西洋参提取工艺研究

引言西洋参（PanaxquinquefoliusL.）的科属是五加科人参属，别名花旗参，原产于北美洲，主要分布于加拿大蒙特利亚、魁北克、多伦多以及美国芝加哥、密苏里州和威斯康星州地区。中国于20世纪80年代后期引种栽培，目前黑龙江、吉林、辽宁、陕西、北京、河北、山东等多个省市均有西洋参的栽培REF_Ref12087\r\h[1]。西洋参味甘微苦，性凉，归心、肺、肾经。具有补气养阴，清热生津的功效，多用于治疗气虚阴亏，虚热烦倦，咳喘痰血，内热消渴，口燥咽干REF_Ref13808\n[2]。煮散剂在古代就有应用，其将药材碾碎成粗末煮后服用，利于有效成分溶出，在节省药材、提高疗效等方面有优势。目前，中药煮散剂在临床上的推广应用远不如中药汤剂REF_Ref8571\n[3]，这也导致大众渐渐忽略了这一剂型，但有研究表明中药煮散剂也属于汤剂范畴，具有提高浸出率，节省药材的优点REF_Ref10874\n[4]，对缓解中药资源缺乏具有重要意义，这也为现代西洋参煮散剂研究提供了理论和实践基础，以便促进中医药事业的发展。中医理论中，西洋参性凉，味甘、微苦，归心、肺、肾经，具补气养阴、清热生津之效。传统中医使用西洋参有多种剂型，但对西洋参煮散剂并无系统研究，这对医药领域发展具有经济价值REF_Ref11362\n[5]。目前研究大多聚焦于西洋参饮片破壁技术REF_Ref32660\n[6]、西洋参颗粒剂的制备工艺REF_Ref32755\n[7]，也有研究利用单因素实验结合正交试验考察总多糖及总皂苷的最佳提取工艺REF_Ref14393\n[8]，但煮散剂的系统化研究仍待深入；国外则侧重于基础研究与市场开发，剂型改良技术相对滞后。未来研究需整合多种工艺，推动西洋参煮散剂从实验室研究向规模化生产转化，助力中药制剂的发展。本实验利用响应面法REF_Ref30431\n\h[9]中的Box-Behnken设计REF_Ref30538\n\h[10]结合单因素实验法REF_Ref2949\n\h[11]，通过考察不同粉碎力度、不同加水倍量、不同浸泡时间、不同提取时间对西洋参提取液中总皂苷、总多糖、总黄酮含量的影响来确定西洋参煮散剂的最佳制备工艺。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验仪器

表1.1实验仪器设备仪器设备型号厂家高速粉碎机ZY-250A中辕仪器有限公司电子天平DT1001常熟市意欧仪器仪表有限公司电热恒温水浴锅HHS21-6上海博迅医疗生物仪器股份有限公司电热鼓风干燥箱GZX-9140MBE上海博迅实业有限公司医疗设备厂磨粉机M150A中山市雕牌电器有限公司超声波清洗机YTS-600B保定市倚天超声波科技有限公司低速离心机TDL-80-2B上海安亭科学仪器厂多功能微孔板分析仪YQ2014005846-药典筛1-7号浙江上虞市道墟仪器筛具厂1.1.2实验试剂表1.2实验药品与试剂药品与试剂生产批号厂家西洋参饮片2408012安徽益生源中药饮片科技有限公司人参皂苷Re标准品B21055上海源叶生物科技有限公司甲醇（分析纯）20240816天津新通精细化工有限公司香草醛20241203上海麦克林生化科技有限公司高氯酸（分析纯）20241019天津政成化学制品有限公司冰醋酸（分析纯）20241130广东光华科技股份有限公司无水葡萄糖标准品B21882上海源叶生物科技有限公司苯酚（分析纯）20160426北京化工厂硫酸（分析纯）2024121602成都市科隆化学品有限公司芦丁标准品B20771上海源叶生物科技有限公司无水乙醇（分析纯）20240927广东光华科技股份有限公司亚硝酸钠20140412天津市福晨化学试剂厂硝酸铝（分析纯）20230301天津市大茂化学试剂厂氢氧化钠（分析纯）20211018天津市永大化学试剂有限公司1.2实验方法1.2.1总皂苷含量测定1.2.1.1标准溶液的制备精密称取人参皂苷Re对照品2mg，加70%甲醇1mL配制成2.0mg/mL的标准溶液。1.2.1.2供试品溶液的制备精密称取样品20mg，加70%甲醇定容至1mL，称重，超声（600W、40kHz）提取1h后再次称重，加70%甲醇补足，在1200r/min下离心15min，精密吸取上清液100μL得到供试品溶液。1.2.1.3含量测定采用香草醛-高氯酸法REF_Ref23205\r\h[12]进行总皂苷含量的测定，实验过程中精确吸取不同体积的标准溶液（分别为0、20、40、60、80、100μL），供试品溶液取100μL后置于具塞试管内，60℃水浴条件下挥干溶剂。依次按顺序加入200μL5%香草醛-冰醋酸溶液并混合均匀，再加800μL高氯酸，混匀后继续在60℃水浴中加热30min进行显色反应。冷却后向显色液中加入5mL冰醋酸并充分振荡。将标准溶液及样品溶液各100μL转移至96孔组织培养板中，使用多功能微孔板分析仪在560nm波长处测定吸光度值。最终通过吸光度（Y，A）与总皂苷含量（X，mg）构建标准曲线。同法测定供试品溶液吸光度，并依据先前建立的标准曲线计算各样品总皂苷含量。1.2.2总多糖含量测定1.2.2.1标准溶液的制备精密称取无水葡萄糖适量，加蒸馏水配制成0.1mg/mL的标准溶液。1.2.2.2供试品溶液的制备精确称取10mg样品，加蒸馏水将其定容至1mL后称重。采用超声提取法，设置功率为600W、频率为40kHz，提取1h。提取结束后再次称重，若有质量损失则加蒸馏水补足。将溶液置于离心机中，以1200r/min的转速离心15min。准确吸取10μL上清液，加蒸馏水补足至1mL，制得供试品溶液。1.2.2.3含量测定采用苯酚-硫酸法REF_Ref23293\r\h[13]进行总多糖含量的测定，实验过程中精确吸取不同体积的标准溶液（分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL），供试品溶液取0.8mL后置于具塞试管内，通过添加蒸馏水将所有溶液定容至1mL，并依次向各试管中加入0.5mL6%苯酚溶液并充分混匀，随后滴加2.5mL浓硫酸并再次混匀。将混合溶液避光冷却至室温后，将标准溶液及样品溶液各100μL转移至96孔组织培养板中，使用多功能微孔板分析仪在490nm波长处测定吸光度值。最终通过吸光度（Y，A）与总多糖含量（X，mg）构建标准曲线。同法测定供试品溶液吸光度，并依据先前建立的标准曲线计算各样品总多糖含量。1.2.3总黄酮含量测定1.2.3.1标准溶液的制备精密称取芦丁对照品1.5mg，加入2mL50%乙醇配制为0.75mg/mL的标准溶液。1.2.3.2供试品溶液的制备精确称取10mg样品，加50%乙醇将其定容至1mL后称重。采用超声提取法，设置功率为600W、频率为40kHz，提取1h。提取结束后再次称重，若有质量损失则加50%乙醇补足。将溶液置于离心机中，以1200r/min的转速离心15min。准确吸取500μL上清液，制得供试品溶液。1.2.3.3含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝法REF_Ref23581\r\h[14]进行总黄酮含量的测定，实验过程中精确吸取不同体积的标准溶液（分别为0、100、200、300、400、500μL），供试品溶液取500μL后置于具塞试管内，向各试管分别加入150μL5%亚硝酸钠溶液，混匀并静置6分钟。随后依次加入150μL10%硝酸铝，再次混匀后静置6分钟。最后加入2mL4%氢氧化钠溶液，混合均匀后用蒸馏水定容至5mL，混匀后将标准溶液及样品溶液各100μL转移至96孔组织培养板中，使用多功能微孔板分析仪在508nm波长处测定吸光度值。最终通过吸光度（Y，A）与总黄酮含量（X，mg）构建标准曲线。同法测定供试品溶液吸光度，并依据先前建立的标准曲线计算各样品总黄酮含量。1.2.4综合评分计算以总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和为综合评价指标，计算综合评分。1.2.5粉碎力度的考察1.2.5.1样品制备将西洋参饮片粉碎，分别得到过药典1-7号筛饮片粉末。称取西洋参饮片及过药典1-7号筛饮片粉末各10g于锥形瓶中，平行称定三组，以三组数据的平均值为最终结果，加水100mL，浸泡30min后置水浴锅上100°加热回流提取两次，每次40min，趁热滤过，合并两次滤液，将滤液放入70℃电热鼓风干燥箱中，烘干，得到西洋参提取液干膏。用磨粉机将干膏打碎成细粉备用。1.2.5.2总皂苷含量测定按“1.2.1”项下同法测定总皂苷含量。1.2.5.3总多糖含量测定按“1.2.2”项下同法测定总多糖含量。1.2.5.4总黄酮含量测定按“1.2.3”项下同法测定总黄酮含量。1.2.5.5综合评分计算按“1.2.4”项下同法计算综合评分，确定最佳粉碎力度。1.2.6单因素实验1.2.6.1加水倍量的考察在上述所得最佳粉碎力度条件下，称取西洋参饮片粉末10g置锥形瓶中，设定西洋参饮片粉末的浸泡时间为30min，提取时间为40min，加水倍量分别为6倍、8倍、10倍、12倍、14倍，置水浴锅上100°加热回流提取两次，趁热滤过，合并两次滤液，将滤液放入70℃电热鼓风干燥箱中，烘干，粉碎得到不同加水倍量条件下的干膏粉，按“1.2.1”项下同法测定所得干膏粉的总皂苷含量，按“1.2.2”项下同法测定所得干膏粉的总多糖含量，按“1.2.3”项下同法测定所得干膏粉的总黄酮含量，按“1.2.4”项下同法计算综合评分。1.2.6.2浸泡时间的考察在上述所得最佳粉碎力度条件下，称取西洋参饮片粉末10g置锥形瓶中，设定西洋参饮片粉末的加水倍量为10倍，提取时间为40min，浸泡时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，置水浴锅上100°加热回流提取两次，趁热滤过，合并两次滤液，将滤液放入70℃电热鼓风干燥箱中，烘干，粉碎得到不同浸泡时间条件下的干膏粉，按“1.2.1”项下同法测定所得干膏粉的总皂苷含量，按“1.2.2”项下同法测定所得干膏粉的总多糖含量，按“1.2.3”项下同法测定所得干膏粉的总黄酮含量，按“1.2.4”项下同法计算综合评分。1.2.6.3提取时间的考察在上述所得最佳粉碎力度条件下，称取西洋参饮片粉末10g置锥形瓶中，设定西洋参饮片粉末的加水倍量为10倍，浸泡时间为30min，提取时间分别为20min、30min、40min、50min、60min，置水浴锅上100°加热回流提取两次，趁热滤过，合并两次滤液，将滤液放入70℃电热鼓风干燥箱中，烘干，粉碎得到不同提取时间条件下的干膏粉，按“1.2.1”项下同法测定所得干膏粉的总皂苷含量，按“1.2.2”项下同法测定所得干膏粉的总多糖含量，按“1.2.3”项下同法测定所得干膏粉的总黄酮含量，按“1.2.4”项下同法计算综合评分。1.2.7响应面设计在单因素实验的综合评分的基础上，根据Box-Behnken响应面设计法设计原理对提取工艺进行优化，从加水倍量（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C）三个因素中各选取三个水平，以提取物中总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和为评价指标，利用Design-Expert13软件,设计三因素三水平17个试验点的响应分析实验。2数据分析2.1粉碎力度考察实验结果2.1.1总皂苷含量测定结果按“1.2.1”项下方法测定总皂苷标准溶液，以总皂苷含量为横坐标（X，mg），吸光度为纵坐标（Y,A）绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=0.7329X-0.0009（R2=0.9935）。通过计算得到不同粉碎力度条件下，西洋参提取液中总皂苷含量（单位：mg/g）如图2.1所示。图2.1不同粉碎条件下西洋参提取液中总皂苷含量2.1.2总多糖含量测定结果按“1.2.2”项下方法测定总多糖标准溶液，以总多糖含量为横坐标（X，mg），吸光度为纵坐标（Y,A）绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=1.0834X+0.1034（R2=0.9968）。通过计算得到不同粉碎力度条件下，西洋参提取液中总多糖含量（单位：mg/g）如图2.2所示。图2.2不同粉碎条件下西洋参提取液中总多糖含量2.1.3总黄酮含量测定结果按“1.2.3”项下方法测定总黄酮标准溶液，以总黄酮含量为横坐标（X，mg），吸光度为纵坐标（Y,A）绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=0.5431X-0.0006（R2=0.9996）。通过计算得到不同粉碎力度条件下，西洋参提取液中总黄酮含量（单位：mg/g）如图2.3所示。图2.3不同粉碎力度下西洋参提取液中总黄酮含量2.1.4综合评分计算结果按“1.2.4”项下同法计算，得到不同粉碎力度条件的综合评分结果如图2.4所示。图2.4不同粉碎力度条件的综合评分综合以上实验数据，可以得出，当其他条件不变时，随着筛网数目的增加，西洋参饮片粉末提取液的综合评分呈现先逐渐升高，而后逐渐下降的趋势，其中，过药典2号筛的西洋参饮片粉末的提取液的综合评分相对最高，为543.75055，即提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量相对最高，故西洋参煮散剂的最佳粉碎力度为过药典2号筛。2.2单因素实验结果2.2.1加水倍量考察实验结果按“1.2.6.1”项下方法操作所得不同加水倍量条件下西洋参提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量及综合评分如图2.5、图2.6所示。由以下实验数据可以得出，在西洋参饮片粉末的提取过程中，当浸泡时间与提取时间保持一致时，随着加水倍量的增加，西洋参饮片粉末提取液的综合评分整体呈现下降的趋势，而加水倍量为6倍、8倍、10倍时的综合评分较高，分别为474.06417，465.07517，451.7657，即西洋参提取液中总皂苷、总多糖、总黄酮含量相对较高。图2.5不同加水倍量条件下西洋参提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量图2.6不同加水倍量条件的综合评分结果2.2.2浸泡时间考察实验结果按“1.2.6.2”项下方法操作所得不同浸泡时间条件下西洋参提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量及综合评分如图2.7、图2.8所示。由以下实验数据可以得出，在西洋参饮片粉末的提取过程中，当加水倍量与提取时间保持一致时，随着浸泡时间的延长，西洋参饮片粉末提取液的综合评分总体上呈现先上升而后下降的趋势，其中，在浸泡时间为30min的情况下，综合评分相对处于最高水平，为441.79818，即西洋参提取液中总皂苷、总多糖、总黄酮含量相对最高。图2.7不同浸泡时间条件下西洋参提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量图2.8不同浸泡时间条件的综合评分结果2.2.3提取时间考察实验结果按“1.2.6.3”项下方法操作所得不同提取时间条件下西洋参提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量及综合评分如图2.9、图2.10所示。由以下实验数据可以得出，在西洋参饮片粉末的提取过程中，当加水倍量与浸泡时间保持一致时，随着提取时间的延长，西洋参饮片粉末提取液的综合评分总体上呈现先上升而后下降的趋势，其中，在提取时间为40min的情况下，综合评分相对处于最高水平，为452.7784，即西洋参提取液中总皂苷、总多糖、总黄酮含量相对较高。图2.9不同提取时间条件下西洋参提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量图2.10不同提取时间条件的综合评分结果2.3响应面分析实验结果2.3.1实验设计方案及结果结合单因素实验结果，确定响应面实验设计方案的因素及水平，即加水倍量（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C）三个因素，以各实验单因素最优取值点为中心，上下区域各取一个水平值作为响应面实验设计水平REF_Ref24881\r\h[15]，即加水倍量选择6倍、8倍、10倍；浸泡时间选择20min、30min、40min；提取时间选择30min、40min、50min，以综合评分为综合评价指标，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理对西洋参的提取条件进行优化，设计三因素三水平的响应分析实验如下表2.1所示。根据设计出的实验方案中的不同条件进行试验，每组平行做三次，以三次结果的平均值作为实验结果填入表中，得到的实验设计方案及结果如下表2.2所示。表2.1响应面实验因素水平设置因素水平加水倍量（倍）提取时间（min）浸泡时间（min）ABC-1620300830401104050表2.2响应面实验方案数据及结果序号A:加水倍量B:浸泡时间C:提取时间综合评分162040480.5242102040480.831364040482.5664104040476.326563030483.9416103030485.641763050478.8278103050472.917982030481.1161084030480.9911182050472.4981284050472.9141383040486.9281483040490.1011583040488.4971683040489.5771783040488.7022.3.2回归拟合与分析采用Design-Expert13统计分析软件对实验数据进行响应面分析，通过二阶多项式进行回归拟合，得到综合评分值对实验因素的回归方程为：综合评分=488.76-1.27*A-0.2715*B-4.32*C-1.64*AB-1.90*AC+0.1352*BC-2.62*A2-6.06*B2-5.81*C2。回归模型方差分析结果如下表2.3所示，***表示P<0.001，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著。表2.3回归模型方差分析结果数据来源平方和自由度均方F值P值显著性模型547.3960.8157.7<0.0001***A-加水倍量12.86112.8612.20.0101*B-浸泡时间0.589710.58970.55960.4788C-提取时间149.071149.07141.45<0.0001***AB10.72110.7210.170.0153*AC14.48114.4813.740.0076*BC0.073210.07320.06940.7998A²28.99128.9927.50.0012*B²155.421155.42147.48<0.0001***C²141.921141.92134.67<0.0001***残差7.3871.05失拟项1.4830.49420.33530.8019不显著纯误差5.8941.47

总离差554.6716由以上实验数据可以得出，回归模型P<0.0001，F值为57.7，表明模型的建立有意义；失拟项P=0.8019>0.05，无显著性差异，说明模型拟合度良好，可用此模型和方程来分析和预测西洋参提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和。分析结果显示，变量A、AB、AC、A2的P值均小于0.05（*），C、B2、C2的P值均小于0.001（***），说明加水倍量的一次项、二次项以及加水倍量与浸泡时间、提取时间的交互项均存在显著性差异，而提取时间的一次项、二次项及浸泡时间的二次项均存在极显著性差异。2.3.3响应面结果分析图2.11加水倍量(A)与浸泡时间(B)的响应面等值线图与3D曲面图图2.12加水倍量(A)与提取时间(C)的响应面等值线图与3D曲面图图2.13浸泡时间(B)与提取时间(C)的响应面等值线图与3D曲面图根据二次多项式模型，采用Design-Expert13软件绘制等值线图与3D响应面曲图。响应面曲图的陡峭程度可以反映各因素对响应值影响的大小，响应面图越陡峭，两因素间交互作用越强；两因素间交互作用的强弱也可由等高线的形状反映，等高线图形状越趋向于椭圆形且椭圆形的轴线和坐标轴存在角度，说明两因素间交互作用越显著REF_Ref10096\r\h[16]。由图2.11、图2.12、图2.13可以得出，加水倍量的响应面曲线陡峭程度高于浸泡时间，这表明加水倍量对西洋参提取液中总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和的影响比浸泡时间更为显著；提取时间的响应面曲线陡峭程度同样高于加水倍量，这表明提取时间对西洋参提取液中总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和的影响比加水倍量更为显著；此外，提取时间的响应面曲线陡峭程度高于浸泡时间，这表明提取时间对西洋参提取液的总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和的影响比浸泡时间更为显著。综上所述，各因素对西洋参总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和的影响程度依次排列为：提取时间>加水倍量>浸泡时间，与方差分析结果一致；各因素交互作用对西洋参饮片粉末提取液中总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和的影响程度依次排列为：AC>AB>BC。2.3.4最佳工艺的预测与验证借助Design-Expert13软件进行分析，确定西洋参煮散剂的最佳提取工艺参数如下：加水倍量为6.490倍，浸泡时间为27.045min，提取时间为31.396min。在此条件下，西洋参饮片粉末提取液的综合评分，即总皂苷、总多糖、总黄酮含量之和的理论预测值为485.622。为了方便起见，确定西洋参煮散剂的最佳提取工艺条件为：加水倍量为6倍、浸泡时间为30min、提取时间为30min，为了验证模型方程的适用性和可靠性，根据所确定的提取工艺条件设计实验，平行操作三组REF_Ref1528\r\h[17]，所得结果如下表2.4所示。表2.4工艺验证结果试验号综合评分平均值RSD/%1485.3712483.962484.6640.12%3484.659由以上数据可以得出，综合评分平均值为484.664，RSD=0.12%，表明所建立的模型有效，该方程能够客观地反映各因素对西洋参饮片粉末提取液中总皂苷、总多糖、总黄酮含量的影响。结论本实验将西洋参饮片粉碎至分别过药典1-7号筛，与饮片一起，使用酶标仪，利用香草醛-高氯酸法、苯酚-硫酸法、亚硝酸钠-硝酸铝法分别测定在不同粉碎力度条件下西洋参饮片及饮片粉末提取液中的总皂苷、总多糖、总黄酮含量，以含量之和为综合评价指标，其中过药典2号筛的西洋参饮片粉末提取液的总含量最高，即确定西洋参煮散剂的最佳粉碎力度为过药典2号筛。以过药典2号筛的西洋参饮片粉末为实验原料，进行单因素实验，分别考察当浸泡时间