取出的脾脏制成单细胞悬液，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。将细胞悬液接种