CAR‑NK细胞产品质量控制技术指南（试行）

CAR‑NK细胞产品质量控制技术指南（试行）1范围本指南为CAR‑NK细胞治疗产品质量控制的指导性文件，适用于经基因工程改造表达嵌合抗原受体（ChimericAntigenReceptor,CAR）的自体/同种异体自然杀伤（NaturalKiller,NK）细胞产品，涵盖原代NK、脐带血NK、诱导多能干细胞（iPSC）来源NK、永生化NK细胞系（如NK-92）来源的静脉给药、局部给药CAR-NK产品的研发、中试生产及商业化阶段质量控制，生产企业可根据产品特性、给药途径、临床阶段调整质控项目，本指南为试行要求。2规范性引用文件本指南引用下列文件中的条款，未注明日期的引用文件其最新版本适用于本指南：《中华人民共和国药典》（2025年版）、国家药品监督管理局《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》《基因治疗产品质量控制研究技术指导原则（试行）》、ICHQ5A《来源于人源和动物源细胞生物技术产品的病毒安全性评价》、ICHQ6B《生物技术产品/生物制品的质量标准》。3原材料质量控制原材料质量控制为CAR-NK产品质量的核心源头，所有原材料需符合GMP要求，建立合格供应商审计制度，每批原材料需检定合格方可投入生产。3.1起始细胞原材料3.1.1供者与来源材料筛查自体CAR-NK需对供者进行术前传染病筛查，检测项目包括乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原、丙型肝炎病毒（HCV）抗体、人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体/核酸、人类T淋巴细胞白血病病毒（HTLV）抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒（CMV）核酸、EB病毒（EBV）核酸，所有项目阴性方可采集细胞；同种异体CAR-NK需额外增加供者HLA分型检测、群体反应性抗体（PRA）检测，PRA阳性率<10%符合要求，排除有遗传性疾病、恶性肿瘤病史的供者。不同来源起始细胞需符合对应要求：①外周血单个核细胞来源NK：采集后分离得到的起始细胞活率≥90%，CD3-CD56+NK细胞比例≥15%；②脐带血来源NK：脐带血采集符合脐带血库质量管理规范，传染病筛查阴性，有核细胞活率≥85%；③iPSC来源NK：起始iPSC需建立细胞库，全基因组测序未检出致病性突变，拷贝数变异（CNV）长度<1Mb，无致癌相关基因变异；④NK-92永生化细胞系：细胞来源明确，无交叉污染，核型分析符合细胞系特征，传代限度明确，工作细胞库传代次数不超过20代。3.1.2细胞库检定所有可扩增的起始细胞需按照三级细胞库体系（主细胞库MCB、工作细胞库WCB、终末生产细胞库EPCB）构建，每级细胞库需完成以下检定：①细胞身份鉴定：STR分型确认细胞种属与身份，无其他细胞系交叉污染，STR等位基因匹配度≥90%；②基因型鉴定：整合型CAR修饰的细胞库需采用二代测序（NGS）检测CAR整合位点，高危整合（插入原癌基因启动子/增强子区域）占比<1%，符合安全性标准；③微生物与外源性因子检测：无菌检查阴性、支原体检查阴性、内毒素符合标准，外源性病毒筛查（包括细小病毒B19、BK病毒、逆转录病毒等）均为阴性；④致瘤性检测：永生化细胞系、iPSC来源细胞需完成体内致瘤性试验，免疫缺陷小鼠接种1×10^7细胞观察16周，无肿瘤形成；⑤活率与纯度：MCB/WCB细胞活率≥85%，NK细胞纯度符合设定标准。3.2基因修饰工具质量控制3.2.1病毒类基因修饰工具慢病毒、逆转录病毒、AAV等病毒载体需完成终产品检定，合格标准如下：①滴度：感染滴度/基因组滴度符合要求，慢病毒感染滴度≥1×10^8TU/mL，基因组滴度与感染滴度比值为0.5~2.0；②纯度：宿主细胞蛋白残留≤100ng/剂量，宿主细胞DNA残留≤10ng/剂量，纯度≥95%；③安全性：内毒素≤0.5EU/mL，无菌、支原体阴性，复制型病毒（RCL/RCR）检测阴性，外源性因子检测阴性。3.2.2非病毒类基因修饰工具mRNA、转座子质粒、CRISPR系统等非病毒载体合格标准：①序列正确性：Sanger测序或NGS验证目标序列100%匹配；②纯度：mRNA纯度≥90%，琼脂糖凝胶电泳验证完整性符合要求；③杂质残留：质粒残留DNA≤1ng/剂量，内毒素≤0.1EU/μg，无菌支原体阴性；④活性：转染效率符合设定标准，体外转染CAR阳性率≥20%。3.3生产辅料与试剂所有生产用试剂需符合药用级别要求，优先选择无血清、无动物源成分的试剂：①细胞因子（IL-2、IL-15、IL-21等）：重组人源化级别，纯度≥95%，内毒素≤0.1EU/μg，无菌支原体阴性；②分选试剂：CD56、CD3磁珠/抗体，纯度符合要求，终产品残留限度为抗体残留<100ng/1×10^8细胞，磁珠残留<1个/1×10^6细胞；③冻存液：组分明确，DMSO纯度符合药用标准，内毒素≤0.5EU/mL，无菌阴性。4生产过程质量控制生产全流程需建立过程质控节点，每节点检验合格方可进入下一工序，关键节点质控要求如下：4.1分离激活阶段质控细胞分离纯化后取样检测：①细胞活率≥85%；②NK纯度：CD45+CD3-CD56+比例，外周血来源≥85%，脐带血来源≥80%；③激活效率：流式检测CD69阳性率≥30%，确认NK激活成功；④无菌、支原体检测阴性。4.2基因转导/转染阶段质控转染/转导结束后72h取样检测：①CAR转导阳性率符合设定标准，临床级产品要求CAR阳性率≥30%；②复制型病毒检测阴性（病毒转导工艺）；③细胞活率≥80%，无微生物污染。4.3扩增阶段质控扩增过程每2~3天取样监测，质控要求：①细胞活率≥80%，细胞扩增倍数符合工艺设定范围；②代谢指标：乳酸浓度≤2g/L，pH维持7.2~7.4，葡萄糖浓度≥1g/L；③每批次至少取样1次进行无菌、支原体检测，结果阴性。扩增结束后质控要求：NK纯度CD3-CD56+≥90%，CAR阳性率符合放行标准。4.4收获纯化阶段质控收获后取样检测：①细胞活率≥85%；②杂质残留：牛血清白蛋白残留≤50μg/剂量，磁珠残留符合限度要求；③无菌检测阴性。5终产品质量控制终产品需完成全项目检定，所有项目符合质量标准方可放行，具体要求如下：5.1身份鉴定5.1.1细胞身份鉴定：流式细胞术检测细胞表型，要求CD45+CD3-CD56+比例，自体产品≥85%，同种异体产品≥90%；CD3+T细胞残留限度：自体产品≤5%，同种异体产品≤1%，降低移植物抗宿主病（GVHD）风险。5.1.2CAR身份鉴定：PCR或数字PCR验证CAR序列正确性，数字PCR检测CAR整合拷贝数，要求每个细胞平均整合拷贝数为1~2个，单细胞整合拷贝数>5个的比例<10%；流式细胞术检测CAR表达阳性率，符合放行标准，一般不低于30%；整合型载体修饰产品需确认整合位点无高危插入，符合安全性要求。5.2基础理化项目检测①细胞计数：标示细胞量偏差范围为±20%，符合标示量要求；②细胞活率：台盼蓝染色或流式检测活率≥80%；③pH值：6.5~7.5，符合生理范围；④渗透压：280~320mOsm/kg，符合静脉给药要求。5.3安全性检测5.3.1微生物污染：无菌检查符合《中国药典》要求，支原体检查阴性；5.3.2内毒素：鲎试验检测，内毒素含量≤0.5EU/mL，或<0.2EU/1×10^6细胞，符合静脉给药要求；5.3.3外源性因子：采用宏基因组NGS检测所有外源性致病病原体，HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、B19细小病毒等均为阴性；5.3.4工艺残留杂质：①病毒载体残留：游离病毒滴度<1×10^3TU/剂量；②宿主DNA残留：病毒生产宿主DNA残留≤10ng/剂量；③试剂残留：DMSO残留<1%（v/v），分选抗体残留<100ng/剂量，BSA残留≤50μg/剂量；④非病毒载体残留：质粒DNA残留<1ng/剂量；5.3.5特殊安全性项目：①复制型病毒：慢病毒/逆转录病毒转导产品RCL检测阴性；②致瘤性：永生化细胞系、iPSC来源产品，要求未分化iPSC残留率<0.01%，体内致瘤试验无肿瘤形成；原代NK产品要求染色体异常率<5%，无高危整合；③NK-92来源产品：照射灭活后检测增殖能力，增殖抑制率≥99%，无连续增殖能力；④同种异体基因编辑产品：HLA敲除效率≥90%，残留HLA表达阳性细胞≤10%。5.4有效性相关检测5.4.1体外细胞毒活性：采用LDH释放法或流式细胞术检测，效靶比10:1条件下，对抗原阳性靶细胞的杀伤率≥50%；与内部参考品比对，相对活性范围为70%~130%，符合要求；5.4.2细胞因子释放：CAR-NK与抗原阳性靶细胞共培养24h后，IFN-γ释放量≥1000pg/mL，TNF-α释放量符合设定标准；5.4.3杀伤功能分子检测：颗粒酶B阳性率≥60%，穿孔素表达符合要求，证明NK细胞杀伤功能正常。6检验方法学验证与参考品建立6.1方法学验证所有检测方法需按照ICH要求完成方法学验证：①定性检测方法（无菌、支原体、RCL）：验证特异性、灵敏度，要求灵敏度符合设定限度，假阴性率为0；②定量检测方法（细胞计数、CAR阳性率、残留杂质、活性检测）：验证准确度、精密度、线性、范围、定量限、检测限，要求准确度偏差在±20%以内，批内精密度CV<15%，批间精密度CV<20%，定量限低于检测限度至少1倍，符合要求。6.2参考品建立生产企业需建立内部质量参考品，包括：①CAR阳性参考品，用于流式检测CAR阳性率的校准；②活性参考品，标定明确的杀伤活性、细胞因子释放水平，用于每批产品活性比对；③杂质阳性对照参考品，用于残留杂质检测的定性定量；参考品需分装储存于-80℃，每2年复标一次，保证稳定性。7稳定性研究质量控制7.1长期储存稳定性冻存产品储存于-130℃以下液氮或-80℃冰箱，分别于1、3、6、12、24、36个月取样检测，要求活率下降不超过初始值的10%，CAR阳性率变化不超过10%，杀伤活性保留不低于初始活性的80%，据此确定产品有效期。7.2运输与解冻后稳定性模拟实际运输条件，干冰运输（温度维持-70℃以下）放置7天，取样检测要求活率≥75%，活性保留≥80%，符合要求；产品解冻后，室温放置≤4h，2~8℃放置≤24h，期间活率≥75%，活性符合要求，明确临床使用时限。7.3冻融稳定性：考察结果显示，CAR-NK产品冻融2次后活率普遍下降超过10%，因此明确产品仅可冻融1次，禁止反复冻融。8批间一致性控制连续生产3批中试/生产规模产品，评估批间一致性，要求：①CAR阳性率批间RSD<15%；②细胞活率批间RSD<10%；③体外杀伤活性批间RSD<20%；④同种异体通用型产品要求HLA分型一致，CAR整合位点特征一致，全基因组测序无显著性差异，证明生产工艺稳定可控。9放行要求每批产品需完成所有规定项目检定，所有项目符合质量标准，生产记录、偏差记录、检定记录审核合格，产品全流程可追溯性完整，方可放行；临床阶段产品，若无菌