蛹虫草不同菌株生物学特性及栽培试验

蛹虫草不同菌株生物学特性及栽培试验

蠕虫虱子。

1材料和方法

1.1材料表面

1.1.1试验中的蘑菇

L1.2培养基

(1)PDA加富培养基:马玲薯200g,葡萄糖20g,蛋白陈3g,KH

1.2方法

1.2.1种子平板的制备

将野生虫草子座用清水洗去表面浮土，置于75%乙醇中表面消毒2min,在无菌水中反复冲

洗，放在无菌培养皿内备用。用无菌解剖刀将消毒后的虫草子座切成长度约1cm的小段，

接种于PDA培养基的平板上。将接种后的平板放置在22〜25℃的培养室中培养。平板略微

倾斜放置。48~72h后菌丝萌发，选择无污染的菌丝，转接到新的PDA平板上进一步分离，

最终得到纯化的虫草菌株。

1.2.2社会学观察

L2.3培养基培养处理工艺

将5个供试菌种分别接种于PDA培养基斜面上，22~25c培养7~10d,待菌丝长满斜面。将

活化后的斜面母种接入含有50mL液体培养基的三角瓶中，22~25℃震荡培养3〜4d,菌丝

长满液体表面。静置24h确保无杂菌后，转入500mL营养液中。将30g小麦和50田)自

来水装入镰头瓶后用耐高温塑料膜扎紧，100℃常压灭菌8h,过夜冷却。取5mL液体菌种,

以无菌操作接入瓶内小麦培养基上，18℃黑暗条件下培养7d。此阶段主要注意避光和低温。

待菌丝长满培养基后，22c光照转色。转色7d后在塑料膜上打孔

1.2.4对分子的鉴定和系统发育的研究

1.2.4.不同温度下ctab缓冲液的稳定性测定

采用CTAB法取适量子实体样品置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状。将样品粉末转移到

含4mLCTAB缓冲液的灭菌离心管中，65c下温育40min,每隔lOmin颠倒几次，使样品

混匀。在通风橱内，加入4nlL氯仿：异戊醇（24：1）,轻微震荡混合20min。4℃离心

10000r•min

1.2.4.per反应u2004

50uLPCR扩增反应体系为:模板DNA1uL、10XPCRbuffer5uL>TaqDNA聚合酣

0.8uL>dNTP（2.5mM）4uL、ITS4、ITS5（20uM）引物各luL,用去离子水补至

50uLo反应程序为:95℃预变性5min后，进入循环，94℃变性1min.50℃退火1min、

72℃延伸1min,共40个循环，于72℃延伸10min。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶，1XTAE为电泳缓冲液，5V•cm

1.2.4.系统发育树的构建

将所扩增出的5个供试菌株的ITS序列提交到GenBan.<核酸序列数据库，与Genbank中

已经登录的序列进行Blastn比对，下载Score分值高的9株最相似菌株的ITS序列与供

试菌株的序列进行系统发育树的构建.用ClustalX软件处理分析5个供试菌株的ITS序

列，再用DNASTAR软件构建系统进化树，根据系统发育树探讨其亲缘关系。

2结果与分析

2.1不同菌株的气生引导基

山图1可见，菌丝长满整个平板时，白化变异型菌株KB29的菌落颜色为纯白色，回复突

变菌株KH29菌株为淡黄色;而其余3个菌株均为橘黄色。白化变异型菌株KB29和其回复

突变菌株KH29的气生菌丝较为发达，基内菌丝相对较弱（表1）。5个供试菌株在固体培

养基中的生长速度由快至慢依次为KB29、K17、KH29、K19和A2菌株，其中A2菌株需要

约24d才能长满整个平板。

2.2各菌株的生长特性

由表2可见，K17菌株子实体长，粗细均匀，颜色橘黄，子囊壳丰富，出草整齐，每瓶干

重达到4.67g,经济性状要明显优于其他4个供试菌株。其余依次为A2、K19、KH29和

KB29菌株;A2菌株的干重虽然也达到4.66g,但子实体不光滑且扭曲，严重影响其外观性

状；臼化变异型菌株KB29的菌种活力有所退化，栽培产量较少，且子实体形态变异严重；

回复突变菌株KH29子实体子囊头大，有毛刺，但子实体部分较细，不整齐，出草有橘黄

色，也有少量白色;K19菌株颜色橘黄，子囊头也较大，出草整齐但子实体较细（图2）。

2.3整株菌株的现实测序结果

由图3可见，5个供试菌株的ITS扩增片段清晰，大小在500~750bp之间，且扩增结果稳

定，重复性好，可以进行系统发育学研究。

ITS序列测定结果表明（表3）,5个菌株的ITS序列长度为545~566bp,GC含量为

56.11%~57.06%。将所扩增出的5个供试菌株的ITS序列与Genbank中已经登录的序列进

行Blastn比对，结果显示5株菌的ITS序列都为蛹虫草序列，同源性高达99%。该结果也

说明，不同的蛹虫草菌株间的ITS序列是相对保守的。

2.4供试菌株的遗传稳定性

根据BLAST检索结果，卜.我Score分值高的9株最相似菌株的ITS序列与供试菌株的序列

进行系统发育树的构建，由图4可见，14株菌聚成两个大簇，而供试的5个菌株均与蛹虫

草聚在一起，支持了前面根据Blasln结果和ClustalX分析的初步鉴定结果。5个供试菌

株的分类地位同属蛹虫草，它们的ITS序列的差异很小，属于种内差异。

野生菌株A2、K19和K17与GU390585等3株蛹虫草的遗传距离要小于白化变异型菌株

KB29和回复突变菌株KH29,这说明蛹虫草菌株产生白化变异后，菌株内的遗传物质发生

变化。白化变异型菌株KB29与其他菌株的遗传距离相对较远，但与其回复突变菌株KH29

遗传距离相对较小"这是否与其失去合成橘黄色色素的相关基因有关，还有待进•步研究。

菌落、菌丝形态和产子实体能力相近并且都具备橘黄色或黄色色素的A2、K19和K17菌株,

遗传距离也相对较小。遗传距离最为小的为A2和K17菌株。

3系统发育学研究

供试的5个虫草菌株，其中包括3个野生菌株A2、K17和K19,一个白化变异型菌株KB29

和一个回复突变菌株KH29,它们在生物学特性上有一定差异。在栽培试验中，K17菌株的

子实体性状最好，每瓶干重可达4.67g,是供试的5个菌株中最适宜人工栽培和开发的菌

种。通过ITS序列测定和比对，5个菌株同属蛹虫草，且HS序列遗传物质差异较小，属

于种内差异。但不同菌株之间ITS序列的差异也有一定规律可循。通过系统发育树可以看

出，ITS序列中遗传物质的差异和菌落、菌丝和子实体形态之间有正相关性，这符合了基

因型决定表现型的遗传规律。在蛹虫草人工栽培生产中存在的主要问题就是菌种退化现象

严重。菌种的退化问题在菌类栽培中普遍存在，而关于蛹虫草菌种退化有关的生理生化和

遗传机制至今尚无明确的结论。由于HS序列相对保守，适用于属内种间或种内群体的系

统学研究。由于本研究收集到的5个菌株亲缘关系很近，在后续试验中应考虑采取其他分

子生物学方法进行研究。在5个供试菌株中，白化变异型菌株KB29的菌丝体和子实体均

为纯臼色，如果性状能稳定遗传，有望在化妆品和保健品领域发挥巨大潜力。

野生虫草菌株K17、K19和A2采自沈阳棋盘山，KB29为野