临床基因扩增检验实验室操作规范

为使基因扩增检查技术有效地应用于临床,更好地为疾病的防止、诊断和治疗

服务，保

证检查质量，特制定本规范。

一、临床基因扩增睑查试验室的规范化设置及其管理

临床基因扩增检查试验室口勺规范化设置详见《临床基因扩增检查试验室管理暂

行措施》

（卫医发12023]10号文附件《临床基因扩增检查试验室基本设置原则》。为防

止污染，必须

严格遵照《临床基因扩增检查试验室设置原则》设置临床基因扩增检查试验

室。

临床基因扩增检查试验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设

备。各区

域都必须有明确日勺标识，以防止设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内

移出从而导致

不一样的）工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵照单一

方向次序，即只

能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩

增区至产物分

析区,防止发生交叉污染。在不一样日勺工作区域应使用不一样颜色或有明显区

别标志日勺工作服，

以便于鉴别。此外，当工作者离动工作区时,不得将各区特定日勺工作服带出。

清洁措施不妥也是污染发生的一种重要原因，因此试验室的清洁应按试剂贮存

和准备区

至扩增产物分析区日勺方向进行。不一样的试验区域应有其各自的清洁用品以防

止交叉污染。

（一试剂贮存和准备区

下述操作在该区进行:贮存试剂的制备、试剂日勺分装和主反应混合液日勺制备。

贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能通过产

物分析

区。在打开具有反应混合液的离心管或试管前，应将其迅速离心数秒。试剂原

材料必须贮存

在本区内，并在本区内制备成所需口勺贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，

应将其分装

贮存备用，防止由于常常打开反应管吸液而导致污染。

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应迅速离心数秒。大多数用于扩增时

试剂都应

冰冻贮存。为防止因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存

试

剂溶液。贮

存试剂的分装体积根据一般在试验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。

主反应混合液的构成成分尤其是聚合酶的合用性和稳定性通过预试验来检查，

评价成果

必须有书面汇报。对于“热启动”技术（在第一种高温变性环节后加入酶，聚合酶

也可不包

含在主反应混合液中。

在整个本区日勺试验操作过程中，操作者必须戴手套，并常常更换。此外，操作中使

用_

要对日勺使用加样器。由于在加样操作中也许会发生气溶胶所致的污染，因此应

防止在本

区内不必要日勺走动。可通过在本区内设置正压条件防止从邻近区进入本区的气

溶胶污染。为

防止样本间日勺交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液日勺反应管。对

具有潜在传

染危险性日勺材料，必须有明确日勺样本处理和灭活程序。

用过口勺加样器吸头必须放入专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液容器内。试验室

桌椅表面

每次工作后都要清洁，试验材料（原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂

日勺混合液等

如出现外溅，则必须分别处理并作出记录。

对试验台合适的紫外照射（254nm波长，与工作台面近距离适合于灭活去污染。

可移动

紫外线管灯可用来保证工作后对试验台面时充足照射。

样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效日勺核酸提取措施，可在开展临床

标本检

测前对提取措施进行评价。

用于RNA扩增检测日勺样本制备好后来，应立即进行cDNA合成，由于cDNA

链较RNA稳定，保

存相对轻易。为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一种以上的温育

装置。

cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定，倾向于使用一步法:虽然用在扩增反

应缓冲液

条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录，其较cDNA合成后

再开盖以调整缓

冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染的也许性戒少。

待测RNA日勺cDNA拷贝须保留在标本制备区，不得在本区对样本进行PCR扩

增。

（三扩增区

下述工作在本区内进行:DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成

的cDNA（来自

样本制备区日勺加入和主反应混合液（来自试剂贮存和制备区制备成反应混合液

等也可在本

区内进行。在巢式PCR测定中，一般在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式

扩增有较高

日勺污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

不能从本区再进入任何“上游”区域，可减少本区日勺气压以防止气溶胶从本区漏

出。

为防止气溶胶所致口勺污染，应尽量减少在本区区日勺走动。如有加样则应在超净

台内进行。

打开预处理过时反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增环节之

间。一种简朴日勺

措施是在打开反应管前迅速离心数秒。可使用体积较小的离心机，因其所占试

验台面小，易

于用一只手操作，适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有

防

污染作用，

但必须注意日勺是，矿物油自身也也许成为一种持续性的污染源。用过的加样器

必须注意清洁

消毒。

完毕操作及每天工作后都必须对试验室台面进行清洁和消毒，紫外照射措施与

前面区域

相似。如有溶液溅出，必须处理并作出记录。

（四扩增产物分析区

下述操作在本区内进行:扩增片段日勺测定。

核酸扩增后产物的分析措施多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交措施（同位素

标识或

非同位素标识、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸

测I序措施等。

目前国内日勺商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标识的微孔板上探针杂交措施,

PCR-ELISA

措施，也有膜上探针杂交措施。

本区是最重要日勺扩增产物污染来源,因此必须注意防止通过本区的物品及工作

服将扩增

产物带出。在使用PCR-ELISA措施检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板.废

液必须搜集至

Imol/LHCl中，并且不能在试验室内倾倒，而应至远离PCR试验室口勺地方弃掉。

用过的吸头也

必须放至Imol/LHCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。

由于本区有也许会用到某些可致基因突变和有毒物质如漠化乙锭、丙烯酰胺、

甲醛或同

位素等，故应注意试验人员日勺安全防护。

本区日勺清洁消毒和紫外照射措施同前面区域。本区如采用负压条件或减压状况

下（如安

装排风扇可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的也许性。

二、临床基因扩增检查试验室质量保证

临床基因扩增检查试验室质量保证波及到整个基因扩增检查的所有阶段，即测

定分析前

日勺标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的成果汇报

等。

（一标本的采集

常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸椽酸钠抗凝全血或骨髓、血

清或血浆、痰、

脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血

管。当使用

非密闭采样系统时,如尿、分泌物和骨髓口勺采样，必须注意防止来自采样者的皮

屑或分泌物

日勺污染。采样时必须戴一次性手套。

玻璃器皿在使用前应高压处理，由于玻璃器皿常具有不易失活的RNA酶。最佳

是热灭菌，

250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。

全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸椽酸盐是首选日勺抗凝剂。不能

使用肝素抗

凝，由于肝素是T叫酶日勺强克制剂,并且在其后的核酸提取环节中很难清除。

临床用于RNA（如HCVRNA扩增检测的血标本提议进行抗凝处理,并尽快（3小

时以内分

离血浆，以防止RNA的降解。如未作抗凝处理厕抽血后,必须在1小时内分离

血清。

（二标本的稳定化处理

用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需要特殊日勺稳定化处理，但标本应及

时送至实

验室。

由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定日勺标本有时必须进行稳定化

处理,如流行

病学调查日勺现场采洋。异硫氟酸胭盐（GuanidineThiocyanate,GITC可使DNA

酶和RNA酶立

即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4日勺比例加至具有

5mol/LGITC

的试管中，从而使血清（浆中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本

一般不需要

冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理措施的效果究竟怎样，要

使用对应日勺

逆转录PCR测定措施来评价。

（三标本的运送

标本采集后必须尽快送至试验室。通过合适稳定化处理的标本可在常温下通过

邮寄运

送。如用于DNA扩增检测日勺EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经

GITC

稳定化处理日勺标

本。一般在运送时，应采用不易破碎日勺容器装载标本。用于RNA检测日勺标本，

假如木经稳定

化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。

（四标本的贮存

临床体液标本如血清/血浆等可于-70C下长时间贮存。用于DNA测定日勺已纯

化核酸样本

可在10mmol/LTris-lmmol/LEDTA缓冲液（pH7.5-8.0中4℃保留。用于RNA

测定日勺已纯化核

酸样本应在缓冲液中-80C或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20C

即可。用GITC

处理曰勺RNA标本在室温可保留7天。

（五标本的处理（核酸提取

标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性环节，在使用商品核酸

提取试剂

提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充足评价以验证其提取的有效性。

一般,核酸制

备质量不高是由于克制物清除不完全所致，克制物也许来源于标本自身（如血红

素及其前体

或降解产物或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等，这些物质对其后

的Taq酶扩

增反应环节具有强烈的克制作用.从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时,

则必须先进

行液化处理,再提取核酸。需注意日勺是，液化时不能加热,液化时间不能过长，此

外，当靶

核酸为RNA时,逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充足的

稳定化处理及核酸

提取试剂的RNA酶日勺污染。对于前者,要核查测定分析前日勺环节，假如发既有

RNA降解日勺证据，

试验室则应拒绝接受标本，规定重新采用标本，并对运送者给以详细日勺指导。对

于后者，建

议使用高质量的商品核酸提取试剂。

（六靶核酸的逆转录（RT和扩增

1、靶RNA的）逆转录

cDNA合成为逆转录PCR中日勺第一种酶反应环节，所产生日勺cDNA为靶RNA

的反向互补链，为

背面扩增日勺模板。下述原因一般影响cDNA合成的效率:(1逆转录效率的减少

或完全缺乏。

其也许日勺原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等;(2用于逆转

录日勺标本中

存在逆转录或Taq酶的克制物(如酚、氯仿、血红素等:(3RNA酶日勺存在导致

RNA日勺降解。

2、核酸的扩增

有多种原因可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性成果，如扩增靶核酸中克制

剂存在、

Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩

增仪孔中热传导

日勺均一性极为重要，必须定期对扩增仪日勺温度控制和加热模块中热传导的一致

性进行检查，

以防止假阴性成果。

（七污染

在实际工作中，常见有如下几种污染类型:扩增片段的污染（产物污染;天然基因

组DNA

日勺污染、试剂污染（贮存液或工作液以及标本间交叉污染（如气溶胶从一种阳性

标本扩散到

原本阴性的标本。临床基因扩增检查试验室中污染的最重要来源是扩增产物的

污染。

由于一旦发生污染后，再围绕试验室来寻找污染源不仅耗时并且还很繁琐，因此

防止污

染重在防止。但假如发生了污染，试验就必须停止，直到发现了污染源为止，并且

试验成果

必须作废。

1、测定分析前的污染源

测定分析前试验材科的污染重要来自非病人标本来源的核酸。

2、测定分析阶段的污染源

一般,测定分析阶段日勺每一步都也许发生对样本口勺污染。反应混合液的任何成

分及核酸

的制备和反应建立阶段所波及到的试验设备的任何部位都是也许的污染源。如

受污染日勺试剂

（例如牛血清白蛋白，明胶或矿物油、商品酶制剂、消耗品（如反应管，吸头和试

验设备（如

加样器、离心机等。

在前面三个工作区中，不妥口勺试验操作会引起所使用的试剂、消耗品或试验设

备日勺污染。

而在产物分析区,当吸取扩增产物用于检测时，丰常轻易引起污染，因此必须制定

原则操作

程序（SOP,并严格执行。

3、污染的防止

要防止污染，首先应是防止而不是排除污染，前面所述对工作区日勺严格划分的目

的）即是

为了防止污染。

为防止此前测定中所产生的扩增产物的污染,可设法将其破坏掉。如在扩增反

应中用

dUTP取代部分dTTP,使得产生的特异扩增片段具有尿嘘咤，这样扩增前在反应

混合液中加入

尿喀碇糖甘酶（UNG,可破坏来自此前测定的扩增产物，从而防止其对后来要进行

的）扩增测

定日勺污染。此外一种措施是持续的长波紫外灯照射，通过异补骨脂素光化学产

生DNA加合物，

由于DNA加合物对扩增没有反应但又不阻碍PCR后杂交过程,因此这种措施

也能防止污染。

上述防污染措施只在一定程度上有效，因此不能用其来替代严格的试验室设置

和管理，

尤其是这些措施不能防止外来非扩增的天然DNA曰勺污染。

4、清除污染的措施

工作完后必须定期对试验室采用有效的去污染措施，结合多种不一样的措施可

到达最佳效

果。去污染措施包话但不仅限下面几种：(1用IO%(v/v次氯酸钠清洁表面;(2试

验后长时

间的紫外照射试验操作台面和其他表面;(3试验设备如加样器的高压消毒。

(八扩增产物的分析

扩增产物日勺测定有多种措施，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测

序、分光

光度法定量等，但临床PCR检查项目基本上都使用探针杂交措施。

杂交成果不充足日勺原因也许是基因探针不合适、标识措施不对、对探针的标

记不够、杂

交或洗涤措施不合适等。

最常使用日勺基因探针有:DNA片段、合成的寡核甘酸和体外转录日勺反义RNA

探针。探针的

标识物常用日勺有生物素、地高辛、荧光素和同位素等。

在扩增后日勺杂交检测中，应当严格遵守商品试剂盒确定日勺杂交程序和杂交条

件。温度太

低或离子强度太高都会减少杂交的严格性.还会给检测信号的特异性带来负面

影响。相反，

提高温度和/或减少离子强度会增长杂交的）严格性。因此,严密控制温度和试剂

的离子强度

是防止假阳性和假阴性成果的先决条件。要注意的是,温度和离子强度不能同

步变化。

（九质量控制

质量控制包括两个方面，即室内质量控制（如下简称质控和室间质量评价。

1、室内质量控制

必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制，以防止假阳性和假阴性,保任测

定成果日勺准

确性和反复性。由于核酸扩增测定的高敏感性，因此标本制备、逆转录、扩增

自身和产物分

析中日勺每一步都规定有质控措施。

（1标本制备:

常用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA提取效果，以判断所提取日勺DNA与否发生降

解。用常规日勺

手工提取措施制备日勺DNA日勺平均长度一般为~100kb,用适合PCR的DNA提取

试剂盒制备日勺DNA

口勺长度平均范围为30-40kb。明显出现降解的1DNA（在1和10kb的）低分子量范

围内在经琼脂糖

凝胶电泳分离和用演化乙锭染色后也可见强的荧光信号。用对甲基化不敏感的

限制性内切酶

（如EcoRI消化DNA,然后电泳分离，可以对酶活性的克制剂进行质控（在克制剂

存在日勺状况

下，高分子量日勺片段不被酶切。潜在日勺克制剂的存在一般用260nm和280nm的）

分光光度测定

来估计，质量好日勺DNA提取物,A260/A280比值应当在1.7520之间;否贝IJ,残留

口勺蛋白或酚可

能会很高。仅用光度计比色措施不能对DNA的完整性下结论。

最快日勺对总RNA提取质量控制口勺措施是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电泳.这

一点跟DNA

分离相似。但假如对成果有疑问.就应当在变性日勺条件下作琼脂糖凝胶电泳以

检测RNA的完整

性。在理想状况下，三种重要日勺核糖体RNA（28S、18s和5s在凝胶上出现为带

相对较窄。如发

生RNA日勺降解，则出现大量低分子量带或出现带日勺消失。测定核糖体RNA带

日勺密度指数可作为

对RNA制备的）质量评价日勺试验室内日勺原贝IJ;对向低分子量拖尾的）、不对称性的

峰日勺评估也是

RNA完整性日勺合适日勺指标。此外,琼脂糖凝胶电泳能显示出在RNA曰勺制备中

被DNA污染的程度。

由于这些原因，单独日勺光度计比色措施也不能对RNA日勺完整性下结论。

对于血清（浆中病毒的测定，则要评价标本出现溶血、脂血和黄胆状况下标本处

理方

法对扩增检测的影响，防止由于标本处理措施的不妥而出现假阴性成果。此外，

还可采用已

知浓度标本评价核酸提取措施的效果。

（2逆转录和扩增:本部份包括阳性质控和阴性质控。

对逆转录和核酸扩增口勺质控既可使用内标质控措施也可采用外标质控措施。逆

转录-扩

增检测日勺内标一般为在整个细胞周期中均匀体现的mRNA,如HLA、。肌动蛋

白和组蛋白H3.3

的mRNA或14SrRNA等。此外，也可在标本制备时将外来内标加入到样本中

共同提取、逆转录

及扩增。当标本中存在逆转录克制物，或核酸提取中发生RNA降解，或逆转录

酶失活，内标

即会体现为阴性成果。对于DNA测定内标可使用对有机体存活所必须的鸵基

因，如维生素D

血浆结合蛋白的基因。对于病原体的）基因检测，内标多采用人工制备的）竞争性

内标。内标可

以监控每一扩增孔中假阴性的产生状况。

目前日勺商品试剂盒大部分没采用内标措施质控。因此在测定血清/血浆病原体

核酸如HBV

DNA、HCVRNA等时,应使用已知日勺弱阳性血清/血浆作为质控样本，与待测临

床标本等同处

理提取核酸及扩增,以判断逆转录及扩增检测的效果。

使用这些外加弱阳，生质控不仅可检测扩增反应液的质量，还可获得