动物细胞培养技术小鼠脾脏细胞

动物细胞培养技术

【试验目的】

1.学习掌握细胞培养日勺基本原理以及详细措施，并对小鼠脾细胞进行原代培养：

2.掌握无菌操作的I详细过程及无菌操作台的使用；

3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及措施：

学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率：

【试验原理】

（-）.动物细胞培养技术

动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞,在体外模拟动物体内时生理

环境,在无菌,合适温度和一定的营养条件下，使之生存,生长和繁殖,并维持其构

造和功能的措施。

细胞培养的意义：（1）.具有其他生物技术无可比拟的长处；（2）.培养条件易变化和控制，便

于单因子分析；（3）.便于人们直接对细胞内构造、细胞生长及发育等过程的观测；（4）.在生

物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已

被广泛应用

细匏培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距

离；（2）.观测到的成果有时难以对的反应机体内的状况；（3）.细胞培养得到的产物少。

培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营

养条件和培养基质等。

细胞培林的措施：1.原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直

至第一次传代为止。2.传代培养：当培养的细胞增殖到达一定密度之后，则需要再做培

养，即将培养的细匏分散后，从一种容器以1:2或其他比例转移到另一种容器中的扩大培

养。

原代细胞培养的措施有：单层细胞培养法和组织块培养法

细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化一一接种——观测

悬浮生长细胞H勺传代：A.直接传代B.离心传代

单层培养细胞的I生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期

培养细胞的形态分型：A.贴附.B.悬浮型

（二）,细胞死活鉴定

细胞生死状态口勺鉴别措施重要是化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上重要存在一下差异：

①细胞膜通透性H勺差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用,

只容许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增长。基于此，发展出了

以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤辞红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙咤或澳化乙咤等为染料鉴

别细胞生死状态H勺措施，上述染料能使死亡细胞着色，而活纽胞不被着色。此外，应用植

物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细

胞因K原生质的选择透过性已遭破坏，故与高法透压溶液接触时不产生质壁分离.

②代谢上H勺差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能

力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧

光素二苯甲酰酯等酯化日勺荧光素鉴别细胞生死状态的措施，上述酯化的荧光素亲脂性提高，

轻易被细胞吸取进入，活细胞内的酯的具有较强H勺活性，可将酯化的荧光素分解而释放出

能发荧光I句灵光索，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，灵光显微镜卜显

示有明亮的绿色或黄绿色荧光：而死亡细胞内口勺酯海因失去活性，不能分解酯化口勺荧光素，

荧光显微镜下显示不发光。此外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基

蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚

甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；

死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处

在氧化态，故展现蓝色或淡蓝色。

（三）.血球计数板的使用

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台

较宽，其中间又被一短桢槽分隔成两半，每个半边上面各有一种方格网（如图3）。每

个方格网共分9大格，其中间的一大格（又称为计数室）常被用作微生物的计•数。计数

室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格乂提成25个小方

格；另一种是一种大方格提成25个中方格，而每个中方格又提成16个小方格。不过

不管计数室是哪一种构造，它们均有一种共同特点，即每个大方格都由400个小方格

构成（图4）。

每个大方格边长为Imn,则每一大方格的面积为lmm2,每个小方格的面积为1/

400mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm,因此每个计数室

（大方格）的体积为o.Imm3,每个小方格的体积为1/4000丽3。使用血球计数板直接计

数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物H勺数量，再换算成每亳升菌液（或每克

样品）中微生物细胞口勺数量。

图1血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）

并静置吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eyendorf管，以3000转/分

离心l-2mino

3）.培养脾细胞：

从超净工作台中区塑料培养皿一种，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml,并在皿上做记

号，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内打开弃去上清液，用“枪（200

R1）”吸取塑料皿中的培养液400ul,加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管

底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37C,

5%的二氧化碳培养箱中培养o

1）（二）.台盼蓝法坚定细胞的死活

2）试剂配制：

3）用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。

4）细胞悬液制备：

5）将生长有贴壁型细胞H勺培养瓶（皿）中的培养液倒入洁荐试管中，向培养瓶（皿）中

加入0.25与肤蛋白的/0.02%EDTA混合消化液厂2ml,静置3-5min,待见到细胞变圆，

彼此不连接为I匕弃去混合消化液并将上述试管中日勺培养液倒回培养瓶中，用滴管胫

轻吹打细胞，制成细胞悬液。

6）染色制片：

7）取0.5ml细胞悬液放于洁净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制

成临时装片，镜检。

染色成果：

死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

1）（三）.血球计数板进行细胞计数

2）染色计数:

3）取上述环节二所制备0.511细胞悬液放于洁净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液,

混合2-5min,滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜而上，便悬液

自然充斥计数板小室（注意：不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加：在一般光

镜10（物镜下计数四个人格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。

根据染色成果计算活细胞率:

根据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细

胞存活率：

活细胞率皿二9*—

每亳升液体中细胞H勺数=每个大方格中H勺细胞数量*10000*稀释倍数

【试验成果】

从培养箱拿出的培养基

在倒置显微镜下可以清晰的看到培养的细胞，细胞呈圆形，番状规则，汇集在一起，有立

体感。

10倍物镜

通过活细胞染色后，活细胞的细胞膜具有选择透过性，染料不能进入细胞，因此细胞未

被染成蓝色

左上右上中间左下右下

活细胞数53566

死细胞数2626282529

细胞总数3129333135

细胞总数•死细胞数

活细胞率（％）=xlOO%

细胞总数

细胞存活率=C5+3+5+6+6)/(31+29+33+31+35)*100%=15.72%

每毫升液体中细胞的数：(31+29+33+31+35)*5*10000=7950000

【试验成果分析】

1.培养基刚刚拿出来的时候是无色的，过了i段时间后变成粉红色

2.对于小鼠脾脏细胞的培养成果（1）.若所得日勺培养基展现浑浊状态，则阐明有杂菌日勺

侵入。（2）.若所得培养基没有明显的颜色变化，则很有也许培养基中未接入细胞或

接入的细胞很少，细胞未生长繁殖。（3）.若所得口勺培养基透明度高，颜色微黄则证

明细胞培养成功。

3.生长状态良好的细胞，细胞膜完整清晰，细胞质透明，颗粒状物质少细胞核区域明

显。而死细胞具有空泡，颗粒状物质多，细胞透明度下降，没有立体感，核区域模糊，

体积更大

4.活细胞边缘较明显，由于细胞膜仍然具有选择透过性，染料无法通过细胞膜，因此展

现透明无色

死细胞由于细胞膜已经失去选择透过性，染料进入细胞内，将细胞染色，且死细胞的边缘

不明显。

本次试验，我们组所得的细胞存活率较低，分析原因也许是：无菌操作时试验操作不规范，

导致细胞被破尿，影响了试验成果，也有也许是由于染色时间过长，细胞膜的通透性遭到

破坏，部分细胞死亡。

【试验注意事项反思】

1.对小鼠进行消毒时，一定要严格进行，防止沾染杂菌，手也必须严格消毒。

2.严格进行无菌操作，防止杂菌污染，影响试验成果。

3.动物细胞培养使用的所有券皿、用品、溶液等必须通过严格消毒或除菌处埋，才能进

超净工作台中使用，整个忒验过程都要有无菌操作打勺概念，操作在酒精灯附近进行，

防止细胞被污染。

4.取小鼠脾脏细胞时要小心灌慎，既不能太用力将脾扎烂，也不能扎H勺太轻由于得到H勺

脾细胞太少，起初我们组扎的很轻得到的细胞很少，给老师看过之后，重新扎脾脏，

得到了较多口勺细胞。

5.在超净工作台进行操作时，试验刚开始时自己不留心将手臂伸进很大一部分，在老师

训导之后才懂得只需将手冲进很小一部分，不能将整个手臂伸进去以免导致污染，带

入杂菌.

6.注意染色的时间，时间太长也许会导致细胞膜的通透性遭到破坏，损坏细胞。

7.在用血球计数板技术时，计上不计下，计左不计右。

滴加细胞悬液时，应用滴管将悬液来回吹吸使搅拌均匀，以此防止计数时由于局部浓度太

高导致多种细胞连结在一起，影响成果的观测。此外，计数时要十分谨慎，由于是要在计

数的成果上乘以10000,虽然是很小口勺偏差也会导致试验成果的大不相似。计数时对于连

在•起的细胞要格外注意

做试验必须严格按照试验室H勺规定，注意无菌操作环境，按照老师H勺指令操作，这样才能

使试验更精确口勺完毕，获得很好的成果。此外，对于试验某些时间口勺精确把握也非常重要，

时间H勺长短对于试验成果也许有较大的影响，后来一定要注意这首先。

【作业】

1.克制肿瘤细胞增殖药物的筛选措施

(1).应用结晶紫染色测定怯筛选抗肿瘤药物

结晶紫染色测定法是一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定措施，其原理是结晶紫染色

可通过细胞的特定摄生法而选择性的被细胞吸取，死亡的细胞几乎不吸取结晶紫染料，而

被核吸取的结晶紫染料又可被有机溶媒提取，通过测定提取液口勺光密度值，就可测定活细

胞的数量。近几年通过不停改善，结品紫染色法已能合用于大量抗肿痛药物H勺药敏测定，

具有敏捷度岛，重现性好的特点。

(2)应用噬菌体筛选

已确证多种病毒能引起动物肿瘤,噬菌体是细菌的病毒,与肿瘤病毒相似,噬菌体的DNA

也可整合到细菌染色体上，随细菌DNA复制分裂并遗传至子代细菌，不引起细菌裂解但可

引起细菌部分生物学性状发生变化。有些物质可使前噬菌体DNA从溶原性细菌染色体上脱

落，复制合成并释放完整口勺噬菌体，可使敏感的细菌感染裂解一一诱导作用。有些有诱导

作用H勺物质常同步具有抗肿瘤的作用。

(3)细胞水平筛选抗肿瘤药物

细胞生物学、分子药理学、分子生物学、生物化学等学科的发展为药物筛选提供了新的方

向。细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确和大规模筛选等长

处。目前，在细胞水平上对抗肿瘤天然药物的筛选重要是采用选用几种肿瘤细胞系，以培养

细胞为试验模型，用结晶紫染色测定法、四甲基嘎理蓝(VTT)法、SRB法等检测天然药物及

其提取物或单体的体外抗肿痛作用。

温斌等在研究腹腔注射灰树花提取成分对小鼠免疫功能的影响时，采用乳酸脱氢酹法、结晶

紫染色法、MTT生物活性测定法等对小鼠脾自然杀伤(NK)细胞和腹腔巨噬细胞进行检测，

成果表明灰树花乙醇沉淀物(ET2Pre)和RNA提取物明显增高了小鼠脾NK细胞杀伤活性、巨

噬细胞吞噬功能及肿瘤坏死因子(TNF)2a、白细胞介素(IL)21的产生水平。赵春玲

等采用结晶紫染色法和MH比色法测定了白眉蝮蛇去整合素(rAdinbitor)对人肝癌细

胞系

SMMC27721细胞向纤连蛋白(FN)黏附的影响，以及对已黏附于FN上的SMMC27721细胞的影

响。试验证明，rAdinbitcr可以剂量依赖性地克制SMMC27721细胞在FN上的黏附，促

使已黏附的SMMC27721细胞脱落;并IL可以剂量依赖性地克制SMMC27721细胞的增殖并旦诱

导其调亡。

(4)端粒酶活性为作用靶点箭选抗肿瘤的药物

端粒是染色体特殊构造，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋

白反转录酶，由R\A和蛋白质构成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发目前正

常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒前的活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人IKJ肿瘤细

胞株中都体现了很高口勺活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有亲密的关系，有

也许成为肿瘤治疗的靶点

(5)以DNA拓扑异构酶为靶点筛选天然抗肿瘤药物

DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerases)通过DNA链口勺切割、转移和再连接来变化DNA的

拓扑构造。DNA拓扑异构酶在细胞代谢过程中起着极其弟耍的作用，如DNA复制、基因转

录、DNA重组和有丝分裂等。抗癌药物喜树碱(camptothecin)及其衍生物的作用靶点

是真核生物DNA拓扑异构酶1,呼'11定类化合物、鬼臼毒素类化合物、异黄酮类化合物、多柔

比星(doxorubicin)等则作用于真核生物DNA拓扑异构酣II。这些药物可通过DNA拓扑异

构酷【、II引起DNA双螺旋的一条或两条链H勺断裂从而导致肿瘤细胞的死亡。

李运曼等通过DNA解螺旋试验评价紫草素对拓扑异构酶I催化活性口勺克制作用。成果显示,

紫草素可明显克制拓扑异构防【的J解螺旋活性，并且可以克制人白血病K562细胞日勺增殖。

汤涛等通过试验初次揭示了鸦胆子油乳可以特异性地克制拓扑异构酎II的活力，而对拓扑异

构酶【没有影响，对DNA也没有直接作用.这些现象揭示拓扑异构酶II是鸦胆子油乳细胞

内作用靶点之一

(6)作用微管蛋白的天然抗肿瘤药物的筛选措施

微管(microtubule)是由aB微管蛋白异二聚体聚合而成的管状聚合物，是真核细胞骨架的

重要构成部分。微管参与许多细胞功能，包括维持细胞形态、细胞内运送、鞭毛和纤毛的

运z/、染色体运动和细胞分裂等。无论是增进微管蛋白聚合、稳定已形成的微管类约物，

还是以克制微管蛋白聚合类药物都通过影响肿瘤细胞"勺有丝分裂过程,使其生长受到克制。

因此，微管已成为肿痛的临床治疗H勺有效靶点。KLEIN等用紫杉醉和

discodermolide（1990年从海绵动物Discodermiadissoluta中分离得到的多羟基内酯

化合物）分别作用A549肺癌细胞，成果显示它们均能迅速导致有丝分裂的异常。深入的研

究发现discodermolide和紫杉醇联合作用品有明显的协同作用。1999年MOOBERRY等从

海绵Cacospongiamycofijiensis,Fasciospongiarimosa和

Hyattellasp.中均发现了新型增进微管稳定化合物laulima］ide和

isolaulimalideoLaulimalide可以有效增进微管蛋白的聚合,并且与紫杉醇诱导形成的微

管蛋白聚合体相似,但促聚合作用低于紫杉醇。用laulimatide处理A210细胞可导致剂

量依赖性细胞微管网H勺重组和异常纺锤体的形成，并能诱导染色体的卷绕和多核仁的形

成。

（7）应用调整细胞信号传导通路筛选措施

近年来，部分抗肿瘤药物的研发已从老式的细胞毒药物转移到针对肿瘤细胞内信号传导通路

/、］新型抗肿瘤药物。正常细胞和肿瘤细胞在多种信号传导通路的关键组分间存在巨大

差异，因此靶向这些组分的抗肿痛药物具有高选择性、高效、任毒日勺特性。目前，药物干预

肿瘤细胞信号通路重要是通过环腺喋吟核甘酸2蛋臼激酚A通路、酎联受体信号通路、磷

脂酷肌静信号通路.钙和钙调蛋白通路等几种通路实现.

SAMEL等报道，芥麦（buckwheat）提取物中一种类似于金丝桃慈酮H勺物质可以克制多种蛋

白激地的活性，克制内皮生长因子和【ns的受体酪氨酸激酎和苏氨酸激酎的活性。李宝

元等在观测中药白龙片对人胃癌MGC8023细胞不一样周期时相癌基因c2H2ras、c2myc和

抑癌基因Rb、P53.P21体现H勺影响时，发现PKC2a基因体现克制与c2H2ras、c2myc的体现

克制相［以，衣明两者之间存在因果关系。

（8）应用肿瘤新生血管生成克制的筛选措施

肿瘤H勺新生血管是实体瘤生长、浸润和转移的一种重要原因,它为肿痛的生长提供必需的营

养和氧气。在其生成过程中血管内皮生长因子(VEGF)以及酪氨酸激酶受体(VEGFR)具有极

其重要的作用。目前已发既有许多天然药物及其有效成分可以通过多种途径来克制肿瘤新

生血管的生成。

潘子民等发现人参皂首Rg3经处理后，荷痛SCO小鼠无腹腔积液形成，腹腔中肿块散播较

少。试验组肿瘤组织中VEGFmRNA的体现量、VEGF蛋白体现量却MVD明显低于对照组,从而

认为Rg3通过下调肿瘤组织中VEGFmRNA和VEGF蛋白的体现量来阻滞肿瘤血管的生成，克制

肿痛的转移。姜晓玲等通过比较试验发现，10Pg­mL爸松仁注射液处理后，很少有新生

血管生成，血管生长也很快进入衰退期。因此认为慈以仁注射液时肿瘤血管生成有明显克制

作用。

(9)天然药物诱导肿瘤细胞调亡的筛选

细胞调亡(apoptosis)是基因调控下的细胞积极死亡，这一过程又称程序化细胞死亡

(Programmedcelldeath)。细胞调亡伴伴随细胞质浓缩，细胞核崩裂，微粒消失，

细胞膜皱缩,染色质浓缩继而解体,DNA裂成180bp的倍增片段,最终形成调亡小体。细胞

增殖、分化和调亡调整系统的失常将导致细胞恶性生长分裂。研究发现，许多抗肿瘤药物均

通过克制肿瘤细胞增殖，诱导肿痛细胞调亡来发挥抗肿痛件用.

贾彩云等研究表明，蟾酥灵处理过的K562细胞其生长受到明显克制，形态学展现出经典的调

亡特性性变化，即核染色质凝集、碎裂、延核周围分布，胞膜内陷将变性的细胞内容物包裹

成调亡小体，形成DNA电泳的梯状带。因此蟾酥灵能有效诱导白血病K562细胞调亡。陈洁

等通过试验证明竹红菌甲素(上ypocrel1inA,HA)可以诱导人黑色素瘤(A23752s2)细胞产

生调亡，并诱导细胞周期停滞在S期。还能使细胞周期蛋白CyclinBlH'JmRNA体现增长。

(10)天然药物诱导细胞分化的筛选

恶性肿痛细胞在形态、功能等方面都类似于未分化H勺胚胎细胞。诱导分化治疗是指通过药

物诱导，使肿瘤细胞向正常细胞转化，同步对正常细胞无杀伤作用，并且很少有骨髓克制

等不良反应。诱导肿瘤细胞分化及逆转是目前肿瘤分子与物学中一种重要的研究领

域。

钱军等在研究榄香烯乳对体外培养人肺癌细胞株超微构造的影响时发现,试验组癌细胞给药

后出现表面微绒毛减少,细胞核和细胞质比例下降,核周围光滑,切迹浅,核仁常为单个,常染

色质减少，异染色质增多等现象；而阳性对照组癌细胞除破碎坏死外，仍显示较高口勺恶性行

为。上述体现提醒榄香烯乳在30ug-mL的浓度下对体外肺癌细胞具有一定I向诱导作用。

CHEN等报道茯苓中的多糖片段可使66.6%人淋巴瘤U937细胞和49.4%人早幼粒白血病

HL260细胞诱导分化成为成熟口勺单核细胞和巨噬细胞，使其体现出正常口勺生理功能并且体现

标志性表面抗原CDllb.CD68和CD14，同步又检测到IFN2丫和TNF2。水平升

高。（9）结束语

伴随分子生物学和分子肿瘤学口勺发展，人们对肿瘤细胞恶化过程中许多新靶点有了深入的理

解，并且针对这些靶点研究和开发了许多新的天然抗肿痛药物。近年来，许多天然抗肿瘤

药物已经开始采用较本来愈加理想的药物筛选系统,并且针对作用机制H勺药物筛选和药物设

计在一定程度上得到了发展。由于肿瘤自身是一种多基因的疾病，目前肿瘤的治疗仍是

种难题,因此尚需要科研工作者不停地努力来发现和设计出愈加有效低毒、高选择性的抗肿

瘤药物。

（1）诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物筛选措施：

（2）可以运用流式细胞仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析，凋亡初期细胞因体积

减小，胞浆及染色质固缩，卜'SC变小，SSC增大，凋亡晚期细胞FSC,SSC均变小：用

流式细胞仪也可以根据D\A含量不一样，从细胞群体中鉴别出凋亡细胞：此外，细胞

凋亡受基因调控，有赖于某些蛋白质H勺合成，用流式细胞仪可同步检测出凋亡细胞H勺

FSC/SSC及DNA/蛋白质，进行多参数分析以研究不•样的凋亡诱导作用机制。

化疗是肿瘤治疗的一种重要措施，新口勺抗肿瘤药物也不停地涌现。国内在上个世纪90年代

上市的抗癌药物中化学合成药米托慈醍、羟基胭和顺粕等少数几种抗癌药物，通过与DM

分子结合克制核酸合成引起细胞死亡，此类药物称之为细胞周期非特异性药物。本研究选

用米托诲:醍、顺伯、羟基喜树碱、高三尖杉酯碱诱导Jurkat细胞凋亡，并通过Annexin

V/PI法检测细胞凋亡及细胞死亡比例，分析不一样作用时间以及不一样药物浓度对

Jurkat细胞凋亡的）影响。材料和措施

材料

Jurkal细胞系由本试验室保留。顺柏（CDDP）为齐鲁制药有限企业产品、羟基喜树碱

（HCPT）为黄石飞云制药厂产品、高三尖杉酯碱（HHT）为杭州民生药业企业产品、米托

睦阳（MIT）为浙江瑞新药业企业产品：RPMI1640为Invitrgen产品：AnnexinV

FITC/PI试剂盒购自晶美生物企业：贝克曼流式细胞分析仪EliteEXP。

诱导Jurkat细胞凋亡

Jurkat细胞在5%CO2孵箱培养至对数生长期，镜下计数为1X106/ml,加入24孔板，

每孔1ml细胞悬液。用无血洁细胞悬液将顺珀、羟基喜树碱、高三尖杉酯碱和米托恿:醍

药物配制成1mg/ml溶液;每组药物分别设4个浓度：12.5.25.50、100ug/ml；分别加

入24孔培养板，作3个复孔。置于5%C02孵箱培养。

AnnexinV/PI流式双参数分析[1-3]

分别于加入约物作用2.4和8小时，吸取培养细胞悬液，用4£预冷|臼PBS洗细胞2

次，用250ul结合缓冲液重悬细胞，使其浓度为lX106/ml：取100U1细胞悬液，加5

ulAnnexinV/FITC10u1的碘化丙锭；混匀后室温避光孵育15分钟;用PBS洗涤2

次，进行流式细胞仪(FACS)分析。AnnexinV-FITC/PI双参数进行调试，以此条件进行

细胞凋亡和细胞坏死率检测。图1-5横坐标表达荧光强度，纵坐标表达细胞数，图中两个

峰中的左边峰表达阴性峰，右峰表达凋亡峰，右峰曲线卜.面积越大凋亡就越多。根据所测

数据计算细胞凋亡率和继发性坏死率。

记录学分析

各组细胞凋亡率均取3个样本的均值，以X±SD表达，多种均数的两两比较采用《中

国医学百科全书-医学记录学》记录软件包PEMS3.1软件进行检查。

1细胞的冻存

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保留法,重要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存

细胞。细胞在不加任何保护剂的状况下直接冷冻，细胞内外的J水分会很快形成冰晶，从而引

起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高,pH值变化,部分蛋白质由于上述

原因而变性，引起细胞内部空间构造紊乱，溶的体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细

胞内构导致分导致破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并导致能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白

复合体也易破坏引起细胞膜通透性的变化，使细胞内容物丢失。假如细胞内冰晶形成较多，

随冷冻温度日勺减少，冰晶体积膨胀导致细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞

死亡。因此,细胞冷冻技术日勺关键是尽量地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用

甘油或二甲基亚飙作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降,

提高细胞膜对水口勺通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻措施又可使细胞内口勺水分渗出

细胞外，减少胞内形成冰结晶向机会，从而减少冰晶对细胞口勺投伤

重要操作环节为:

(1)选择处在对数生长期的细胞，在冻存前一天最佳换液。将多种培养瓶中的细胞培养液

去掉，用0.25舟胰蛋白的消化。适时去掉胰蛋白施，加入少许新培养液。用吸管吸取培养

液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处

理。然后将细胞搜集于离心管中离心(1000r/min,10分钟)。

(2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4c预冷15分钟后，逐滴加入已无

菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3X106〜lX107/mL