华中大微生物学实验讲解

试验一微生物制片及形态视察

一、细菌简洁染色法及形态视察

（一）基本原理

简洁染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法,此法操作简便，适用于菌丝体一般形态和细

菌排列的视察。

常用碱性染料进行简洁染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而

碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料带负电荷），因此碱性染料的染色部分很简洁及

细菌结合使细菌着色。

经染色后的细菌细胞及背景形成显明的对比，在显微镜卜.更易于识别。常用作简洁染色的染料有美蓝、

结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培育基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等

酸性染料染色。

（二）试验材料

1.菌种：大肠杆菌、酵母菌的斜面培育物。

2.染色剂：吕氏碱性美蓝、草酸铉结晶紫等。

3.仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸等。

（三）试验步骤

1.涂片：取一块载玻片，滴一小滴蒸储水于玻片中心，用接环以无菌操作的方法，从菌和斜面上挑取

少许菌苔丁一水滴中，混匀，并涂成薄膜。涂片要涂抹匀称，不宜过厚。

2.干燥：室温自然干燥或烘干。

3.固定：涂面朝上，通过火焰2〜3次。

此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之坚固附着在载玻片上；同时

还可以杀死菌体；增加菌体及染料的结合力。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会变更

甚至破坏细胞形态。

4.染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加1~2滴染液于涂片上。草酸较结晶紫染色约1min；若用吕氏

碱性美蓝、或石炭酸复红染色1〜2min。

5.水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要干脆用水冲洗涂面,

而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急过大，以免涂片薄膜脱落。

6.干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。

7.镜检：涂片干后镜检。涂片必需完全干爆后才能用油镜视察。

（四）试验报告内容

依据视察结果，绘出所视察细菌的形态图。

二、革兰氏染色法

（一）基本原理

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞壁的结构和组成不同确定的。事

实上，当用结晶紫初染后，像简洁染色法一样，全部细菌都被烫成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能

及结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增加了染料及细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的

脱色效果不同的。革培育氏阳性纽菌，细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，

用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖形成的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘

的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。而革兰氏阴性菌；细胞壁

肽聚糖层较薄、网状结构交联少，且类脂质含量较高，经乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，

通透性增加，结晶紫一碘的夏合物被溶出细胞壁，细胞被脱色，亚染后，细胞被染上复染剂的颜色。

（二）试验材料

1.菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培育物。

2.染色剂：革兰氏染色液。

3.仪器或其他用具同试验一。

（三）试验步骤

1.制片：取菌种培育物按常规涂片、干燥、固定。

要用活跃生长期的幼龄培育物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定

不宜过热（以玻片不烫手为宜）。

2.初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色2min。

3.媒染：先用水冲去染色液，再用滴加碘液覆盖约1min.

4.脱色：将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醉无紫色时，马

上水洗。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成

阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20〜30s。

5.复染：用蕾红液复染约2min,水洗。

6.镜检：干燥后，用油镜视察。菌体被染成蓝色的是革兰无阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。

混合涂片染色：按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片进行比较。

（四）试验报告内容

依据视察结果，绘出所视察细菌的形态图。

三、细菌的芽胞染色

（一）基本原理

芽泡又叫内生抱子是某些细菌牛.长到肯定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能

否形成芽胞以及芽抱的形态、芽胞在芽电囊内的位置以及芽胞囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

由于芽抱壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行简洁染色时，菌体和芽胞囊着色,

而芽泡囊内的芽抱不着色或仅显徨淡的颜色，游离的芽胞呈.淡红或淡蓝紫色的圆或椰圆形的圈。为了使芽

施着色便于视察，可用芽泡染色法。

芽泡染色是用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可

进入芽抱内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽施一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染

色后，芽也仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽泡囊被染成复染剂的颜色，使芽胞和菌体更易于区分。

（二）试验材料

1.菌种：枯草芽胞杆菌的斜面培育物。

2.染色剂：5%孔雀绿溶液，0.5%蕃红水溶液。

3.仪器或其它用具：小试管，滴管，烧杯、试管架，载玻片，木夹子，显微镜等。

（三）试验步骤

1.制片：按常规涂片、干燥、固定。

2.染色：加数滴孔雀绿染液于片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并起先计时,

维持5min。加热过程中，要刚好补充染液，切勿让涂片干枯。

3.水洗：待玻片冷却后，用自来水冲洗，直至流出的水无色为止。

4.复染：用番红染液复;染2min。

5.水洗：水洗后，吸干。

6.镜检：从低倍镜到高倍镜，最终用油镜视察。芽抱呈绿色，芽泡囊及养分体为红色。

（四）试验报告内容

依据视察结果，绘出所视察细菌的形态图。

四、酵母菌的形态结构视察

（一）基本原理

在光学显微镜下，大多数酵母菌为单细胞，•般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。大小约为1-5X5-

3（）岬、，最大可达100pm。各种酵母菌有其肯定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异；即使在纯培

育中，各个细胞的形态、大小亦有差别。有些酵母菌细胞及其子代细胞连在一起成为链状，成为假丝酵母。

大多数酵母在平板培育基上形成的菌落较大而厚，潮湿、较光滑，颜色较单调（多为乳白色，少有红色，

偶见黑色）。酵母细胞核及细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十儿倍。繁殖方式也较困难，无

性繁殖主要是出芽生殖或裂殖，，有些酵母能形成假菌丝。有性繁殖是通过接合形成子囊及子囊狗子。

（二）试验材料

1.菌种：酿酒酵母。

2.染液及溶液：蕃红型液。

3.其它物品：载玻片及盖玻片等。

（三）试验内容

个体形态特征及出芽繁殖的视察：

酵母细胞较大，用水浸片法视察，即在载玻片中心滴加一滴水，滴加一小滴蕃红液，用接种环取酿酒

酵母少许（并留意酵母菌及培育基结合是否紧密），置于水及蕃红的混合液中，制成菌悬液。将盖玻片斜置

轻轻盖在液滴上。先用低倍镜，再换高倍镜视察酵母细胞的形态。

（四）试验报告内容

依据视察结果，绘出所视察菌体的形态图。

试验二微生物显微计数

（一）试验原理

利用血球计数器在显微镜下干脆计数是•种常见的微生物计总数的方法。因为计数器载片和盖片间的

容积肯定，所以可以依据显微镜下视察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。

血球计数器是一只特制载玻片。载片上有两个方格网，每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大

方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16个中方

格，每中方格乂分成25个小方格（麦氏血细胞计数板）。另一种是一个大方格分25个中方格，每个中方

格又分成16个小方格（希里格血细胞计数板。但是不论哪一种，一个大方格，都等分成（25X16或16X

25）400个小方格。因为每个大方格边长为1mm,载片及盖片间距离为0.1min,所以每个“数室（1个大

方格）体积为0.1mn?。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出每亳升菌液内所

含的菌数。

（二）试验材料

1.器材：血球计数板、显微镜。

2.菌种：酿酒酵母菌液。

（三）操作步骤

1.血球计数板的操作

1）取一个清洁的血球计数板，将干净的专用盖玻片放置在计数室上；

2）把酿酒酵母菌悬液进行稀释，以每小格有3〜5个酵母菌为宜：

3）摇匀稀释的酵母菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，沿盖玻片的边缘滴一小滴（不宜太多），使菌液

自行渗入计数室（两个计数室各滴一滴；留意：加菌液时不得使计数室内有气泡），静置5min；

4）将计数板放置在显微镜的载物台匕先在低倍镜下找到方格网，然后转到高倍镜下进行视察和计数。

2.计数方法

1）不同规格的计数板的计数方法略有差异，一个大方格是16个中方格的（16X25）,应当数4角4

个中方格（即100个小方格）的菌数；一个大方格是25个中方珞的（25X16）,除取4角4个中方特别，

还要数中心一个中方格（即为80个小方格）的菌数。留意：酵母菌的芽体达到母体细胞大小的一半者，即

可作为两个菌体计数；位于两个内方格间线上的酵母菌，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数，即数上

不数下，数左不数右；

2）每个样品重复（需重新加样）计数2〜3次（每次计数结果不应相差太大，否则重新操作），求平

均值；

3）按下列公式iI算出每毫升菌液所含的酵母菌细胞数：

总菌数/m1=8()个小力格内用.*4()()x1000()x稀释倍数

80

=每小方格内菌数X4X106X稀释倍数

(四)试验报告内容

记录计数结果，并计算出每富升菌液中的酵母菌细胞数。

试验三培育基配制及灭菌

一、培育基的常规配制程序

正确驾驭培育基的配制方法是从事微生物学试验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样

性，因而用于培育微生物培育基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培育基的配制

程序却大致相同。

(一)试验材料

1.药品：待配各种培育基的组成成分、琼脂、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCI溶液等。

2.仪器：天平或台秤、高压蒸汽灭菌锅。

3.玻璃器皿：移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培育皿、玻璃漏斗等。

4.其它物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、报纸等。

(二)试验步骤

1.玻璃器皿的洗涤

玻璃器皿在运用前必需洗刷二净。将锥形瓶、试管、培育皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷

刷洗，然后用自来水及蒸储水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸福水冲洗。洗刷干

净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。详见附录一。

2.灭菌前玻璃器皿的包装

(1)培育皿的包装：培育皿由一盖一底组成一套。可用报纸将几套培育皿包成一包，或者将几套培育皿

干脆置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培育皿须经灭菌之后才能运用。

(2)移液管的包装：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避开外界及口中杂菌吹

入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约17.5cm。塞

棉花时，可用一外圈拉直的网形针，将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧相宜，吹时以能通气向乂不

使棉花滑下为准。

先将牛皮纸或报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端,

约成45°角，折迭纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式

包扎起来。上端剩余纸条，折迭打结，打算灭菌。

3.液体及固体培育基的配制过程

1)液体培育基配制

称量：一般可用1/100粗天平称量配制培育基所需的各种药品。先按培育基配方计算各成分的用量，然

后进行精确称量。称牛肉膏、蛋白豚时要用小烧杯进行称量。

溶化：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水（依据试验须要可用自来水或蒸锵水），，书玻棒搅动，

加热溶化。

定容：待全部药品溶化后，倒入搪瓷杯中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较

浓溶液，然后按比例吸取肯定体积的溶液，加入到培育基中。

调pH：一般用pH试纸测定培育基的pH。用剪刀剪取一小段pH试纸，然后用镣子夹住pH试纸，在

培育基中蘸一下,观看其pH范围,如培育基偏酸或偏碱时，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液进行调

整。调整pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培育基中成分；边加边搅拌,

并时常用pH试纸测试，直至达至।所需pH为止。

过滤：用滤纸或多层纱布过滤培育基。一般无特殊要求时，此步可省去。

2）固体培育基的配制

配制固体培育基时，应将已配好的液体培育基加热煮沸，再将称好的琼脂（1.5%〜2%）加入，并用玻棒

不断搅拌，以免糊底烧焦。接着加热至琼脂全部溶化，最终补足因蒸发而失去的水分。

4.培育基的分装

依据不同须要，可将已配好培育基装入试管或锥形瓶内，分装时留意不要使培育基沾污管口或瓶口，

造成污染。如操作不当心，培育基沾污管口或瓶口时，可用银子夹一小块脱脂棉或卷纸，擦去管口或瓶口

的培育基。

1）试管的分装

取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再及另一玻璃管相接，橡皮管的中

部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指

开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培育基干脆流入试管内。

装入试管培育基的量视试管大小及须要而定，若所用试管大小为15X150mm时，液体培育基可分装至

试管高度1/4左右为宜；如分装固体或半固体培育基时，在琼脂完全溶化后，应趁热分装于试管中；用于制

作斜面的固体培育基的分装量为管高1/3（约10ml）；半固体培育基分装量为管高的1/3为宜。

2）锥形瓶的分装

用于振荡培育微生物用时，可在250ml锥形瓶中加入50ml的液体培育基；若用于制作平板培育基用

时，可在250ml锥形瓶中加入IfOml液体培育基，然后再加入3g琼脂粉（按2%计算），灭菌时瓶中琼脂

同时被溶化。

5.棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎

为了培育好气性微生物，需供应优良通气条件•，同时为防止杂菌污染，则必需对通入试管或锥形瓶内

空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。

1）试管棉塞的制作

制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的一般棉花一块，铺展二左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食

指将棉花从中心压入圆孔中制成棉塞，然后干脆压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折迭

卷塞法制作棉塞。

制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手

提梅塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。目前也有采纳金属或塑料试管帽代替棉塞,

干脆盖在试管口上，灭菌待用。将装好培育基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮

纸。用铅笔注明培育基名称及配制日期。灭菌待用。

2）锥形瓶棉塞制作

通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培育加大通气量，则可用8层纱

布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采纳无菌培育容器封口膜干脆盖在瓶口上，既保证良好通气，过滤除菌

又操作简便，故极受欢迎。

在装好培育基并塞好棉塞或包上八层纱布或盖好培育容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并

用线绳捆好，灭菌待用。

6.培育基的灭菌

培育基经分装包扎之后，应马上进行高压蒸汽灭菌，121C灭菌15min。如因特殊状况不能刚好灭菌，

则应暂存于冰箱中。

7.斜面和平板的制作

1）斜面的制作

将已灭菌装有固体培育基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度为试

管长度1/3,底层长为试管的2/3。如制作半固体或固体深层培育基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。

2）平板的制作

将装在锥形瓶中已灭菌的固体培育基溶化后，待冷至60C左右倾入无菌培育皿中。冷凝后即成平板。

倒平板时，培育基温度过高，皿盖上的冷凝水太多；温度低于45C,培育基易于凝固而无法制作平板。

8.培育基的无菌检查

灭菌后的培育基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1〜2管（瓶），置于37℃温箱中培育1〜2d,确

定无菌后方可运用。

二、细菌、放线菌常用培育基的配制

牛肉膏蛋白陈培育基是一种广泛用于培育细菌的培育基，属于半合成培育基。牛肉膏蛋白陈培育基的

主要成分是牛肉膏、蛋白陈和NaCl。而LB培育基的主要成分是胰化蛋白陈、酵母提取物和NaCI。它们分

别供应微生物生长繁殖所须要的碳源、氮源、能源、生长因子和无机盐等。培育基都是水溶液，这是因为

一切生物细胞都必须要水，蒸储水不含杂质，比自来水好，特殊是配制合成培育基时都必需用蒸你水，配

自然培育基时可用自来水，但自来水中常含Ca?+,Mg2+离子，易及其它成分形成沉淀。

高氏合成I号培育基是一种用于培育放线菌的合成培育基。培育基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，

KNCh作为氮源，K2Hp0八MgSCU和FeSC）4为无机盐等。

（一）试验材料

1.药品：牛肉青、蛋白陈、NaCK可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4>Mg2s04・7%0、FeSOjIH?。等。

2.溶液；Imol/LNaOH、1mol/LHCL

3.仪器：天平、高压蒸汽灭菌锅。

4.玻璃器皿：移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培育皿、玻璃漏斗等。

5.其它物品：药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、报纸等。

（二）试验步骤

1.肉膏蛋白陈培育基的配制

1）培育基成分：牛肉膏0.5g,蛋白陈lg,NaCI0.5g,琼脂2g,水100mLpH7.2。

2）配制方法

称量及溶化：取一干净小烧杯置于电子称上，去皮，分别称取蛋白豚和NaQ的所需量，用玻棒挑取牛

肉膏刮于一小烧杯壁上，进行称量，然后加入少量蒸偏水，加热溶化后倒入搪究杯中。将搪粒杯置于电炉

上加热，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。

定容：补充水量至所需体积。

调pH：待溶液冷至室温时,用1mol/LNaOH溶液调pH至7.0〜7.2。

加琼脂：加入所需量的琼脂，加热溶化，补充失水（亦可不用溶化琼脂，pH调好后干脆分装后，将所

需琼脂装入三角瓶或试管中，留意琼脂要没入液体中，然后包扎灭菌）。

分装、加塞、包扎，

高压蒸汽灭菌：121℃灭菌151而11。

2.高氏合成I号培育基的配制

1）培育基成分：可溶性淀粉2g,KNO30.1g,K2HPO4-3H2O0.05g,NaCI0.05g,MgSO4-7H2O0.05g,

FeSO4-7H2O0.001g,琼脂2g,蒸储水100mLpH7.2〜7.4。

2）配制方法

称量及溶化：用小烧杯称量可溶性淀粉，加入少量蒸储水，将淀粉调成糊状，置于电炉上加热，边加

热边搅拌至沸腾，使淀粉完全溶化。然后倒入搪瓷杯中，再加入所需水量的1/2左右。

分别称量KNO3>NaCKK2HPO4MgSO4,分别溶解后倒入上述搪瓷杯中。按每100ml培育基加入1%

FeSO,溶液0.1mi的量加入FeSCh。

定容：加水至所需体积。

调pH：用Imol/LNaOH溶液调pH至7.4。

加琼脂：加入所需重量的琼脂，加热溶化，补充失水。

分装、加塞、包扎,

高压蒸汽灭菌：121℃灭菌1501m。

三、酵母菌、霉菌常用培育基的配制

马铃薯葡萄糖培育基被广泛月F培育酵母菌和霉菌。马铃薯葡萄糖培育基有时也可用于挣育放线菌。

豆芽汁葡萄糖培育基也是培育酵母菌及霉菌的一种优良培育。

培育基配方中出现的自然pH系指培育基不经酸、碱调整而自然呈现的pH。

（一）试验材料

1.药品；葡萄糖、琼脂等。

2.仪器：天平、高压蒸汽灭菌锅。

3.玻璃器皿：移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培育皿、玻璃漏斗等。

4.其它物品：药匙、pH试纸、称量纸、纱布、线绳、塑料试管盖、报纸等。

（二）试验步骤

1.马铃薯葡萄糖培育基的配制

1）培育基成分：马铃薯20g,葡萄糖2g,琼脂2g,水100ml,自然pH。

2）配制方法

配制20%马铃薯浸汁：称取马铃薯40g,加水300ml,加热煮沸30min,用纱布过滤，然后补足失水

至所需体积，即制成20%马铃薯汁。

配制：每100ml马铃薯浸汁加入2g葡萄糖和2g琼脂，加热溶化，并补足失水。

分装、加塞、包扎。

高压蒸汽灭菌：121℃灭菌15|而11。

2.豆芽汁葡萄糖培育基的配制

1）培育基成分：黄豆芽10g,葡萄糖5g,琼脂2g,水100ml,自然pH。

2）配制方法

称量溶化：称取簇新黄豆芽20g,置于烧杯中，加水300ml,加热煮沸3（）min,用纱布过滤，补足失

水，即制成10%豆芽汁。

配制：每100向10%豆芽汁加入5g葡萄糖和2g琼脂，加热溶化，补足失水。

分装、加塞、包扎.

高压蒸汽灭菌：121℃灭菌15min。

（三）试验内容

1.配制下列固体培育基（200ml）,每组只配其中的一种培育基。

肉汤蛋白陈培育基、高氏I号培育基、马铃薯培育基、豆芽汁培育基（各组选择其中一种培育基进

行配制）。

2.分装3支试管（每支约10ml）,余170ml装入250ml三角瓶内。

3.包扎：10套平皿、6支（马铃薯培育基、豆芽汁培育基5支）试管（装入自来水9ml）、1ml移液

管6支（马铃薯培育基、豆芽汁培育基5支）、三角涂布棒2支。

4.以上物品在121c高温蒸气灭菌备用。

试验四土壤微生物分别及纯化

土壤是微生物生活的大本营，是找寻和发觉有重要应用潜刀的微生物的主要菌源。不同二样中各类微

生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的

土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。

本次试验从土壤中分别细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分别酵母菌。

（一）试验材料

1.菌源：土壤菌悬液。

2.培育基：肉膏蛋白陈培育基、高氏合成1号培育基、马铃薯培育基、豆芽汁培育基。

3.其它物品：培育皿、移液管、玻璃涂棒、称量纸、药勺、橡皮头等。

（二）试验步骤

本次试验采纳涂布法。

1.制备上壤稀择液：已制备C

2.倒平板：将已灭菌的培育基倾注到10个培育皿中，待冷凝后即成平板。在皿盖上标明稀释度或编号。

3.梯度稀释：按10倍稀释法进行稀释分别，以制备10飞稀释度为例，详细操作过程如下，

第一步：制备土壤菌悬液；

其次步：取6支无菌水试管，按10r〜10—6依次编号，放在试管架上；

第三步：吸取1ml土壤菌悬液注入第一支盛有9ml无菌水试管中，一手拿试管，在另一手掌上反复

击打振荡20次以上，制成10r的土壤稀释液；

第四步：另取一支无菌取移液管，从10r稀释液试管内吸出1ml菌悬液，加入到其次支装有9ml无

菌水试管中，反复敲打振荡20次，制成10.2土壤稀释液。

用同法再制成10,10-4、］0-5、］0-6的土壤稀释液。

图4一5梯度稀释示意图

4.涂布法分别：用无菌移液管吸取10%稀释度菌悬液02mL滴加于相应编号的培育基平板上，右手

持无菌玻璃涂棒，左手拿培育皿，并用拇指将皿盖打开一条缝，在火焰旁或超净台上，右手持玻璃涂棒于

平板表面将菌液自平板中心匀称向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液干脆推向平板边缘或将培育基划破,

重复涂3皿。依此法将105、104稀稀液各涂3皿。

5.培育：涂布完毕，将平板倒置于恒温箱中培育，培育2〜3d后视察结果。

将用过的移液管冲洗后用来苏尔水浸泡lh灭菌后再洗涤。

6.微生物菌落计数（平板菌落计数法）

含菌样品的微生物经稀糕分别培育后，每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。

故可依据平板上菌落的数目，推算出每克（毫升）含菌样品中所含的活菌总数。

同一稀释度3个平板上菌落平均数x稀释倍数

每克（亳升）样品中微生物的活细胞数=

含菌样品毫升数

一般由三个稀释度计算出的每克（毫升）含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的总活菌数均应很

接近，不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地削减。如相差较大，表示操作不精确。

7.平板菌落形态及个体形态视察

从不同平板上选择不同类型茴落用肉眼视察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。并

用接种环挑菌，视其及基质结合紧密程度。再用接种环挑取不同菌落制片，在显微镜下进行个体形态视察。

8.分别纯化菌株转接斜面（斜面接种）

在分别细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分别效果较好，认为已经纯化的菌落各选择一

个用接种环接种到斜面上。将细菌接种于肉膏蛋白陈斜面上，放线菌接种于高氏1号斜面上，酵母菌接种

于豆芽汁葡萄糖斜面上，霉菌接种于马铃薯葡萄糖斜面上。

贴好标签，在各自相宜的温度下培育，培育后视察是否为纯种。置冰箱保藏。

（三）试验报告内容

计算你所分别的微生物平板菌落计数结果。

试验五环境因素对微生物生长的影响

（-）目的耍求

了解某些物理因素、化学因素和生物因素对微生物生长的影响及芽抱对不良环境的反抗实力。

（二）基本原理

环境因素（包括物理因素、化学因素和生物因素），如温度、渗透压、紫外线、pH、氧气、某些化学药品

及拮抗菌等对微生物的生长繁殖、生理生化过程产生影响。不良的环境条件使微生物的生长受到抑制，甚

至导致菌体的死亡。但是某些微生物产生的芽泡，对恶劣的环境条件有较强的反抗实力。我仅可以通过限

制环境条件，使有害微生物的生长繁殖受到抑制，甚至被杀死；而使有益微生物得到发展。

（三）试验材料

1.菌种：金黄色葡萄球菌。

2.培育基：肉膏蛋白陈培育基。

3.其它物品：培育皿、无菌圆滤纸片、银子、无菌水、无菌滴管、水浴锅。

4.药品：1%新洁尔灭、5%来苏儿水、10%青霉素、40%甲醛和75%乙醇。

（四）试验步骤

1.微生物检查：

将100ml培育基溶化后，倒4个平板，每皿约25ml培育基，冷却。检查纸币、手指、空气及咳嗽中

的微生物，至37c恒温培育。

2.理化因素对微生物的影响：

（I）取5个无菌培育皿，在皿底写明测试药品名称。

（2）将•100ml肉育蛋白陈培育基溶化，并冷却至50C左右后加入2ml金黄色葡萄球菌菌悬液，快速混

匀，倾入无菌培育皿中，每皿约201nl，倒5皿，冷凝，即制成含菌平板。

（3）将镜子在酒精灯上灼烧后取分别浸泡在1%新洁尔灭、5%来苏儿水、10%青霉素、40%甲醛和75%

乙醇药品溶液中的滤纸片各一片，置于含菌平板的中心。

（4）将平板倒置于37c温箱中，培育24h后视察结果，测量并记录抑菌圈的直径。依据其直径的大小，

可初步确定测试药品的抑菌效能。

试验六深层培育生产a-淀粉酶及其酶活测定

枯草杆菌细胞为杆状，能产生淀粉陋、蛋白陶等，因而可以液化明胶、水解干酪素、糖化淀粉；一般

培育基上生长茂密，菌落为扩散性，灰白、淡黄至黄色，少数为黑色，细皱或折迭。在50〜56c时能生长，

适温30〜37C。为需氧菌。存在于土壤、枯草中。

在培育基中加入淀粉，可以刺激枯草芽抱杆菌产生a-淀粉酶来分解培育基中的淀粉，以满意其生长所

须要的养分。由于微生物的多样性，其代谢实力不尽相同，利用同一种微生物对同一种物质进行发酵，通

过酶活力检测，即可选择出优良菌株，或是改进发醉工艺。

（一）试验材料

1.菌种：枯草芽泡杆菌（产a-淀粉酶）。

2.液体培育基：细菌用培育基（牛肉膏蛋白陈培育基）+05%淀粉。

3.试剂：碘液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH60）。

4.其它器皿：250ml三角瓶、小试管、移液管、白瓷板、摇床、离心机、水浴锅。

（二）试验方法

1.发酵培育

1）配制液体培育基50ml（牛肉膏蛋白陈培育基）+0.5%淀粉，装入250ml三角瓶内。

2）灭菌：121℃高压蒸气灭菌15min。

3）接种：培育基冷却后，将枯草芽抱杆菌斜面菌接入液体培育基（留意无菌操作），室温37C,旋转

式摇床120r/min培育1周。

2.酶活力检测

1）取发酵液5mL装入离心管中，在5000r/min下离心5min,上清液即为粗酶液。

2）配制50ml2%可溶性淀粉液，用100曲的烧杯称取1g可溶性淀粉，加入50ml蒸储水，然后在

电炉上加热至液体澄澈透亮为止。

3）向干净的试管中加入2%可溶性淀粉液10ml及（pH6.0）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1mL在70°C

水浴中平衡约5min左右，然后加入1ml上清液（酶液），充分混匀并马上计时，接着在水浴锅中保温。

5）每隔30s取I滴反应液滴入预先盛有比色稀碘液（4滴）的白瓷板空穴内，当颜色反应由紫色渐

渐变为棕橙色，即为反应终点，记录时间。

6）计算a-淀粉酶活力（力堞）：

酶活力（―xlOx2%xn）-i-l

t

式中：l为反应时间（min）；n为酶液稀释倍数；1是运用的酶液量（inl）o

（三）试验报告

依据试验结果和计算公式，计算出枯草芽泡杆菌产a-淀粉醯的酶活力，写试验报告。

试验七管碟法测抗生素效价

（一）基本原理

管碟法就是利用有肯定体积的不锈钢制的小管，叫牛津杯，将抗生素溶液装满小杯，并在含有敏感试

验菌的琼脂培育基上进行扩散渗透作用，经过肯定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透亮的抑菌圈。

抑菌圈的半径及抗生素在管中的总量（单位）、抗生素的扩散系数（cm?/h）、扩散时间（即抗生素溶液注入钢

管至出现抑菌圈所需的时间）、培育基的厚度（mm）和最低抑菌浓度（U/ml）等因素有关。抗生素总量的

对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。

（二）试验材料

1.菌种：金黄色葡萄球菌

2.培育基：牛肉宫蛋白陈固体培育基

3.试剂：含10000单位链霉素母液

（三）试验步骤

1.配制培育基：每组配制牛肉膏蛋白陈固体培育基100ml,装于250ml锥形瓶内。

2.洗涤、包扎物品：每组包孔大平皿1套。

3.配制链霉素标准品：不同浓度链霉•素溶液。

4.制备混菌平板：将冷却至50°C左右的培育基，加入金色葡萄球杆菌菌悬液2ml,轻轻摇匀，倾入

大培育皿中，凝固后即成混菌平板，备用。

5.放置牛津杯：在底皿上分别标上10（）、200、500、1000、1500和待测液，将已灭菌的牛津杯放置在

及所标数字或标记对应的平板表面（共6个牛津杯）。

6.滴加链霉素标准品和样品：用移液枪将不同浓度的链霉素溶液和样品溶液分别滴加到相应的牛津杯

中，每个牛津杯滴加200pL。滴加时必需细致当心，忽使溶液溢出孔外。滴加完毕后，在上盖上标明班级、

姓名，置于37c恒温箱内培育。

7.抑菌圈直径的测量：用直尺测量抑