生物工程下游技术闭卷考试题库及答案

生物工程下游技术闭卷考试题库及答案一、单项选择题1.在蛋白质的盐析沉淀中，最常用的中性盐是：A.硫酸铵B.氯化钠C.硫酸钠D.磷酸钾答案：A解析：硫酸铵因其溶解度大、盐析效果好、对蛋白质稳定性影响小、价格低廉且不易引起蛋白质变性，成为蛋白质盐析中最常用的中性盐。2.离心分离操作中，用于表示离心机分离能力的关键参数是：A.转速（rpm）B.离心时间C.相对离心力（RCF）D.转子半径答案：C解析：相对离心力（RCF）是离心加速度与重力加速度的比值，能更科学地反映离心场的强度，是衡量离心机分离能力的核心参数，其计算公式为RC3.下列膜分离过程中，基于筛分机理，主要用于分离大分子和微粒的是：A.反渗透B.纳滤C.超滤D.微滤答案：C解析：超滤的分离机理主要是筛分作用，截留分子量范围通常在1kDa至1000kDa之间，用于分离蛋白质、多糖、病毒等大分子及胶体粒子。4.在离子交换层析中，若目标蛋白质在pH7.0时带负电，应选用哪种类型的离子交换剂？A.强阴离子交换剂B.强阳离子交换剂C.弱阴离子交换剂D.弱阳离子交换剂答案：A解析：目标蛋白带负电，需用带正电的离子交换剂（阴离子交换剂）通过静电引力将其吸附。强离子交换剂在较宽pH范围内保持电荷，操作更稳定，故常优先选用强阴离子交换剂（如Q柱）。5.疏水相互作用层析（HIC）的洗脱通常采用：A.增加盐浓度B.降低盐浓度C.改变pH值D.加入竞争性抑制剂答案：B解析：HIC在高盐浓度下吸附蛋白质（盐析效应增强疏水作用），洗脱时则通过逐步降低流动相的盐浓度（即增加水的极性），减弱蛋白质与固定相之间的疏水相互作用，从而实现梯度洗脱。6.在凝胶过滤层析（分子筛层析）中，最先被洗脱出来的组分是：A.分子量最小的组分B.分子量最大的组分C.带电荷最多的组分D.疏水性最强的组分答案：B解析：凝胶过滤层析的固定相是多孔凝胶颗粒。大分子无法进入凝胶孔内部，随流动相直接流过，路径短，最先流出；小分子可进入大部分孔内，路径长，后流出。7.用于蛋白质浓度测定的Bradford法，其显色原理主要基于染料与蛋白质中哪种氨基酸残基的结合？A.芳香族氨基酸B.碱性氨基酸C.酸性氨基酸D.含硫氨基酸答案：B解析：Bradford法使用的考马斯亮蓝G-250染料，在酸性条件下其阴离子形式与蛋白质分子中的碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸、组氨酸）残基以及芳香族氨基酸残基发生静电和疏水相互作用，导致染料最大吸收峰从465nm红移至595nm，通过测定595nm吸光度定量蛋白质。8.在发酵液预处理中加入絮凝剂（如壳聚糖、聚丙烯酰胺）的主要目的是：A.杀灭微生物B.改变pH值C.增大细胞或颗粒尺寸，利于分离D.降解核酸答案：C解析：絮凝剂通过桥联、电中和等作用，使细胞、细胞碎片或胶体颗粒聚集形成更大的絮团，从而显著提高后续离心或过滤的分离效率。9.下列哪项是亲和层析独有的特性？A.根据分子大小分离B.根据电荷差异分离C.根据疏水性差异分离D.根据生物特异性相互作用分离答案：D解析：亲和层析是利用生物分子间特异的、可逆的相互作用（如抗原-抗体、酶-底物/抑制剂、受体-配体、标签蛋白与对应配体等）进行分离纯化的技术，具有高选择性、高分辨率和高收率的特点。10.工业上大规模生产抗生素时常采用哪种初步分离方法？A.离子交换B.有机溶剂萃取C.亲和层析D.凝胶过滤答案：B解析：有机溶剂萃取（如青霉素的乙酸丁酯萃取）具有处理量大、操作简便、易于连续化和放大、成本相对较低等优点，非常适合抗生素等小分子生物产物的工业规模初步分离和浓缩。二、多项选择题1.影响过滤速率的主要因素包括：A.过滤压力差B.滤液粘度C.滤饼比阻D.过滤面积E.悬浮液温度答案：A,B,C,D,E解析：根据过滤基本方程，过滤速率与过滤压力差、过滤面积成正比，与滤液粘度、滤饼比阻成反比。温度影响滤液粘度，进而影响过滤速率。因此所有选项均正确。2.在蛋白质纯化方案设计中，通常遵循的原则有：A.先采用低分辨率、高处理量的方法B.将最昂贵、最耗时的步骤放在最后C.尽早去除对产品稳定性影响大的杂质（如蛋白酶）D.不同分离原理的方法组合使用E.每一步骤都应追求最高纯度答案：A,C,D解析：合理的设计原则是：先使用粗放、快速、处理量大的方法（如沉淀、离心）缩小体积、浓缩产物；尽早去除对目标产物破坏性大的杂质（如蛋白酶、糖苷酶）；将不同分离机理的方法（如根据电荷、大小、亲和力）组合以提高总分辨率。B选项错误，昂贵耗时的步骤（如某些亲和层析）若选择性极高，可早期使用以快速提高纯度。E选项错误，每一步在保证收率的前提下适度纯化即可，最终达到目标纯度。3.可用于生物产物干燥的方法有：A.喷雾干燥B.冷冻干燥C.气流干燥D.流化床干燥E.真空干燥答案：A,B,C,D,E解析：所有选项均为常见的工业干燥方法。喷雾干燥适用于热敏性液体物料的快速干燥；冷冻干燥（升华干燥）适用于高度热敏、易氧化及需要保持生物活性的物质；气流干燥、流化床干燥适用于颗粒状物料；真空干燥适用于不耐高温、易氧化或需回收溶剂的物料。4.关于双水相萃取技术，正确的描述是：A.由两种互不相溶的水溶性聚合物或聚合物与盐组成B.两相含水量均很高，对蛋白质有稳定作用C.分离主要依据物质在两相间的分配系数差异D.特别适用于从细胞匀浆液中直接提取胞内酶E.PEG/硫酸钠体系是常见的组合之一答案：A,B,C,D,E解析：双水相系统由两种亲水性聚合物（如PEG/葡聚糖）或一种聚合物与一种盐（如PEG/硫酸钠、PEG/磷酸钾）在水中以一定浓度形成。两相均为水相，生物相容性好，能保护蛋白质活性。目标产物通过分配系数差异实现分离。其处理能力大，能直接处理含细胞碎片的匀浆液，整合了初步分离和纯化步骤。5.层析技术中，洗脱方式包括：A.等度洗脱B.梯度洗脱C.脉冲洗脱D.前沿洗脱E.置换洗脱答案：A,B,E解析：等度洗脱：恒定洗脱条件；梯度洗脱：改变洗脱强度（如盐浓度、pH、极性）；置换洗脱：使用与固定相结合力更强的置换剂。脉冲洗脱和前沿洗脱不是标准的层析洗脱模式。三、判断题1.超声波破碎法适用于所有类型细胞的破碎，且对目标产物无任何损伤。答案：错误解析：超声波破碎通过空化效应产生冲击波和剪切力破碎细胞，但会产生局部高温和自由基，可能使热敏感或对剪切力敏感的生物产物失活。对于含有包涵体的工程菌，超声波是有效方法，但对某些脆弱的动植物细胞或酶需谨慎使用。2.在结晶过程中，过饱和度是结晶的推动力，过饱和度越大，越容易获得大而均匀的晶体。答案：错误解析：适当的过饱和度是结晶的推动力。但过饱和度过高，会导致成核速率过快，形成大量细小晶体，甚至形成无定形沉淀，不利于获得大而均匀的晶体。控制过饱和度在介稳区内缓慢变化，有利于晶体生长。3.SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中，蛋白质的迁移率主要取决于其分子量大小。答案：正确解析：SDS是一种阴离子去垢剂，能使蛋白质变性并带上大量负电荷，掩盖了蛋白质自身电荷的差异。在凝胶的分子筛效应下，蛋白质的迁移速率几乎完全取决于其分子量的大小，可用于分子量测定。4.反渗透的操作压力通常低于超滤的操作压力。答案：错误解析：反渗透用于截留离子和小分子（如盐、糖），需要克服很高的渗透压，因此操作压力通常很高（1-10MPa）。超滤截留大分子，渗透压很小，操作压力相对较低（0.1-1MPa）。5.固定化金属离子亲和层析（IMAC）是利用蛋白质表面暴露的组氨酸残基与固定化的金属离子（如Ni²⁺）发生配位作用进行纯化的。答案：正确解析：IMAC是亲和层析的一种。过渡金属离子（Ni²⁺,Co²⁺,Cu²⁺,Zn²⁺）通过螯合剂固定在介质上，能与蛋白质表面暴露的电子供体原子（特别是组氨酸残基的咪唑基氮）发生配位结合。常用于纯化带有组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白。四、名词解释1.膜污染答案：在膜过滤过程中，溶液中的溶质、颗粒或微生物在膜表面吸附、沉积，或在膜孔内堵塞、吸附，导致膜通量下降和分离性能恶化的现象。可分为可逆污染（通过物理清洗恢复）和不可逆污染（需化学清洗）。2.等电点沉淀答案：利用两性电解质（如蛋白质、氨基酸）在等电点（pI）时净电荷为零，分子间静电斥力最小，溶解度达到最低的特性，通过调节溶液pH至目标产物的等电点，使其聚集沉淀析出的分离方法。3.色谱柱柱效答案：色谱柱分离效能（柱效）通常用理论塔板数（N）或理论塔板高度（HETP）来衡量。N=16(/W或N=5.544.透析答案：利用半透膜的选择透过性，使小分子溶质（如盐、缓冲液成分）从膜的一侧（样品侧）扩散到另一侧（透析液侧），而大分子目标产物被截留在膜内，从而达到脱盐、更换缓冲液或平衡样品目的的一种分离技术。其驱动力是膜两侧的浓度差。5.包含体答案：在重组蛋白（尤其是原核表达系统如大肠杆菌）的高效表达过程中，在细胞内形成的由不溶性、错误折叠的蛋白质聚集而成的无定形固体颗粒。包含体难溶于水，但可溶于变性剂（如尿素、盐酸胍），需经过提取、变性溶解、复性等步骤才能获得有活性的蛋白。五、简答题1.简述细胞破碎的主要方法，并各举一例。答案：（1）机械法：通过固体剪切力破碎细胞。例：高压匀浆法。细胞悬液在高压下通过狭小阀隙，产生高速剪切、碰撞和压力骤降（空化效应）导致细胞破碎。适用于大规模破碎细菌、酵母等。（2）物理法：利用物理能量作用使细胞破裂。例：超声波破碎法。利用超声波产生的空化作用引起冲击波和剪切力破碎细胞。常用于实验室规模的细菌、细胞悬液破碎。（3）化学法：利用化学试剂改变细胞壁或膜的通透性。例：表面活性剂（如SDS、TritonX-100）处理。能溶解细胞膜磷脂和膜蛋白，使胞内物质释放。常用于破碎动物细胞、细胞器。（4）酶解法：利用酶催化分解细胞壁特定组分。例：溶菌酶处理革兰氏阳性菌。溶菌酶水解肽聚糖中的β-1,4糖苷键，破坏细胞壁。条件温和，选择性高，但成本较高。（5）渗透压冲击法：通过突然改变渗透压使细胞胀破。例：先将细胞置于高渗溶液（如蔗糖液）中平衡，再迅速转入低渗缓冲液或水中，水大量内流导致细胞破裂。对细胞壁较脆弱的细胞（如动物细胞）有效。2.简述离子交换层析的基本操作步骤。答案：（1）介质预处理与装柱：选择合适的离子交换剂（阴离子或阳离子型，强或弱型），用起始缓冲液充分平衡后，均匀填充到层析柱中。（2）平衡：用至少5-10柱体积（CV）的起始缓冲液（低离子强度，pH恒定）流过层析柱，使介质和系统完全平衡至目标结合条件。（3）上样：将样品用起始缓冲液透析或稀释，调整至与平衡缓冲液相同的pH和低电导条件后上柱。目标蛋白与介质结合，杂质流穿或弱结合。（4）淋洗：用平衡缓冲液或略高盐浓度的缓冲液冲洗柱子，洗去未结合或弱结合的杂蛋白，直至基线平稳。（5）洗脱：可采用梯度洗脱或阶梯洗脱。通过逐步增加缓冲液的离子强度（提高盐浓度）或改变pH，降低目标蛋白与介质的静电引力，将目标蛋白按结合力强弱顺序洗脱下来。（6）再生与保存：用高盐缓冲液（如1-2MNaCl）洗去强吸附的杂质，再用起始缓冲液重新平衡。长期保存时，将介质置于含抗菌剂（如20%乙醇）的溶液中。3.比较超滤与透析在脱盐和浓缩方面的优缺点。答案：超滤：优点：速度快，处理量大，易于自动化、规模化；可同时实现浓缩和脱盐（或缓冲液交换）；样品损失相对较小；有不同截留分子量的膜可供选择，灵活性好。缺点：需要专用设备（超滤杯、切向流系统）；膜易污染，需要清洗和维护；对于某些易吸附或剪切敏感的物质可能造成损失或失活；初始设备投资较高。透析：优点：设备简单（只需透析袋和容器）；条件温和，对蛋白质活性影响小；适用于小体积样品；无剪切力问题；成本低廉。缺点：速度慢，耗时长（通常需要数小时至过夜）；不能同时有效浓缩（反而可能因渗透压而稀释）；缓冲液交换不完全；样品在透析袋内可能发生非特异性吸附；难以处理大量样品；操作繁琐。4.简述影响亲和层析纯化效果的主要因素。答案：（1）配体的选择与固定化：配体与目标分子的亲和力、特异性是关键。固定化方法应保持配体活性，并尽量减少非特异性吸附。配体密度需优化，过低则载量小，过高可能引起空间位阻或非特异性作用增强。（2）载体（基质）性质：应具有良好的亲水性、惰性（减少非特异性吸附）、多孔性（提高载量）、化学稳定性和机械强度。琼脂糖凝胶是常用载体。（3）上样条件：包括pH、离子强度、温度、上样流速和上样量。条件应最有利于目标分子与配体特异性结合，通常采用弱结合条件（如中性pH，较低离子强度）上样。（4）洗脱条件：洗脱方法需能破坏特异性相互作用而不损伤目标分子活性。方法包括：特异性洗脱（使用高浓度游离配体、竞争性底物或抑制剂）、非特异性洗脱（改变pH以改变电离状态、提高离子强度以屏蔽静电作用、使用变性剂如尿素或盐酸胍，后者可能导致失活）。（5）样品预处理：样品中过高的杂质、脂类、核酸或颗粒物可能堵塞层析柱或干扰结合，需进行适当的澄清、过滤等预处理。六、计算题1.某离心机最大转速为12,000rpm，转子平均旋转半径（从轴心到离心管中部的距离）为8cm。请计算该离心机在此条件下能产生的最大相对离心力（RCF,×g）。（保留两位小数）答案：已知：rpm公式：R计算：R====因此，最大相对离心力约为12880×2.使用Bradford法测定蛋白质浓度。以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，测得标准曲线数据如下：BSA浓度(μg/mL)01020406080吸光度(595nm)0.0020.0850.1650.3200.4800.635测得某未知蛋白样品溶液的吸光度为0.250。请计算该样品溶液的蛋白质浓度（μg/mL）。答案：（1）绘制标准曲线或拟合方程。观察数据，吸光度与浓度在测定范围内大致呈线性关系。取中间点（20,0.165）和（60,0.480）计算斜率。斜率k截距b标准曲线方程为：=0.007875（2）将未知样品吸光度=0.2500.250==≈因此，该未知蛋白样品的浓度约为30.8μg/mL。（注：使用线性回归软件可得到更精确的拟合方程和结果）七、论述题1.请论述在生物工程下游工艺（DSP）中，如何将不同的分离纯化技术进行合理组合与排序，以设计一套高效、经济的蛋白质纯化方案。请结合具体技术实例说明。答案：设计一套高效、经济的蛋白质纯化方案，需遵循“先粗后精、先大后小、先廉后贵、尽早去害”的总体策略，将不同分离原理的技术进行逻辑组合。一个典型的三步纯化方案（如从大肠杆菌发酵液中纯化重组酶）可如下设计：（1）第一步：捕获与初步纯化——目标：快速缩小体积，浓缩产物，去除大部分杂质。技术选择：离心、过滤、沉淀（如硫酸铵分级沉淀）、双水相萃取或粗分离型离子交换层析。实例与理由：发酵液经离心或微滤去除菌体，得到粗提液。随后可采用硫酸铵沉淀进行初步浓缩和纯化。此方法处理量大、成本低、速度快，能有效去除大量杂蛋白、核酸和色素，使产物富集在沉淀或上清中，体积显著减小。若产物为胞内蛋白，此步骤前需进行细胞破碎。（2）第二步：中度纯化——目标：显著提高产物纯度，去除主要杂质。技术选择：离子交换层析（IEX）、疏水相互作用层析（HIC）、亲和层析（如果存在特异性配体）。实例与理由：将第一步得到的样品透析或稀释至低盐缓冲液后，进行离子交换层析。例如，若目标酶在pH8.0时带负电，选用阴离子交换柱（如QSepharose）。通过盐梯度洗脱，可根据电荷差异有效分离与目标蛋白电荷性质不同的杂蛋