基因工程的基本操作程序+高二生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序第三章基因工程￭从社会中来请同学们尝试设计通过基因工程生产人干扰素的方案。

干扰素在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病及多种癌症，传统方法生产干扰素的产量极低。1993年，我国批准生产由侯云德院士研究和开发的药物重组人干扰素α-1b，它是我国第一个具有自主知识产权的基因工程药物，通过转基因的大肠杆菌来生产，产量得到大幅度的提高。与载体拼接大肠杆菌干扰素导入干扰素基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定请同学们尝试设计通过基因工程生产人干扰素的方案。核心12简述PCR的原理、条件及过程简述基因表达载体的组成及构建过程学习目标自主学习任务单请同学们阅读教材P76-77，思考下列问题：什么样基因才能称为目的基因？举例说明？筛选合适的目的基因的方法？明确目的基因后，该如何获得它？（限时3min）一、目的基因的筛选和获取一、目的基因的筛选和获取1目的基因的概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因。主要是编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子一、目的基因的筛选和获取2目的基因筛选：科学家已经明确Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白有深入了解利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因一、目的基因的筛选和获取3目的基因获取：①通过构建基因文库来获取目的基因（P82第5段第1、2行)②人工合成目的基因③利用PCR特异性地快速扩增目的基因前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成

蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成DNA合成仪将含有某物种不同基因的许多DNA片段，结合质粒导入到受体菌群体中储存，这个受体菌群就是该生物的基因文库基因组文库

：包括某种生物的全部基因cDNA文库

：包括某种生物的部分基因从基因文库（Genelibrary）获取基因组文库提取某种生物的全部DNA一定大小的DNA片段导入受体菌中储存用适当的限制酶酶切将DNA片段与载体连接2

类型：1

基因文库的概念：自主学习任务单请同学们阅读教材P77-79，思考下列问题：PCR的全称？PCR是一项怎样的技术（概念）？（据概念分析）PCR依据的原理？操作环境？优点？回忆体内DNA复制需要什么条件？从而分析PCR需要哪些条件？PCR的过程？（限时3min）一、目的基因的筛选和获取DNA半保留复制

体外短时间内大量扩增目的基因聚合酶链式反应PCR技术发明者：穆里斯PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（1）PCR——聚合酶链式反应的概念、原理DNA半保留复制

PCR扩增仪PCR技术要点回顾——体内DNA复制解旋酶DNA聚合酶前导链：可以沿着5’→3’合成新链后随链：不能连续合成新链模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶①边解旋边复制②半保留复制条件因为DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。子链的延伸方向：5'端→3'端复制特点:碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）复制原则:引物3’端5’端3’端5’端要点回顾——体内DNA复制相关信息

引物是一小段能与

的

一段碱基序列__________的____________。DNA母链互补配对短单链核酸（通常20-30个核苷酸）可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA复制PCRDNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（PCR用耐高温的DNA聚合酶）（PCR用高温代替）（PCR的引物2种）耐高温的DNA聚合酶DNA模板引物缓冲溶液四种脱氧核苷酸PCR扩增仪（PCR仪）微量离心管——控制温度（dNTP）（2种）一般添加Mg2+(P77相关信息)（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）PCR的条件：目的基因DNA（模板）、四种游离的脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、一定的缓冲溶液(维持反应体系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性）、控制温度变化（2）基本条件PCR技术用具推动杆调节旋钮卸枪头按钮体积刻度吸液杆枪头微量离心管PCR仪注意：加不同样品时，需要更换枪头PCR技术dNTP——脱氧核苷三磷酸dATP

腺嘌呤脱氧核苷酸dADP腺苷（A)

腺嘌呤脱氧核糖PPP~~OHH

在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。PCR技术变性复性延伸当温度超过_____以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。氢键单链DNA1.变性：变性90℃思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是固定的温度？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。3’5’3’5’3’5’DNA母链13’5’DNA母链2（3）基本过程PCR技术当温度下降

到左右时，

种引物通过

与两条单链DNA结合。碱基互补配对思考：引物结合在模板链的什么位置？引物结合在DNA模板链3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。2.复性：50℃两3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2变性复性延伸（3）基本过程PCR技术变性复性延伸（3）基本过程当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在耐高温的__________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃思考：耐高温的DNA聚合酶结合在引物的3’还是5’端？结合在引物的3’端3.延伸：3’5’3’5’3’5’3’5’（4）扩增结果：以指数形式扩增，即____（n为扩增循环的次数）2n若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为

个。若开始有N个

DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为

个。2nN∙2nPCR技术变性90℃以上延伸72℃左右复性50℃左右基本过程（5）PCR产物的鉴定：完成后，常采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳PCR技术PCR技术PCR技术片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。琼脂糖凝胶电泳法电泳：DNA分子在电场作用下发生迁移，越小的DNA片段距离出发点越远。（课本P84）（小的跑得快，大的慢）思考讨论1．PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？不相同。PCR反应时所用引物是人工加入的一小段DNA

体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA2．PCR过程中需要加入两种引物，原因是？DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，不能从头合成，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。3．引物在PCR中能重复利用吗？如果有一个亲代DNA，通过PCR循环n次，则共需消耗多少对引物？共需消耗2n－1对引物。不能3’5’5’思考讨论4.利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？扩增的是完整的模板DNA分子吗？5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’第3轮；1/4。处于两个引物之间DNA聚合酶只能特异性地对_________________________的DNA序列复制。5．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。

第1组：

；

第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效思考讨论6．两种引物的要求？（理解）①引物自身（之间）不能碱基互补配对②引物长度不宜过短，防止引物随机结合③引物是根据目的基因两端已知序列设计的思考讨论7．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。DNA复制PCR技术场所遵循原则条件解旋方式酶特点结果PCR技术vsDNA复制碱基互补配对原则碱基互补配对原则模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物(RNA)模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物(人工合成的DNA)(2种）DNA在高温下热变性解旋解旋酶催化半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制细胞内（主要在细胞核内）大量的DNA片段形成整个DNA分子耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃使模板DNA变性→55℃下复性→72℃下引物链延伸。下列有关PCR过程的叙述中正确的是()变性过程中破坏的是DNA分子内碱基的磷酸二酯键，也可利用解旋酶实现延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度低复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成

￭实战演练D(2023·山西太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是()A.目的基因就是编码蛋白质的基因B.获取目的基因是基因工程的第一步C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会

￭实战演练A

￭实战演练现有一长度为3000碱基对(bp)的线性DNA分子,用限制性内切核酸酶酶切后,进行凝胶电泳,使降解产物分开。用酶H单独酶切,结果如图1。用酶B单独酶切,结果如图2。用酶H和酶B同时酶切,结果如图3。该DNA分子的结构及其酶切图谱是()A若用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是()A.图中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道①中是用Salǀ处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNAD

￭实战演练如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是()A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4D

￭实战演练5’5’3’3’5’5’3’3’第1次5’5’5’5’3’3’3’3’第2次3’3’5’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’第3次3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’3’3’5’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’5’第4次1个3个4个1个3个4个PCR扩增技术解析研究者用PCR技术获得家族关于亨廷顿氏舞蹈症（HD，常染色体显性遗传病，成人后才发病）基因的差异。检测结果如图2所示，据此结果推测Ⅳ1__________（有/无）出现HD症状的可能，依据是__

___________________________________________________________。有Ⅳ1与患者基因型一样（杂合子），带有致病基因

￭实战演练自主学习任务单请同学们阅读教材P80，思考下列问题：获取目的基因后，能直接导入受体细胞吗？载体和基因表达载体的区别？为什么要构建基因表达载体？基因表达载体应该具备什么结构才能到达以上目的？各个结构的作用？目的基因插入什么位置？基因表达载体的构建过程?（限时3min）二、基因表达载体的构建（核心）不能，需借助载体二、基因表达载体的构建（核心）②能自我复制①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒1载体应具备条件：④对受体细胞无害限制酶切割位点标记基因复制原点2载体的种类：限制酶切割位点基因表达载体①限制酶切割位点：②启动子（基因的上游）：③终止子（基因的下游）：④标记基因（抗性基因）：⑤复制原点：二、基因表达载体的构建（核心）2

组成便于筛选RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。1

基因表达载体的功能终止转录使目的基因在受体细胞中稳定存在，复制，表达。插入目的基因（必须插入启动子和终止子之间）DNA复制所需表达载体启动子目的基因终止子复制原点标记基因基因表达载体构建模式图载体（质粒）DNA分子（含目的基因）同一种限制酶（或能产生相同黏性末端的限制酶）处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）二、基因表达载体的构建（核心）3基因表达载体的构建过程：基因表达载体₪常考：对于目的基因和运载体的剪切有什么要求？用同种限制酶切割，容易出现质粒和目的基因自身环化和反向连接。₪

解决办法？双酶切₪启动子和起始密码子有区别吗？终止子和终止密码子有区别吗？启动(终止)转录启动(终止)翻译位于DNA上位于mRNA上作用位置启动(终止)子起始(终止)密码子(1)不破坏目的基因原则(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则(3)善用“双酶切”，注意方向性(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。

限制酶的选择₪

(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli

DNA

连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用

T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用

T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用

E.coliDNA连接酶连接￭实战演练C₪

(2023·湖北，4改编)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是()A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，

不一定含有目的基因C.若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的培养基中能形成菌落D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中

能形成菌落￭实战演练D12阐明将目的基因导入受体细胞的方法阐明目的基因的检测与鉴定的方法学习目标目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第一步第二步第三步第四步目的基因的检测与鉴定将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，分别适用于什么生物？核心在获得转基因产品的过程中，受体细胞有植物、动物、微生物之分，受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不完全相同。要点回顾在培育出的抗虫棉植株中，构成植株所有的细胞都含有Bt基因吗？若想让抗虫特性稳定遗传，Bt基因应导入至棉花细胞的什么部位？如何将重组好的质粒导入受体细胞？对于动植物而言，受体细胞应是体细胞？生殖细胞？还是受精卵？请同学们阅读教材P81文字及图片，思考下列问题：自主学习任务单（限时3min）三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1类型：动物细胞植物细胞微生物细胞花粉管通道法农杆菌转化法基因枪法显微注射法Ca2+处理法（感受态细胞法）依据——根据受体细胞的不同（常用）（我国科学家独创）（单子叶植物常用）体细胞或受精卵受精卵受精卵三、将目的基因导入受体细胞感受态细胞Ca2+处理细胞重组基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收重组DNA分子42℃,1min冰上3min

常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。过程：导入微生物细胞——Ca2+处理法

注意：

原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，

需要在体外进行再加工。在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；1.花粉管通道法（我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法）导入植物细胞操作方式：三、将目的基因导入受体细胞含目的基因的DNA溶液能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种

植物也取得了成功。农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的_______可转移至被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的

。（2）转化原理：（1）农杆菌的特点：T-DNATi质粒大型环状DNA农杆菌T-DNA染色体DNA上单子叶Ti质粒2.农杆菌转化法导入植物细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受

体细胞内维持稳定和表达的过程。三、将目的基因导入受体细胞转化的实质:基因重组（可转移的DNA）(3)过程：植物组织培养第一次导入第二次导入第一次拼接第二次拼接将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA导入受体细胞。将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。2.农杆菌转化法三、将目的基因导入受体细胞目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物导入动物细胞——显微注射法①个体大，易操作。②受精卵全能性高，易培养成完整个体。三、将目的基因导入受体细胞技术？核心归纳受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。

基因表达载体中已经具备标记基因（如抗生素抗性基因），对受体细胞进行了筛选，为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？在含抗生素的选择培养基上能生长的是导入了载体的细胞，这里的载体可能是基因表达载体，也可能是未插入目的基因的空载体。因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。

检测是否插入目的基因

检测目的基因是否转录

检测目的基因是否翻译四、目的基因的检测与鉴定

检测个体是否表达性状①检测目的基因是否导入如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因——通过PCR等技术检测转基因生物提取DNAPCR操作是否扩增出目的基因M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；

PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果电泳操作1.分子水平的检测四、目的基因的检测与鉴定电泳技术在目的基因的检测和鉴定中的应用思路将受体细胞的所有DNA分子提取出来进行电泳实验，与marker对比判断是否含目的基因。非转基因棉花转基因抗虫棉阴性对照①检测目的基因是否导入——通过PCR等技术检测1.分子水平的检测四、目的基因的检测与鉴定②检测目的基因是否转录如：检测Bt基因是否翻译出mRNA——通过PCR等技术检测1.分子水平的检测四、目的基因的检测与鉴定转基因生物PCR操作是否扩增出目的基因逆转录cDNA提取RNAmRNA作为模板用PCR可以扩增mRNA吗？BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录③检测目的基因是否翻译如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白——通过抗原—抗体杂交技术检测1.分子水平的检测四、目的基因的检测与鉴定苏云金杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取抗原抗体杂交Bt抗虫蛋白拓展拓展

基因探针是一段带有检测标记（荧光或放射性同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。检测

将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因——基因探针(1)原理：碱基互补配对原则。(2)基因探针：用放射性同位素或荧光物质标记的目的基因。(3)检测受体细胞是否含目的基因的具体过程：拓展——基因探针转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常抗性鉴定、活性鉴定等2.个体水平的鉴定：四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定是否出现杂交带现象现象PCR与核酸分子杂交技术检测用限制酶切割载体和含有目