吉林省-《生物化学》电子教案-分子生物学常用技术(人卫版)

第十二章分子生物学常用技术及应用

【授课时间】3学时

【目的要求】

1.掌握基因工程与重组DNA技术相关概念，核酸分子杂交、探针、PCR、DNA芯片技术、基

因诊断和基因治疗的概念。

2.熟悉重组DNA技术、PCR的基本原理及基本反应步骤。

3.了解基因工程在医学中的应用，PCR的主要用途。

4.了解DNA芯片技术的原理与方法，基因诊断与基因治疗的应用。

【教学内容】

1.一般介绍：基因工程

2.一般介绍：核酸分子杂交技术

3.一般介绍：聚合随链反应

4.一般介绍：DNA芯片技术

5.一般介绍：基因诊断与基因治疗

【授课学时】3学时

第十二章分子生物学常用技术及应用

第一节基因工程

第二节核酸分子杂交技术

第三节聚合酶链反应

第四节DNA芯片技术

第五节基因诊断与基因治疗

第一节基因工程

时间教学内容备注

一、基本概念

不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA

分子，称为DNA重组(DNArecombination)4利用重组DNA技术从机

体细胞中提取DNA,并在体外进行剪切和获得目的基因，将载体DNA与

35，目的DNA片段连接再导人宿主细胞，并对目的DNA片段作选择性扩增和

表达。其中将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白

或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的

工作统称为基因工程(geneticengineering)0

二、工具酶

(一)限制性核酸内切能

1.限制性核酸内切酶的概念能够切割DNA多聚核昔酸链中磷酸二酯键

的酶称为核酸酶，其中有选择地切割DNA分子特异序列的核酸酶，称为

限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶。

3.限制性核酸内切酶的识别和切割位点大部分限制性核酸内切酶识

别的DNA序列具有回文结构特征，通常是4〜6碱基对，大多数酹是错

位切割双链DNA,产生5'磷酸基和3'羟基末端。不同的限制性内切酶

识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况：

(1)产生3'突出粘性末端：

(2)产生5'突出粘性末端：以PstI为例

(3)产生平末端：NruI为例

(-)其它工具酶

1.DNA连接酶

2.DNA聚合酶

3.逆转录

4.多核甘酸激酶

5.碱性磷酸酶

三、载体

教体的•般要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，并有较高的拷贝数；②

时间容易进入宿主细胞；③具有多个限制性内切醒的单一睡切位点，即为多备注

10'克隆位点；④容易从宿主细胞中分离纯化；⑤有容易被识别筛选的标志。

常用的载体主要有：质粒、入噬菌体等。

(一)质粒

质粒(plasmidj是细菌中存在的独立于染色质以外的、能自主兔制的、

并与细菌或细胞共存的遗传成分。多为双链共价闭合环形DNA。

目前，已有一系列的质粒作为商品供应，被广泛用于DNA分子克隆。如

PBR322质粒，长度为4.3kb,含有氨苇青霉素（ampr）、卡那霉素（kanr）

和四环素（tetr）的抗性基因。具有以下特点：①PBR322的氨苦青霉素

抗性基因和复制起始位点（ori）：②大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因

（lacl）,启动子（Plac）、操纵基因（0）及lacZ'基因片段，在lac

35'V基因中加入了多克隆位点。LacT基因编码B-半乳糖苗酶N端的

a-肽，宿主细胞编码8-半乳糖昔酶C端的肽段，两者可形成互补，而

各自都没有酶的活性，只有两者融为一体才具有酶的活性，故称为a互

补。

（二）噬菌体

噬菌体（bacteriophage,phage）是感染细菌的•类病毒，因其寄生在细

菌中并能溶解细菌细胞，所以称为噬菌体。用于感染大肠杆菌的人噬菌

体改造成的载体应用最为L

（三）粘粒

粘粒（cosmid）是将人噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。质粒

提供了复制的起始点、酶切位点、抗生素抗性基因，而cos区提供了粘

粒重组外源DNA大片段后的包装基础。

表达载体（expressingvector）是用来在受体细胞中表达（转录和翻

译）外源基因的载体。这类载体除具有克隆教体所具备的性质以外，还

带有表达构件转录和翻译所必需的DNA序列，

四、重组DNA技术的基本过程

重组DMA技术的基本步骤：①制备目的基因和相关载体；②将目的基因

和载体进行连接；③将重组的DNA导入受体细胞；④DNA重组体的筛选

和鉴定；⑤DNA重组体的扩增、表达和其它研究。

（-）目的基因的制备

目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是需要克隆或表达的基因。

1.基因组DNA文库

2.制备cDNA文库

3.聚合随链式反应（polymerasechainreaction,PCR）

4.化学合成

（-）目的基因与载体的连接

将目的基因或序列插入载体，主要通过DNA连接酶和双链DNA粘性末端

序列互补结合，可以在体外重新连接成人工重组体。体外连接的方法主

要有以下四种，

1.粘性末端连接

2.同聚物加尾连接

3.平末端连接

4.人工接头连接

（三）将外源DNA导入宿主细胞

1.转化（:ransformation）转化是指符质粒或其它外源DNA导入

处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。

2.感染（infection）感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细

胞中繁殖的过程。

（四）目的基因的筛选和鉴定

步骤：首先筛选出转化菌；然后筛选出带有重组体的克隆；最后是对DNA

重组体进行鉴定。所用的方法主要有遗传学方法（根据重组载体的标

志）、免疫学方法、核酸杂交法、PCR、核甘酸序列测定、DNA限制内切

酶图谱分析法等。

（五）克隆基因的表达

利用重组DNA技术可以分离，获得目的基因或DNA序列，也可实现目的

基因或cDNA在受体细胞中的表达，即产生mRNA和合成蛋白质产物。

六、基因工程在医学中的应用

（-）医学基础的研究

（二）疾病的含断和基因治疗

（三）基因工程药物

（四）转基因动物

（五）人类基因组计划

（六）蛋白质工程

第二节核酸分子杂交技术

时间教学内容备注

一、核酸分子杂交的基本原理

核酸分子杂交技术是基于具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条

件下碱基互补配对结合，形成双链的原理。在这一过程中，核酸分子经

历了变性和复性的变化，杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后

35'形成的异源双旌分子称为杂交分子。

二，核酸分子杂交的基木方法

基本类型：鉴别DNA靶分子的杂交祢为Southern印迹杂交

（Southernblot）；鉴别RNA靶分子的杂交称作Northern印迹杂交

（Northernblot）；由Southern和Northern印迹又可衍化出斑点杂交、

原位杂交等。

（一）Southern印迹杂交

Southern印迹杂交是指DNA与DNA的杂交，将经限制性内切酶消化

和变性后电泳分离的待测DNA片段转卬并结合到一定的固相支持物上，

然后与标记的DNA探针杂交。

利用Southern印迹杂交技术可进行克隆基因的曲切图谱分析、基因组

中特定基因的定性和定量、基因突变分析及RFLP分析等，进而在分子

克隆、遗传病诊断、法医学、肿瘤的基因水平研究和移植等方面发挥重

要作用。

=

1=

!==/

=_=

===一

_===M

===,:P-DNAftH

一

===三

==

③==三

==

==三

=

=二

时间（二）Northern印迹杂交备注

10'Northern印迹杂交是指将待测RNA样品经电泳分离后转移到固相

支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交，检测RNA（主要是niRNA）的

方法。其基本原理和基本过程与Southern印逃杂交基本相同。Northern

印迹杂交主要用于检测各种基因转录产物的大小、转录的量及其变化。

（三）斑点及狭缝印迹杂交

将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与探

针杂交，称为充点印迹（dotblot）。若采用狭缝点样器加样后杂交，其

印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。与Southern和Northern印迹法相比，

其优点是简单、快速，可在同一张膜上进行多个样品的检测。主要用于

基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，

35，（四）原位杂交

核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记

的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交（insitu

hybridization）,原位杂交不需要从组织或细胞中提取核酸，对组织中

含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完整地保持组织与细胞的形

态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

三、探针的标记------------------------

（一）探针的特征

探针的特点：①要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测，鉴定杂交

分子：②应是单链，若为双链用前需先行变性为单链；③具有高度特异

性，只与靶核酸序列杂交：④标记的探针应具有高灵敏度、稳定、标记

方法简便、安全。

（-）探针的种类及制备

1.基因组DNA探针

2.cDNA探针

3.寡核甘酸探针

4.RNA探针

（三）探针的标记物

常用的标记物有放射性核素和非放射性核素标记物两类。

第三节聚合酶链反应

时间教学内容备注

一、PCR的基本原理

聚合酶链反应（PCR）又称基因体外扩增特定序列方法。它是体外有引

物介导的特定DNA序列的酶扩增反应。

这种体外扩增技术与体内复制相类似，主要是根据碱基配对原理利用

35'DNA聚合酶催化和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特性引导了DNA

合成“

PCR反应体系有基因组DNA、一对引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、酶反应

缓冲体系及必需的离子强度等组成。反应在加热变性、使基因组双链DNA

变性为单链后，通过降低温度使特异引物与互补的DNA序列特异结合（退

火或好性）后，在耐热TaqDNA聚合酶作用下，以基因组单链DNA为模

板，从引物端开始按5,-3'方向合成DNA（延伸）。这样经过变性一

复性一延伸三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，

如此循环30次,介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷

贝，约为109个分子。

二、PCR的基本反应

三、PCR的应用

1.分析基因转录产物：构建cDXA文库；克隆特异cDNA；合成cDNA

探针。

2.用于mRNA检测、蛋白质和DM相互作用的研究。

3.用于基因组制图与测序

4.癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。

5.用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基因的筛选；法医学

鉴定；DNA序列分析；器官移植配型等。

6.医学上应用于遗传性疾病的诊断

第四节DNA芯片技术

时间教学内容备注

一、DNA芯片技术的概念和主要类型

（1）DNA芯片技术的概念

DNA芯片技术的基本原理与传统的核酸分子杂交相似，是指将大量已知

其核甘酸或DNA探针（与核酸分子杂交相反，亦称靶基因）按特定的排

35'列方式固化在固相支持物表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异

的单链DNA或RNA（待测样品）分子杂交形成双链，通过对杂交信号的

检测分析，即可得出样品分子的数量和序列信息。

（二）DNA芯片的主要类型

1.原位合成芯片

2.DNA微集阵列

二、DNA芯片技术的基本原理与方法

DNA芯片技术工作流程主要包括：芯片的制备、样品的准备与标记、杂

交、信号检测和数据分析处理，其中芯片的制备是最关键的环节。

三、DNA芯片技术的应用

DNA芯片基本应用可以分为两个主要方面：①对大量的生物样品进行快

速、高效、敏感的定量分析，主要指测序和突变检测；②定性分析，主

要指时基因表达的研究。涉及基因功能分析、疾病发生机制探讨、药物

研究和筛选等，

第五节基因诊断与基因治疗

时间教学内容备注

一、基因诊断

基因诊断（genediagnosis）是以DNA和RNA为诊断材料,DNA反映基因

的存在状态，RNA反映了基因的表达状态，通过检查基因的存在、缺陷

或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。其基本原理是

35'检测DNA或RNA的结构和数量及表达功能是否正常，以确定被检查者是

否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据v临床意义在于

不仅能对疾病作出早期、确切诊断，而且也能确定个体对疾病的易感性

及疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等c

（一）基因诊断的常用技术方法

1.核酸分子杂交

2.PCR

3.单链构象多态性检测

4.限制性内切能能谱分析

5.DNA序列测定

G.DNA芯片技术

（二）基因诊断的应用

1.遗传性疾病

2.遗传易感性疾病

3.感染性疾病

4.肿瘤

5.法医鉴定和组织配型

二、基因治疗

基因治疗不仅,1」于治疗多种遗传病（如血友病等），也已用于治疗恶性肿

瘤、某些传染病（如艾滋病）、心血管疾病和糖尿病等。

（-）基因治疗的概念

基因治疗（genetherapy）是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基

因水平调控细胞中缺陷基因的表达的一种治疗疾病的方法。

狭义的基因治疗是指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生

时间整合，成为宿主基因组的一部分，目的基因的表达产物起治疗疾病的目备注

10'的。而广义的圣因治疗则包括通过基因转移技术或反义核酸技术、核酶

技术等，使目的基因得到表达、或封闭、剪切致病基因的mRNA,而达到

治疗疾病的FI的。

（二）基因治疗的基本程序

1.选择和制备目的基因

2.选择基因转运载体

3.选择靶细胞

4.转移基因

5.外源基因表达的筛选

6.回输细胞到体内

35'（三）基因治疗研究的主要内容或策略

1.基因调控治疗根据作用原理不同可分为：①药物调控用药物使

被抑制的基因重新表达，或抑制某些过度表达基因的表达：②反义核酸

技术反义核酸是指与目的基因或目的基因的niRNA互补，并与其按碱

基配对的方式结合的核酸，它可以在复制、转录、转录后加工及翻译水

平上抑制目的基因的表达，达到治疗的目的；③核酹技术利用核能的

催化活性将mRNA特异地剪切，从而不能承担翻译模板的作用。

2.基因矫正治疗按矫正的方式不同可分为：①基因增补将正常的

目的基因导入体内，通过增补基因表达产物，修饰缺陷细胞的功能，改

善症状或消除疾病。这种治疗方法，缺陷基因仍然存在于细胞内而不作

任何处理，是目前基因治疗最常用的方式；②基因置换通过同源重组

方法，用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA

完全恢复正