DB5333T 12.5-2018 兰坪乌骨绵羊养殖技术规范 第5部分：胚胎移植技术

ICS65.020.30B43怒江傈僳族自治州质量技术监督局发布DB5333/T12.5—2018I《兰坪乌骨绵羊养殖技术规范》分为以下6个部分：——第1部分：品种；——第2部分：区域布局；——第3部分：饲养管理；——第4部分：饲草加工调制技术；——第5部分：胚胎移植技术；——第6部分：产品质量。本部分为DB5333/T12的第5部分。本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由云南省兰坪县兰坪乌骨绵羊养殖农业标准化示范区项目领导小组提出。本标准由怒江州质量技术监督局归口。本标准主要起草人：洪琼花、李俊东、李东江、权国波、张兴仁、和四池、李庆亮、张韩。DB5333/T12.5—20181兰坪乌骨绵羊养殖技术规范第5部分：胚胎移植技术本标准规定了兰坪乌骨绵羊术语和定义、胚胎移植的基本原则、供体羊、供体羊的超排与配种、胚胎回收、胚胎质量鉴定、供受体羊的同期发情处理、胚胎移植、妊娠受体羊的饲养管理。本规范适用于兰坪乌骨绵羊的超数排卵及胚胎移植的各个环节。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T826绵羊胚胎移植技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1供体羊提供卵子或胚胎的优秀繁殖母羊。3.2受体羊接受胚胎（移植）的母羊。3.3同期发情使用外源激素来调控一群母羊的发情时间，使之在预定的时间内集中发情并排卵。3.4超数排卵（简称超排）在母羊发情周期的适当时间，使用外源激素诱导更多的卵泡正常发育，并多排卵。3.5胚胎移植将受精卵（胚胎）移植到受体子宫角内。4胚胎移植的基本原则4.1胚胎供体与受体在分类学上属于同一物种。4.2胚胎发育阶段与受体母羊发情时间上的一致性,即供、受体母羊发情时间相差不超过24小时。DB5333/T12.5—201824.3胚胎发育阶段与受体生殖道解剖位置的一致性,即从供体母羊输卵管收集到的胚胎应移植到受体供体羊的选择与饲养管理5供体羊5.1供体羊的选择5.1.1供体羊应符合兰坪乌骨绵羊的典型特征，谱系清楚，遗传性稳定，种用价值高。5.1.2体质健壮，膘情中等。5.1.3繁殖机能正常、无遗传和传染性疾病。5.1.4年龄在2岁～6岁。5.2供体羊的饲养管理5.2.1单独组群，专人管理。5.2.2保持饲养环境稳定，避免应激反应，期间不得任意变换草料和管理程序。5.2.3加强饲养，在优质牧草地放牧，补充高蛋白、维生素和矿物质，并供给盐和清洁的饮水，保证正常的营养平衡。5.2.4参照NY/T826-2004绵羊胚胎移植技术规程，详细记录羊只的饲喂方式、饲料配方，以及疾病诊治、驱虫羊只的年龄、胎次、体重、上次发情时间、上次产羔时间、断奶时间、上次冲胚时间等情况。5.2.5注射维生素A、D、E合剂，促发情、提高妊娠免疫。6供体羊的超排与配种6.1超排处理6.1.1超排激素FSH（促卵泡素）、PGF2a、CIDR（孕酮阴道栓）、PMSG（孕马血清）。6.1.2超排方法6.1.2.1FSH+PG法在自然发情周期的任意一天给母羊埋置孕酮阴道栓，第11天开始采用递减法每天早晚各注射一次FSH，连续注射4天，在第5次注射FSH时，同时肌注PGF2α。6.1.2.2FSH+PMSG法在自然发情周期的任意一天给母羊埋置孕酮阴道栓，第11天开始采用递减法每天早晚各注射一次FSH，连续注射4天，在第1次注射FSH时，同时注射PMSG300IU。6.2发情鉴定在注射第七针FSH的同时撤除孕酮阴道栓，FSH注射完毕，随即每天早晚用试情公羊（带试情布或结扎输精管）对超排供体羊进行试情，以母羊站立接受试情公羊爬跨作为发情的标准。6.3配种供体母羊发情后，每日上、下午各配种一次，直至发情结束。DB5333/T12.5—201837胚胎回收7.1采卵（胚胎）时间以供体母羊发情日为0天，在5.5～7天或2～3天用手术法分别从子宫和输卵管回收胚胎或受精卵。7.2采卵（胚胎）前的准备7.2.1手术室设置及要求在手术室内设专门套间，作为胚胎操作室。手术室要求洁净明亮，光线充足、无尘、地面用水泥或砖铺成，配备照明用电。室内温度应保持在20～25℃。手术室定期用3～5%煤酚皂溶液喷洒消毒，手术前用紫外灯照射1～2小时，手术过程中不能随意开启门窗。7.2.2回收胚胎所需主要器械羊胚胎移植主要器械与设备见附录C。7.2.3回收胚胎所需药品新洁尔灭、静松灵、0.9%生理盐水、酒精、碘酒、青霉素、链霉素等。7.2.4冲胚液的配制基液：杜氏磷酸缓冲液（PBS），配方见附录A。也可用进口PBS粉配制。冲胚液：含1%FCS（胎犊牛血清）或CS（犊牛血清）的PBS液。7.3采卵（胚胎）步骤7.3.1供体羊准备7.3.1.1停食供体羊手术前应停食24～48小时，可供给适量饮水。7.3.1.2供体羊的保定和麻醉供体羊仰放在手术保定架上，四肢固定。按每公斤体重0.03～0.05ml2%静松灵肌注麻醉。7.3.1.3手术部位及消毒手术部位一般选择乳房前肢中线部（在两条乳静脉之间）或腹中浅的两侧均可。用电剪或毛剪剪去术部毛，刮净毛茬，分别用清水和消毒液清洗局部，然后由里向外涂以2%～4%的碘酒，待干后再用75%的酒精棉脱碘。盖上创巾，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。7.3.2术者的准备术者应将指甲剪短，并锉光滑，穿清洁手术服、戴工作帽和口罩。术者将手指尖到肘部先后在温水、0.1%的新洁尔灭液中浸洗5分钟，双手消毒后，要保持供手姿势，避免与未消毒过的物品接触，一旦接触，即应重新消毒。7.3.3手术法回收卵（胚胎）7.3.3.1组织分离DB5333/T12.5—20184避开较大血管和神经、切口边缘与切面整齐、切口方向与组织走向尽量一致、依组织层次分层切开、切口长约5厘米。7.3.3.2切开皮肤用右手的食指和拇指在预定切口的两侧将皮肤撑紧固定，右手用餐刀式执刀，由预定切口起点至终点一次切开，使切口深度一致，边缘平直。7.3.3.3切开皮下组织皮下组织用执笔式执刀法切开，切时可先切一小口，再用外科剪刀剪开。7.3.3.4切开肌肉7.3.3.5用钝性分离法。按肌肉纤维方向用刀柄刺开一小切口，然后将刀柄末端或用手指伸入切口，沿纤维方向整齐分离开，避免损伤肌肉的血管和神经。7.3.3.6切开腹膜先用镊子提起腹膜，在提起部位作一切口，然后用另一只手的手指深入腹膜，用外科剪将腹膜剪开。术者将食指及中指由切口伸入腹腔，在骨盆腔、膀胱周围触摸子宫角，并将卵巢、子宫引出切口外，记录两侧卵巢黄体和滤泡数。7.3.3.7止血毛细血管出血用沙布轻压出血处即可，小血管用止血钳止血，较大血管除用止血钳夹住暂时止血外，必要时还需用缝合线结扎止血。7.3.3.8采卵（胚胎）方法7.3.3.8.1输卵管法供体羊发情后2～3天从输卵管采集2～8细胞胚胎，进行鲜胚移植。方法：将冲卵管一端由输卵管伞部的喇叭口插入，约2～3厘米深，另一端接集卵皿，用注射器吸取37℃的冲卵液5～10ml，在子宫角靠近输卵管的部位，将针头朝输卵管方向扎入，一人操作，一只手的手指在针头后方捏紧子宫角，另一只手推注射器，冲卵液即由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流至集卵皿。此法优点是卵的回收率高，冲卵液用量小，检卵省时间。缺点是容易造成输卵管，特别是伞部的粘连。7.3.3.8.2子宫法在超排母羊发情后5.5～7天从子宫采集桑椹胚至扩张囊胚，胚胎可用于鲜胚移植、冷冻、分割及其它研究。方法：用带胶管的肠钳夹在一侧子宫角基部，冲卵针头（钝形）从子宫角尖端插入，当确认针头在管腔内，进退通畅时，把冲卵液缓慢注入子宫腔，待子宫角适度膨胀后，用子宫导卵管从子宫角基部导入子宫腔，导卵管另一端接平皿，同时轻轻挤压子宫角前端，将冲卵液导出，每侧子宫角需要约30ml冲卵液。另一侧子宫角用同样方法冲洗。子宫法对输卵管损伤较小，尤其不涉及伞部，但卵回收率较输卵管法低，用液较多，检卵较费时。7.3.3.9缝合7.3.3.9.1要求DB5333/T12.5—20185缝合前创口必须彻底止血，用加肝素的灭菌生理盐水冲洗，清除手术过程中形成的凝块等；按组织层次分层缝合，对合严密、创缘不内卷和外翻，缝合进针和出针要距创缘0.5厘米左右，针间距要均匀，所有结要打在同一侧。7.3.3.9.2方法采用三层缝合法，即腹膜、肌肉连续缝合；皮肤结节缝合，针角间距1厘米。在肌肉与皮肤之间撒适量青、链霉素粉，以防创口感染。7.3.3.10术后处理采卵完毕后，用37℃灭菌生理盐水+肝素湿润母羊子宫，冲去凝血块，再涂少许灭菌液体石蜡，以防粘连，将器官复位。8胚胎质量鉴定8.1检卵（胚胎）操作要求检卵者应熟悉体视镜的结构，做到熟练使用。找卵的顺序应由低倍到高倍，一般在10倍左右即能发现卵子，对胚胎鉴定分级时再转向高倍。8.2找卵（胚胎）要点根据卵子的比重、大小、形态和透明带折光性等特点找卵。卵子的比重比冲卵液大，一般位于集卵皿的底部；山羊卵直径为150～200μm，是一球形体，在光镜下呈圆形，其外层是透明带，镜检找到的卵（胚）数应和卵巢上排卵点的数量大致相当。8.3检卵（胚胎）方法将检出的胚胎吸入盛有保存液的Φ35mm培养皿中，在培养皿中的不同位置冲洗胚胎3～5次，然后把全部卵移至另一个培养皿；每换一个培养皿时应换新的玻璃吸管，一个供体的卵（胚）放在同一个皿内。8.4胚胎的质量鉴定——形态学方法8.4.1胚胎的发育阶段，见早期胚胎的发育形态模式图附录E。8.4.2发情授精后2～3天从输卵管回收的卵，发育阶段为2～8细胞期，可清楚地观察到卵裂球，卵黄腔内空隙较大。8.4.3桑椹胚——发情后第5～6天回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球，细胞团占据卵黄腔的大部分。8.4.4致密桑椹胚——发情后第6～7天回收的胚胎，细胞团变小占卵黄的60-70%。8.4.5旱期囊胚——发情后第7～8天回收的胚胎，细胞团的一部分出现发亮的胚泡团和滋养层。8.4.6囊胚——发情后第7～8天回收的胚胎，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满卵黄腔。8.4.7扩张囊胚——发情后第8～9天回收的胚胎，囊腔明显扩大，体积增大到原来的1.2～1.5倍,与透明带之间无空隙,透明带变薄，相当于正常厚度的1/3。8.4.8孵化胚——一般在发情后第9～11天，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，胚细胞脱出。凡在发情后第6～8天回收的16细胞以下的受精卵均列为非正常发育卵，不能用于移植或冷冻保存。8.4.9胚胎的质量鉴定DB5333/T12.5—20186用形态学方法进行胚胎质量鉴定，分为1、2、3、4四级。——1级：优秀胚。发育正常，胚龄与发育期相吻合，卵裂球轮廓清楚，透明度适中，细胞密度大，卵裂均匀，无变性的细胞。——2级：良好胚。发育基本符合预定胚龄，轮廓清楚，明暗适中或稍暗稍淡，细胞密度较小或小型卵裂球过多，细胞变性率为10～20%。——3级：一般胚，轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，细胞变性率为30～40%。——4级：不可用胚。未受精卵和变性胚。8.5受体羊的选择及饲养管理8.5.1发情周期正常，无繁殖机能疾病的经产羊。8.5.2健康、膘情在七成以上。8.5.3年龄在2～6岁之间。8.5.4受体羊单独组群加强饲养，保持环境相对稳定，避免应激反应。9供体羊的同期发情处理9.1自然发情对受体羊群自然发情进行观察，与供体羊发情前后相差一天的羊，可作为受体。9.2诱导发情用孕酮阴道栓控制同期发情，即在发情周期的任意一天将孕酮栓塞入阴道深处，至13～14天取出，在取孕酮栓的前一天或当天，肌肉注射氯前列烯醇1支。24小时前后受体羊可表现发情。9.3发情观察供、受体羊均采用试情公羊确认发情，早晚各观察一次，以发情之日定为0天，比供体羊提前12小时发情的定为+12小时受体，比供体羊推迟12小时发情的受体定为-12小时受体。鲜胚移植时0小时受体，±12小时受体移植效果无显著差异，如果受体缺乏，可使用±12小时受体，超过±24小时的受体不再使10胚胎移植10.1移植季节最好选在7～12月份最为适宜。10.2受体羊的准备受体羊术前需空腹12～24小时，仰卧或侧卧于手术保定架上，肌注0.3～0.5ml2%静松灵。手术部位及手术要求与供体羊相同。10.3胚胎移植的部位与供体母羊冲胚部位一致，输卵管胚进行输卵管移植，子宫胚进行子宫移植。10.4输卵管移植DB5333/T12.5—20187将有黄体一侧的输卵管伞部拨开，找到管口，把装有胚胎的移植器从此插入3～4厘米，然后将胚胎轻轻推出即可。10.5子宫移植（鲜胚和冻胚）将有黄体一侧的子宫角取出，用尖端磨钝的16#针头在子宫壁上扎一孔，把装有胚胎的移植器从此孔插入子宫腔内，伸至子宫角尖端后将胚胎轻轻推出即可。10.6移植胚胎注意要点10.6.1胚胎移至黄体侧子宫角，无黄体不移植，一般移2枚胚胎。10.6.2在子宫角打孔时应避开血管，防止出血。10.6.3不可用力挖卵巢，不能触摸黄体。10.6.4胚胎发育阶段与移植部位相符。10.6.5对受体黄体发育按突出卵巢的直径分为优、中、差，优：0.6～1.0cm，中：0.5cm，差：小于0.5cm。11妊娠受体羊的饲养管理11.1受体羊要加强饲养管理，避免应激反应。11.2受体羊术后1～2个情期内注意观察返情情况，若返情则进行配种或移植。11.3妊娠受体羊在产前2个月要补充足量的维生素、微量元素，适当限制能量摄入，既要保证胎儿的正常发育，又要避免难产。11.4产羔期护理。受体羊产羔期需精心管理，做好助产，双羔合并哺乳及保姆羊带乳，并要保证哺乳期营养需要。产羔记录应详细、认真。DB5333/T12.5—20188附录A（规范性附录）冲卵液的配制A.1杜氏磷酸缓冲液（PBS）配方表A.1杜氏磷酸缓冲液（PBS）配方试剂材料浓度用量氯化钠Nacl136.87mM8.00g/L氯化钾Kcl2.68mM0.20g/L氯化钙Cacl2(Cacl22H2O)0.90mM0.10g/L(0.132g/L)磷酸氢钾KH2PO41.47mM0.20g/L磷酸氢钠8.09mM1.15g/L(2.916g/L)氯化镁Mgcl2(Mgcl2.6H2O)0.49mM0.10g/L(0.2133g/L)丙酮酸钠0.33mM0.03g/L葡萄糖(葡萄糖.H2O)5.56mM1.00g/L(1.10g/L)青霉素100单位/ml链霉素100单位/mlA.2PBS液的配制配制PBS所用水是电阻值超过18兆欧的超纯水。为了便于保存，可用超纯水分别配制成A液和B液，以便高压灭菌，也可配制成浓缩10倍的原液。配好的A、B原液和超纯水分别高压、灭菌，低温保存待用。冲卵液PH值应为7.2～7.6，渗透压为270～290osm。PBS中加0.4%的牛血清白蛋白可用于胚胎的体外操作和保存，也可直接做为冲卵液用于羊的手术冲胚和移植。表A.2不同容积PBS液配制试剂用量表原液试剂不同容积试剂用量500ml1000mlA液氯化钠Nacl8.00g40.00g80.00g氯化钾Kcl0.20g2.00g氯化钙Cacl20.10g0.50gMgcl2(Mgcl2.6H2O)0.10g0.50gB液Na2HPO4（Na2HPO4.7H2O）1.144g（2.16g）5.72g（10.8g）11.44g（21.6g）KH2PO40.20g2.00gDB5333/T12.5—20189（规范性附录）实验的准备B.1器具的洗刷B.1.1器具使用后立即浸于水中，流水冲洗，然后再用洗涤液清洗。B.1.2新的玻璃器皿用清水洗净后，放入洗液或稀盐酸中浸泡24小时，流水冲洗掉洗液，再用洗涤液认真刷洗，或用超声波洗涤器洗涤。B.1.3水洗：从洗涤液中取出后立即放入流水中，冲洗3小时完全冲掉洗涤液。B.1.4洗净：用蒸馏水洗5次，再用超纯水冲洗2次。B.1.5干燥和包装：洗净后的器具放入干燥箱烘干，再用白纸或牛皮纸包装待消毒。B.2器具的灭菌B.2.1高压灭菌：器具经包装后放入高压灭菌器内，在121℃（1kg/cm2）处理30分钟，PBS等培养液处理15分钟。B.2.270%酒精浸泡消毒：聚乙烯冲卵管以及乳胶管等，洗净后可在70%酒精液中浸泡消毒。B.3培养液的灭菌装有滤膜的滤器经高压灭菌后使用，培养保存液用0.22um滤膜，过滤时应弃去开始的2-3滴。DB5333/T12.5—2018（规范性附录）羊胚胎移植主要器械与设备C.1回收胚器械C.1.1冲卵管——带硅胶管的7号针头（钝形）。C.1.2回收管——带硅胶管的16号针头（钝形）。C.1.3肠钳——（套乳胶管）。C.1.4注射器：20ml、10ml、5ml、3ml、2ml、1ml。C.1.5集卵杯：50ml或100ml烧杯。C.2检胚设备C.2.1体视显微镜。C.2.2Φ35mm培养皿。C.2.3表面皿。C.2.4巴氏玻璃管。C.2.5培养箱。C.3移植C.3.112号针头。C.3.2移植器：用卡介苗注射器控制成长5～6cm，直径1～1.2mm的细管，冷却后用砂片将尖端断齐，再将芯插入管内，将断齐的口端在酒精灯上烘圆滑，即制成移植器。C.4手术器械C.4.1毛剪、外科剪（尖头）。C.4.2活动刀柄、刀片。C.4.3止血钳（弯头、直头）。C.4.4创巾夹。C.4.5持针器。C.4.6手术镊（带齿）。C.4.7缝合针（园刃针、三棱针）。C.4.8缝合线（丝线、肠线）。C.4.9创巾。C.4.10手术保定架。C.4.11活动手术器械车。C.5其他C.5.1蒸馏水装置一套。DB5333/T12.5—2018C.5.2超纯水仪一台。C.5.3干燥箱一台。C.5.4高压消毒锅一台。C.5.5滤器、滤膜。C.5.6PH计一台。C.5.7渗透压仪一台。C.