2026年发酵工程制药工菌种培育提取精制真题及答案

2026年发酵工程制药工菌种培育提取精制真题及答案一、单项选择题（每题1分，共20分。每题只有一个正确答案，请将正确选项字母填入括号内）1.青霉素产生菌Penicilliumchrysogenum的高产诱变育种中，最经典的物理诱变剂是（）A.紫外线（UV）B.亚硝酸C.甲基磺酸乙酯（EMS）D.5-溴尿嘧啶答案：A2.在菌种保藏的“液氮超低温保藏法”中，起关键保护作用的冷冻保护剂通常是（）A.10%甘油B.0.9%NaClC.15%蔗糖D.0.1%Tween-80答案：A3.发酵过程中，溶解氧（DO）突然降至零，最可能的原因是（）A.搅拌轴封漏气B.菌体耗氧速率（OUR）大于供氧速率（OTR）C.温度控制器失灵D.泡沫电极失效答案：B4.下列关于“代谢曲线”中“二次生长”现象的描述，正确的是（）A.菌体同时利用葡萄糖和乳糖B.菌体先利用乳糖后利用葡萄糖C.菌体先利用葡萄糖后利用乳糖D.菌体对两种碳源均不利用答案：C5.在“原生质体融合”育种中，去除细菌细胞壁的酶制剂首选（）A.溶菌酶B.纤维素酶C.蜗牛酶D.蛋白酶K答案：A6.红霉素生物合成基因簇中，负责糖基延伸的模块属于（）A.PKSloadingdomainB.PKSextensionmoduleC.NRPSmoduleD.TailoringgeneeryF答案：B7.采用“响应面法”优化培养基时，最合理的实验设计是（）A.单因素轮换B.正交试验C.Box-Behnken设计D.均匀设计答案：C8.在“高密度发酵”策略中，控制比生长速率μ常用的反馈底物是（）A.甘油B.葡萄糖C.乳糖D.甲醇答案：D9.下列关于“连续发酵”的叙述，错误的是（）A.稀释率D可大于μmaxB.存在“洗出”临界点C.稳态时菌体浓度保持恒定D.产物形成可为生长偶联型答案：A10.采用“双水相萃取”分离碱性蛋白酶时，最常用的高聚物/盐体系是（）A.PEG4000/(NH4)2SO4B.PEG4000/磷酸钾C.PEG6000/MgSO4D.PEG20000/NaCl答案：B11.在“大孔吸附树脂”精制万古霉素时，起决定作用的参数是（）A.树脂粒径B.比表面积与孔径匹配C.交联度D.功能基团密度答案：B12.采用“超滤”去除发酵液中热原质时，截留分子量（NMWCO）一般选择（）A.1kDaB.10kDaC.100kDaD.1000kDa答案：B13.在“离子交换”层析中，若目标蛋白等电点pI=7.5，缓冲液pH=6.0，则目标蛋白（）A.带正电，可被阳离子交换剂吸附B.带负电，可被阴离子交换剂吸附C.不带电，不吸附D.沉淀答案：A14.下列关于“亲和层析”洗脱策略的叙述，正确的是（）A.仅能用竞争性配体洗脱B.仅能用pH梯度洗脱C.竞争性配体或pH/离子强度梯度均可D.必须加热洗脱答案：C15.采用“溶媒萃取”分离青霉素时，最适宜的pH范围是（）A.2.0–2.5B.4.5–5.0C.7.0–7.5D.9.0–9.5答案：A16.在“真空冷冻干燥”菌种制剂中，常添加的复合保护剂是（）A.脱脂乳+海藻糖B.葡萄糖+NaClC.甘油+EDTAD.甘露醇+SDS答案：A17.采用“代谢通量分析（MFA）”时，必需的前提条件是（）A.基因组尺度模型B.准稳态假设C.酶动力学参数D.转录组数据答案：B18.在“CRISPR-Cas9”敲除链霉菌抗生素负调控基因时，最常用的PAM序列是（）A.5'-NGG-3'B.5'-NGA-3'C.5'-NGC-3'D.5'-NNGRRT-3'答案：A19.下列关于“发酵尾气质谱（FT-ICRMS）”在线检测的叙述，错误的是（）A.可实时计算RQB.可检测乙醇、丙酮等挥发物C.需高温裂解样品D.响应时间<5s答案：C20.在“GMP”车间进行菌种传代，最多允许的传代次数为（）A.1代B.3代C.5代D.无限制答案：B二、多项选择题（每题2分，共20分。每题有两个或两个以上正确答案，多选、少选、错选均不得分）21.下列哪些方法可用于“菌种退化”的分子水平检测（）A.RAPDB.qPCR检测抗生素合成基因拷贝数C.RNA-seqD.16SrDNA测序E.菌落直径测定答案：ABC22.在“发酵罐放大”中，必须保持相似的参数有（）A.体积溶氧系数kLaB.单位体积功率P/VC.搅拌雷诺数ReD.表观气速vsE.罐高径比H/D答案：ABE23.下列属于“次级代谢产物”特征的有（）A.生长期与生产期分离B.受严密调控C.通常由PKS或NRPS合成D.对菌体生长必需E.合成途径受磷酸化调控答案：ABCE24.在“连续离心”收集菌体时，影响分离因数Σ的因素有（）A.转鼓转速B.转鼓直径C.菌体密度D.菌体粒径E.进料流量答案：ABCD25.采用“膜过滤”除菌时，造成“膜污染”的主要机制有（）A.滤饼层形成B.孔堵塞C.吸附污染D.浓差极化E.酶解答案：ABCD26.下列哪些操作可提高“大孔树脂”对万古霉素的吸附容量（）A.升高pH至8.0B.降低进料盐浓度C.降低温度至4℃D.提高流速E.采用粒径更小树脂答案：BCE27.在“蛋白质层析”中，可引起“拖尾”现象的原因有（）A.柱床干裂B.样品过载C.缓冲液pH远离pID.流速过快E.树脂粒径分布过宽答案：ABDE28.下列关于“冻干曲线”中“一次干燥”的描述，正确的有（）A.冰晶升华B.搁板温度应低于共晶点C.真空度需维持20–50PaD.水分含量降至5%E.可停止冻干答案：ABC29.在“代谢工程”中，提高前体供应的策略有（）A.过表达限速酶B.敲除旁路途径C.引入外源转运蛋白D.降低产物降解酶E.提高碳源浓度答案：ABCD30.下列属于“GMP”对菌种库管理要求的有（）A.三级库系统（原始-主-工作）B.每批全基因组测序C.100%克隆纯度验证D.每批留样≥3倍量E.双人双锁管理答案：ACDE三、填空题（每空1分，共30分）31.青霉素生物合成限速酶是________，其辅因子为________。答案：ACV合成酶；ATP-Mg2+32.链霉菌接合转移常用供体菌为________，其选择性标记为________。答案：E.coliET12567；安普霉素抗性（aac(3)IV）33.原生质体融合后，再生培养基需添加________以稳定细胞膜。答案：蔗糖（0.3–0.5M）34.在“代谢通量分析”中，胞内代谢物稳态假设的数学表达式为________。答案：dX/dt=S·v=035.计算kLa的“动态法”公式为________，其中C表示________。35.计算kLa的“动态法”公式为________，其中C表示________。答案：kLa=(dC/dt+OUR)/(C−C)；与气相平衡的溶解氧浓度答案：kLa=(dC/dt+OUR)/(C−C)；与气相平衡的溶解氧浓度36.采用“双水相萃取”时，相比R的定义为________。答案：R=VT/VB（上相体积/下相体积）37.离子交换容量单位通常表示为________。答案：mmol·mL−1湿胶38.冻干制剂水分限度一般控制在________%以下。答案：339.连续发酵“洗出”临界稀释率Dcrit=________。答案：μmax40.在“CRISPR-Cas9”编辑中，若需引入点突变，需提供的修复模板为________。答案：单链寡核苷酸（ssODN）41.红霉素生物合成大环内酯环的碳架来源于________单位。答案：丙二酰-CoA（6个）与甲基丙二酰-CoA（1个）42.采用“溶媒萃取”分离青霉素时，有机相常用________，并添加________防止降解。答案：乙酸丁酯；1%磷酸缓冲43.在“超滤”中，通量J的表达式为________，其中ΔP为________。答案：J=ΔP/(Rm+Rf+Rc)；跨膜压力44.万古霉素层析常用“疏水层析”时，配基为________。答案：丁基（Butyl）45.发酵尾气中RQ=________，若RQ>1.2表示________。答案：CO2产生速率/O2消耗速率；存在厌氧代谢或C源过剩46.在“代谢工程”中，提高NADPH供应常过表达________酶。答案：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Zwf）47.采用“高密度发酵”时，控制μ的“指数-补料”公式为________。答案：F(t)=(μ·X0·V0)/(Yx/s·Sf)·e^(μt)48.大孔树脂再生时，常用________%乙醇或________%NaOH。答案：70；249.在“GMP”车间，菌种传代记录需保存至产品有效期后________年。答案：150.采用“FT-IR”快速检测菌体油脂含量时，特征峰位于________cm−1。答案：1745（酯C=O）四、简答题（每题8分，共40分）51.简述“紫外线诱变”结合“理性筛选”提高青霉素产量的实验流程，并指出关键控制点。答案：（1）孢子悬液制备：无菌生理盐水洗脱，玻璃珠打散，过滤，血球计数板调浓度至10^7mL−1。（2）UV诱变：15W紫外灯30cm，照射0–120s，致死率控制在70–80%（平板计数法）。（3）暗修复：冰浴避光1h，防止光复活。（4）理性筛选：①采用“琼脂块法”+“牛津杯法”双重筛选，以金黄色葡萄球菌为指示菌，直径>25mm保留；②挑取高产株进行96孔板发酵复筛，HPLC测定青霉素G含量，以原始菌为对照，提高>20%进入稳定性测试；③传代5次，青霉素产量下降<10%视为稳定。关键控制点：①诱变剂量需梯度预实验；②严格避光操作；③筛选模型需与生产条件一致，采用乳糖-玉米浆培养基；④设负对照，排除污染。52.说明“连续发酵”与“补料分批发酵”在青霉素生产中的优缺点，并给出选择依据。答案：连续发酵优点：①设备利用率高；②产品质量均一；③便于自动化。缺点：①菌种退化风险大；②“洗出”临界严格；③设备投资高；④GMP验证复杂。补料分批优点：①操作弹性大；②可延长生产期；③菌株稳定性易控制；④GMP合规性好。缺点：①罐利用率低；②批次差异；③下游批处理量大。选择依据：若菌株遗传稳定、产物为生长部分偶联、市场需求连续且量大，可选连续发酵；若菌株易退化、产物为次级代谢、法规要求高，则选补料分批。青霉素属于次级代谢，菌株经多次诱变稳定性有限，工业上仍以补料分批为主。53.写出“大孔吸附树脂”精制万古霉素的完整工艺步骤，并指出各步关键参数。答案：（1）预处理：发酵液碱化至pH8.0，0.2μm陶瓷膜除菌体，得澄清滤液。（2）吸附：滤液稀释至效价5000umL−1，上柱SP825树脂（柱径高比1:8），流速1BVh−1，温度15℃。（3）洗涤：2BV0.1MNaCl+10%乙醇，去除色素及杂蛋白。（4）洗脱：2BV60%乙醇含0.05MHCl，流速0.5BVh−1，收集效价>20000umL−1段。（5）脱盐：SephadexG-25，0.01MHCl洗脱，去除无机盐。（6）浓缩：纳滤截留分子量500Da，浓缩5倍。（7）冻干：−40℃预冻2h，一次干燥−10℃、20Pa，24h，二次干燥25℃、5Pa，6h，得白色粉末，总收率>75%，HPLC纯度>95%。54.解释“超滤”过程中“浓差极化”与“膜污染”的区别，并给出三种缓解措施。答案：浓差极化是可逆的溶质在膜面富集形成的浓度梯度，随操作条件改变可恢复；膜污染是不可逆的吸附、堵塞及滤饼形成，需化学清洗。缓解措施：①提高剪切：采用错流≥3ms−1或插入旋转盘；②降低通量：临界通量Jc下操作，J≤0.8Jc；③表面改性：引入PEG或两性离子涂层，降低蛋白吸附；④脉冲反冲：每10min反冲30s；⑤预处理：发酵液先经0.1μm微滤去除大颗粒。55.利用“代谢通量分析”计算：在稳态下，青霉素G合成途径中，已知葡萄糖比消耗速率qs=0.20gg−1h−1，菌体得率Yx/s=0.45gg−1，CO2比生成速率qCO2=0.22gg−1h−1，求用于青霉素合成的碳流量占葡萄糖碳的百分比。（假设葡萄糖完全氧化为CO2的碳回收率为100%，青霉素G分子量334gmol−1，含碳量54.8%，碳摩尔质量12gmol−1）答案：（1）碳摩尔流量：qs,C=0.20/180×6=0.00667molCg−1h−1。（2）菌体碳流量：假设菌体含碳50%，则qx,C=(0.20×0.45×0.5)/12=0.00375molCg−1h−1。（3）CO2碳流量：qCO2,C=0.22/12=0.0183molCg−1h−1。（4）碳平衡：qs,C=qx,C+qCO2,C+qpen,C得qpen,C=0.00667−0.00375−0.0183=−0.0154molCg−1h−1（负值不合理，说明CO2数据含呼吸+产物降解，需修正）。修正：实际CO2仅由呼吸产生，设用于青霉素的碳占x，则0.00667(1−x)=0.00375+0.0183(1−x)解得x=0.12，即12%的葡萄糖碳流向青霉素合成。五、综合应用题（每题15分，共30分）56.某制药公司拟采用“CRISPR-Cas9”技术敲除红霉素产生菌Saccharopolysporaerythraea中负调控基因eryR，并插入强启动子ermEp激活生物合成基因簇。请设计完整技术路线，包括：56.某制药公司拟采用“CRISPR-Cas9”技术敲除红霉素产生菌Saccharopolysporaerythraea中负调控基因eryR，并插入强启动子ermEp激活生物合成基因簇。请设计完整技术路线，包括：（1）sgRNA设计与脱靶评估；（2）Donor模板构建；（3）接合转移与筛选；（4）高产验证与稳定性考察；（5）GMP合规性文件清单。答案：（1）sgRNA设计：①在eryR（GeneID:SECERY_5632）CDS区选取5'-GGCAGCGGTGAGCGACGCCCGG-3'，含PAM5'-TGG-3'，GC%=65%；②使用CHOPCHOP在线工具评估脱靶，设定阈值：脱靶位点≤2错配且PAM=NGG，结果无脱靶；③合成sgRNA片段并克隆至pCRISPomyces-2的BbsI位点，测序验证。（2）Donor模板构建：①左右同源臂各1.5kb，以NRRL23338基因组为模板扩增；②中间插入ermEp（306bp）+eryR起始密码子ATG，形成“ermEp-eryR”融合，使eryR由强启动子驱动；②中间插入ermEp（306bp）+eryR起始密码子ATG，形成“ermEp-eryR”融合，使eryR由强启动子驱动；③全序列合成并克隆至pUC57，测序正确后作为供体模板。（3）接合转移：①将编辑质粒转化E.coliET12567(pUZ8002)，挑单克隆至LB+Km50μgmL−1，30℃过夜；②与S.erythraea孢子按10:1比例混合，涂布MS平板，30℃培养16h；③覆盖萘啶酮酸（25μgmL−1）+安普霉素（50μgmL−1），30℃再培养5d；④挑取接合子，PCR鉴定（引物eryR-F/R+ermE-R），预期条带2.1kb，野生型1.8kb，阳性率约30%。（4）高产验证：①摇瓶发酵：R5培养基，30℃、220rpm、7d，HPLC测红霉素A（ErA），波长215nm，流动相乙腈-0.05MKH2PO4（45:55）；②结果：编辑株ErA产量为1.8gL−1，较野生型（1.1gL−1）提高64%；③稳定性：传代5次，产量下降<5%，PCR验证基因型无回复。（5）GMP合规文件：①菌种历史溯源报告（COA）；②基因编辑记录（sgRNA、Donor序列、测序原始数据）；③表型与基因型稳定性研究报告；④宿主残留E.coliDNA检测（qPCR<10ngg−1）；⑤编辑菌种库（MCB/WCB）建立记录；⑥风险评估报告（脱靶、毒力、抗生素耐药水平转移）。57.某工厂采用50m³发酵罐生产青霉素G，原工艺：搅拌功率P=90kW，空气流量Q=25m³min−1（标准状态），罐压0.12MPa，温度25℃，初