非洲猪瘟防控新径：猪源单链抗体噬菌体文库构建与抗体筛选

非洲猪瘟防控新径：猪源单链抗体噬菌体文库构建与抗体筛选一、引言1.1研究背景与意义非洲猪瘟（AfricanSwineFever，ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus，ASFV）引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。自1921年在肯尼亚首次发现以来，非洲猪瘟已在多个国家和地区流行。2018年8月，非洲猪瘟传入我国，迅速在全国范围内扩散，给我国养猪业带来了沉重打击。据农业农村部统计，截至[具体时间]，我国共发生[X]起非洲猪瘟疫情，扑杀生猪[X]万头，直接经济损失超过[X]亿元。非洲猪瘟病毒的传播途径广泛，包括直接接触感染猪、间接接触被污染的饲料、水源、设备等，以及通过软蜱等媒介生物传播。该病毒具有较强的抵抗力，在环境中可存活较长时间，给疫情防控带来了极大的困难。目前，非洲猪瘟尚无有效的疫苗和治疗方法，主要依靠严格的生物安全措施来防控疫情的传播。然而，这些措施在实际执行中面临诸多挑战，如养殖场生物安全水平参差不齐、疫情监测和预警体系不完善等，导致疫情难以得到有效控制。准确、快速的检测方法对于非洲猪瘟的防控至关重要。目前，常用的检测方法包括聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。这些方法虽然具有较高的准确性，但也存在一些局限性，如需要专业的设备和技术人员、检测时间较长等，难以满足现场快速检测的需求。因此，开发一种快速、灵敏、特异性强的检测方法具有重要的现实意义。单链抗体（Single-chainFragmentVariable，scFv）是一种由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段柔性连接肽（Linker）连接而成的基因工程抗体，具有分子量小、穿透性强、免疫原性低、易于制备和改造等优点。单链抗体在疾病诊断、治疗和生物传感器等领域具有广泛的应用前景。在非洲猪瘟检测方面，单链抗体可用于开发快速检测试剂盒、免疫传感器等，实现对非洲猪瘟病毒的快速、准确检测。此外，单链抗体还可作为研究工具，用于深入探究非洲猪瘟病毒的感染机制、致病机理等，为非洲猪瘟的防控提供理论支持。本研究旨在构建抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库，并从中筛选出特异性强、亲和力高的单链抗体，为非洲猪瘟的检测和防控提供新的技术手段和理论依据。具体而言，通过提取非洲猪瘟病毒免疫猪的外周血淋巴细胞总RNA，反转录合成cDNA，利用PCR技术扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因，连接形成单链抗体基因，将其插入噬菌体载体中，构建噬菌体文库。然后，通过生物淘选技术从文库中筛选出与非洲猪瘟病毒抗原特异性结合的单链抗体，并对其进行鉴定和分析。本研究的成果有望为非洲猪瘟的早期诊断、疫情监测和防控提供有效的技术支持，具有重要的理论意义和实际应用价值。1.2国内外研究现状非洲猪瘟病毒的研究一直是全球关注的焦点，国内外众多科研团队围绕其开展了大量工作，在抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库构建及抗体筛选方面取得了一定成果。在国外，相关研究起步较早，技术和理论基础相对雄厚。科研人员致力于从不同角度深入探究非洲猪瘟病毒的特性，为抗体制备提供了坚实的理论支撑。部分研究团队成功构建了抗非洲猪瘟病毒的单链抗体噬菌体文库，并从中筛选出具有较高亲和力和特异性的单链抗体。这些抗体在病毒检测、致病机制研究等方面展现出巨大潜力，为非洲猪瘟的防控提供了新的思路和方法。例如，有研究利用噬菌体展示技术，从免疫动物的基因库中筛选出针对非洲猪瘟病毒特定抗原表位的单链抗体，通过对这些抗体的深入分析，进一步揭示了病毒与宿主细胞相互作用的分子机制。此外，国外还在不断优化单链抗体的制备工艺和筛选方法，提高抗体的质量和筛选效率，以满足实际应用的需求。国内对非洲猪瘟的研究虽然起步较晚，但在非洲猪瘟传入后，国内科研人员迅速投入到相关研究中，取得了一系列显著成果。众多科研团队积极开展抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库的构建工作，在借鉴国外先进技术的基础上，结合国内实际情况进行创新和优化。通过大量实验，成功构建了具有较高质量和多样性的噬菌体文库，并从中筛选出多种能够特异性识别非洲猪瘟病毒的单链抗体。这些抗体在实验室检测中表现出良好的性能，有望进一步开发成为快速、准确的检测试剂，用于非洲猪瘟的早期诊断和疫情监测。同时，国内研究人员还深入研究了单链抗体的作用机制，为其在非洲猪瘟防控中的应用提供了更深入的理论依据。例如，有研究通过对筛选出的单链抗体进行结构和功能分析，发现其能够通过与病毒表面的关键蛋白结合，阻断病毒的感染过程，为开发新型抗病毒药物提供了潜在的靶点。尽管国内外在抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库构建及抗体筛选方面取得了一定进展，但仍存在一些问题和挑战。一方面，目前筛选出的单链抗体在亲和力、特异性和稳定性等方面还有待进一步提高，以满足临床检测和治疗的严格要求；另一方面，噬菌体文库的构建成本较高，筛选过程较为复杂，需要耗费大量的时间和资源，限制了相关技术的广泛应用。因此，未来需要进一步加强相关研究，不断改进技术方法，提高单链抗体的性能和制备效率，降低成本，推动抗非洲猪瘟病毒单链抗体的实际应用。1.3研究目标与内容本研究旨在构建抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库，并从中筛选出特异性强、亲和力高的单链抗体，为非洲猪瘟的检测和防控提供新的技术手段和理论依据。具体研究内容如下：构建抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库：从非洲猪瘟病毒免疫猪的外周血中分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录合成cDNA。设计特异性引物，通过PCR技术扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，利用重叠延伸PCR（Overlap-PCR）将VH和VL基因通过柔性连接肽（Linker）连接，形成单链抗体基因（scFv）。将scFv基因插入噬菌体载体，转化大肠杆菌，构建噬菌体文库。对文库的库容量、重组率和多样性进行鉴定，确保文库质量。筛选抗非洲猪瘟病毒单链抗体：以非洲猪瘟病毒抗原为靶标，对构建的噬菌体文库进行生物淘选。经过多轮淘选，富集与抗原特异性结合的噬菌体单链抗体。从淘选后的文库中随机挑取单克隆，进行噬菌体ELISA鉴定，筛选出阳性克隆。对阳性克隆进行测序，分析其氨基酸序列和基因特征，确定不同的单链抗体克隆。单链抗体的表达与鉴定：将筛选得到的单链抗体基因克隆到表达载体，转化大肠杆菌进行诱导表达。优化表达条件，提高单链抗体的表达量和可溶性。采用亲和层析等方法对表达的单链抗体进行纯化，获得高纯度的单链抗体蛋白。通过ELISA、Westernblot、间接免疫荧光等实验，鉴定单链抗体与非洲猪瘟病毒抗原的结合活性和特异性。测定单链抗体的亲和力常数，评估其亲和力高低。单链抗体的应用研究：利用筛选得到的单链抗体，建立非洲猪瘟病毒的快速检测方法，如免疫层析试纸条、免疫传感器等，并对其检测性能进行评估。探索单链抗体在非洲猪瘟病毒致病机制研究中的应用，为深入了解病毒感染和致病过程提供工具。二、非洲猪瘟病毒及单链抗体相关理论2.1非洲猪瘟病毒概述非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus，ASFV）是非洲猪瘟的病原体，其在病毒学分类中属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是一种具有复杂结构和独特生物学特性的双链DNA病毒，对全球养猪业的发展构成了严重威胁。ASFV粒子呈二十面体对称结构，直径约为175-215nm，是目前已知的最大的动物病毒之一。病毒粒子从外到内依次由外膜、衣壳、内膜、核壳和核心组成。外膜来源于宿主细胞膜，在病毒的感染和传播过程中起到保护病毒和介导病毒与宿主细胞识别的作用。衣壳由多种蛋白组成，其中主要衣壳蛋白p72含量最高，它以三聚体形式存在于衣壳外层，形成了衣壳的基本结构单位壳粒。衣壳内部还有三种次要衣壳蛋白P1、P2和P3，它们相互作用形成复杂网络，像“胶水”一样连接相邻壳粒，稳定衣壳整体结构。内膜位于衣壳内侧，与核壳紧密相连，在病毒的组装和成熟过程中发挥重要作用。核壳包裹着病毒的核心，核心包含病毒的基因组DNA以及与DNA结合的蛋白质，这些蛋白质对病毒基因组的复制、转录和包装具有重要意义。ASFV的基因组为线性双链DNA，大小约为170-190kb，末端具有反向重复序列。基因组中包含150-200个开放阅读框（ORF），编码多种结构蛋白和非结构蛋白。这些蛋白在病毒的生命周期中发挥着不同的功能，例如参与病毒的吸附、侵入、复制、转录、翻译、组装和释放等过程。其中，一些蛋白与病毒的致病性和免疫原性密切相关，如p72蛋白、E183L蛋白、B602L蛋白等。p72蛋白作为主要衣壳蛋白，不仅在维持病毒结构稳定方面发挥作用，还具有良好的免疫原性，是目前非洲猪瘟诊断和疫苗研究的重要靶标。E183L蛋白参与病毒的DNA复制过程，B602L蛋白则在病毒的转录调控中发挥关键作用。非洲猪瘟的传播途径主要包括直接接触传播和间接接触传播。直接接触传播是指健康猪与感染猪或带毒猪直接接触，通过鼻-鼻接触、口-口接触等方式感染病毒。间接接触传播则是指健康猪接触被病毒污染的饲料、水源、设备、车辆、人员等而感染病毒。此外，软蜱等媒介生物也可以传播非洲猪瘟病毒，软蜱叮咬感染猪后，病毒在其体内增殖，当软蜱再次叮咬健康猪时，就会将病毒传播给健康猪。非洲猪瘟的临床症状多样，根据病程和严重程度可分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。最急性型病例通常无明显症状，突然死亡。急性型病例主要表现为高热（体温可达40-42℃）、精神沉郁、厌食、皮肤发绀、出血倾向等症状，死亡率可达100%。亚急性型病例症状相对较轻，病程较长，可出现间歇性发热、关节肿胀、皮肤溃疡等症状，死亡率一般在30%-70%。慢性型病例症状不明显，主要表现为生长缓慢、消瘦、贫血等症状，死亡率较低，但容易成为病毒的携带者，持续向外界排毒，对养猪业的危害极大。非洲猪瘟的病理变化主要表现为全身性出血、坏死和炎症。在最急性型和急性型病例中，可见脾脏显著肿大、质地柔软、呈暗红色或黑色，边缘有梗死灶。淋巴结肿大、出血，呈暗红色或黑色。肾脏表面有出血点，肾盂黏膜出血。胃和小肠黏膜出血、溃疡。肺脏淤血、水肿。心脏表面有出血点。在亚急性型和慢性型病例中，除上述病变外，还可见关节肿胀、化脓，皮肤溃疡、结痂等病变。非洲猪瘟的诊断主要依靠实验室检测，常用的检测方法包括病毒分离鉴定、核酸检测、抗体检测等。病毒分离鉴定是诊断非洲猪瘟的“金标准”，通过将病料接种到猪肺泡巨噬细胞或其他敏感细胞系中，观察细胞病变效应（CPE），并结合免疫荧光、免疫组化等方法进行鉴定。核酸检测是目前应用最广泛的检测方法，包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）等，这些方法具有快速、灵敏、特异性强等优点，可用于早期诊断和疫情监测。抗体检测主要用于检测猪血清中的非洲猪瘟病毒抗体，常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹试验（Westernblot）等，抗体检测可用于评估猪群的感染状态和免疫效果。目前，非洲猪瘟尚无有效的疫苗和治疗方法，主要依靠严格的生物安全措施来防控疫情的传播。生物安全措施包括加强养殖场的管理，严格控制人员、车辆和物资的进出，定期对养殖场进行消毒，实施“自繁自养”“全进全出”的养殖模式，加强猪群的健康监测等。此外，还应加强对非洲猪瘟的宣传教育，提高养殖户的防控意识，一旦发现疫情，应及时报告并采取扑杀、无害化处理等措施，防止疫情的扩散。2.2单链抗体的结构与功能单链抗体（Single-chainFragmentVariable，scFv）是一种经过基因工程改造的抗体形式，由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段柔性连接肽（Linker）连接而成。这种独特的结构赋予了单链抗体诸多优势，使其在生物医学领域展现出广阔的应用前景。单链抗体的结构中，VH和VL分别来源于天然抗体的重链和轻链可变区，它们包含了抗体识别和结合抗原的关键区域——互补决定区（ComplementaryDeterminingRegions，CDRs）。CDRs是抗体可变区中氨基酸序列高度可变的区域，能够与抗原表面的特定表位精确结合，决定了抗体的特异性。在单链抗体中，VH和VL通过Linker连接在一起，Linker通常由15-25个氨基酸组成，富含甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）等柔性氨基酸。这种柔性的Linker使得VH和VL能够在空间上自由折叠，形成与天然抗体Fab段相似的抗原结合位点，从而保持对目标抗原的特异性结合能力。单链抗体的抗原结合原理与天然抗体类似，主要通过CDRs与抗原表位之间的非共价相互作用实现。这些非共价相互作用包括氢键、范德华力、静电作用和疏水作用等，它们共同作用使得单链抗体能够特异性地识别并紧密结合抗原。当单链抗体与抗原结合时，CDRs的氨基酸残基会与抗原表位的氨基酸残基或其他化学基团相互匹配，形成互补的空间结构，从而实现高亲和力的结合。与传统的完整抗体相比，单链抗体具有许多显著的优势。首先，单链抗体分子量小，一般约为25kDa，仅为完整抗体的1/6-1/8。较小的分子量使其具有更强的穿透性，能够更容易地穿透组织屏障，进入到传统抗体难以到达的部位，如肿瘤组织内部、细胞间隙等。这一特性使得单链抗体在肿瘤诊断和治疗中具有独特的优势，可用于开发肿瘤靶向药物，提高药物对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。其次，单链抗体免疫原性低。由于其结构相对简单，去除了Fc段等免疫原性较高的部分，减少了在体内引起免疫反应的风险，尤其适用于临床治疗和诊断应用。此外，单链抗体易于制备和改造。通过基因工程技术，可以方便地对单链抗体的基因进行操作，如定点突变、融合表达等，以优化其性能，满足不同的应用需求。同时，单链抗体可以在原核表达系统（如大肠杆菌）中高效表达，生产成本低，制备周期短，有利于大规模生产和应用。单链抗体在疾病诊断、治疗和科研等领域具有广泛的应用。在疾病诊断方面，单链抗体可用于开发各种快速检测方法，如免疫层析试纸条、免疫传感器、ELISA等。利用单链抗体对目标抗原的高特异性结合能力，能够实现对疾病相关标志物的快速、灵敏检测，为疾病的早期诊断提供有力支持。例如，在传染病诊断中，单链抗体可用于检测病原体的特异性抗原，实现对病毒、细菌等病原体的快速检测和鉴定。在肿瘤诊断中，单链抗体可用于检测肿瘤标志物，辅助肿瘤的早期诊断和病情监测。在疾病治疗方面，单链抗体可作为治疗性抗体用于肿瘤治疗、自身免疫性疾病治疗等。通过与肿瘤细胞表面的特异性抗原结合，单链抗体可以介导肿瘤细胞的杀伤作用，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒性作用（CDC）等。此外，单链抗体还可以与毒素、放射性核素等结合，构建免疫毒素或放射性免疫偶联物，实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。在自身免疫性疾病治疗中，单链抗体可通过阻断免疫细胞表面的关键分子，调节免疫反应，缓解疾病症状。在科研领域，单链抗体是研究蛋白质-蛋白质相互作用、细胞信号传导等生物学过程的重要工具。通过将单链抗体与荧光蛋白、酶等标记物融合，可以实现对目标蛋白的定位、定量分析，深入研究蛋白质的功能和作用机制。此外，单链抗体还可用于制备抗体芯片，实现对多种蛋白质的高通量检测和分析。2.3噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术是一种将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。这一技术巧妙地将基因型与表型联系起来，为蛋白质研究和应用开辟了新的道路。该技术的基本原理基于噬菌体的生物学特性和基因表达调控机制。噬菌体是一类感染细菌的病毒，具有简单的结构和快速的繁殖能力。在噬菌体展示技术中，通常选用丝状噬菌体，如M13噬菌体作为载体。M13噬菌体的基因组为单链环状DNA，编码多种蛋白质，其中与展示技术密切相关的是外壳蛋白，如次要外壳蛋白PⅢ和主要外壳蛋白PⅧ。将编码外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白基因中，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，外源基因会随着外壳蛋白基因的转录和翻译而表达。表达产生的融合蛋白会参与噬菌体的组装过程，使得外源蛋白或多肽展示在噬菌体的表面。由于噬菌体表面展示的外源蛋白或多肽保持了相对独立的空间结构和生物活性，因此能够与靶分子进行特异性识别和结合。通过将噬菌体展示文库与固相化的靶分子（如抗原、抗体、受体等）进行孵育，未结合的噬菌体可以被洗去，而与靶分子特异性结合的噬菌体则会被保留下来。然后，通过洗脱将结合的噬菌体从靶分子上释放出来，感染宿主细菌进行扩增。经过多轮“吸附-洗脱-扩增”的循环过程，与靶分子特异性结合的噬菌体得到高度富集，从而可以筛选出具有特定功能的蛋白质或多肽。噬菌体展示系统主要分为单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等。单链丝状噬菌体展示系统是应用最为广泛的展示系统之一，其中PⅢ展示系统和PⅧ展示系统较为常见。PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，每个病毒颗粒有3-5个拷贝。PⅢ在结构上可分为N1、N2和CT3个功能区域，N1和N2与噬菌体吸附大肠杆菌菌毛及穿透细胞膜有关，CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分。当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽（SgⅢ）和N1之间时，噬菌体仍有感染性；若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，此时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白容易被蛋白水解酶水解，在有辅助噬菌体超感染时，可使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即“单价”噬菌体，这种特性有利于筛选高亲和力的配体。PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，每个病毒颗粒有2700个左右拷贝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，否则会影响噬菌体装配使其失去感染力。不过，有辅助噬菌体参与时，可提供野生型PⅧ蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。由于PⅧ拷贝数多，适合筛选低亲和力的配体。λ噬菌体展示系统中，PV展示系统和D蛋白展示系统具有代表性。PV蛋白构成了λ噬菌体尾部管状部分，该管状结构由32个盘状结构组成，每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或替换。用PV系统已成功展示了有活性的大分子蛋白，如β-半乳糖苷酶（5ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。λ噬菌体的装配在细胞内进行，可展示难以分泌的肽或蛋白质。D蛋白参与野生型λ噬菌体头部的装配，分子质量为11ku。低温电镜分析表明，D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，展示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外，体外组装是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面，体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠杆菌菌种中，通过热诱导而组装。该系统的优点是噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，对于展示那些可能对噬菌体装配造成损害的蛋白质特别有用。T4噬菌体展示系统能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表面。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制。此外，SOC与HOC蛋白的存在与否，并不影响T4的生存和繁殖，这使得T4噬菌体展示系统在展示多种外源蛋白方面具有独特的优势。不同的噬菌体展示系统具有各自的特点和适用范围。单链丝状噬菌体展示系统操作相对简便，文库容量大，适用于大规模筛选；λ噬菌体展示系统可展示大分子蛋白和对宿主细胞有毒性的蛋白质；T4噬菌体展示系统能同时展示两种不同的外源蛋白，且对展示蛋白的大小限制较小。在实际应用中，可根据研究目的和需求选择合适的噬菌体展示系统。三、猪源单链抗体噬菌体文库的构建3.1实验材料准备质粒与菌株：选用噬菌粒载体pCANTAB5E，其具有氨苄青霉素抗性基因，能在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，且包含噬菌体外壳蛋白基因，利于单链抗体的展示。宿主菌株为大肠杆菌TG1，其具有较高的转化效率，能有效摄取重组噬菌粒，用于噬菌体文库的构建和扩增。辅助噬菌体选用M13K07，可提供噬菌体组装所需的蛋白，帮助重组噬菌粒包装成完整的噬菌体颗粒。引物：根据GenBank中猪免疫球蛋白基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，用于扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。VH引物上游序列为5'-[具体碱基序列]-3'，下游序列为5'-[具体碱基序列]-3'；VL引物上游序列为5'-[具体碱基序列]-3'，下游序列为5'-[具体碱基序列]-3'。此外，还设计了用于重叠延伸PCR（Overlap-PCR）连接VH和VL基因的Linker引物，其序列为5'-[具体碱基序列]-3'。所有引物均由[引物合成公司名称]合成，纯度高，能保证PCR扩增的特异性和准确性。常用试剂：RNA提取试剂选用Trizol试剂，其能有效裂解细胞，使RNA释放出来，并通过有机溶剂抽提去除蛋白质、DNA等杂质，获得高纯度的总RNA。反转录试剂盒采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，该试剂盒含有高效的反转录酶和基因组DNA去除酶，可将总RNA反转录成cDNA，同时有效去除基因组DNA的污染。PCR扩增试剂为TaKaRaExTaqDNA聚合酶、dNTP混合物等，TaKaRaExTaqDNA聚合酶具有高保真度和扩增效率，能准确扩增目的基因；dNTP混合物包含四种脱氧核苷酸，为PCR反应提供原料。限制性内切酶选用SfiI和NotI，用于酶切噬菌粒载体pCANTAB5E和PCR扩增产物，使其产生互补的粘性末端，便于后续的连接反应。T4DNA连接酶用于将酶切后的载体和目的基因片段连接起来，形成重组噬菌粒。DNA纯化回收试剂盒采用QiagenQIAquickGelExtractionKit，能高效回收PCR产物、酶切片段等DNA样品，去除杂质和引物，提高DNA的纯度和浓度。实验溶液配制：LB培养基用于培养大肠杆菌，其配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，用NaOH调节pH至7.0-7.2，高压灭菌后备用。氨苄青霉素溶液：将氨苄青霉素粉末用无菌水溶解，配制成100mg/mL的储存液，过滤除菌后，-20℃保存，使用时按1:1000的比例加入到LB培养基中，使终浓度为100μg/mL。四环素溶液：将四环素用无水乙醇溶解，配制成10mg/mL的储存液，-20℃保存，用于辅助噬菌体感染时的培养，使用时按1:1000的比例加入到LB培养基中，使终浓度为10μg/mL。PEG/NaCl溶液：用于噬菌体的浓缩和纯化，配方为：聚乙二醇（PEG8000）200g/L、氯化钠2.5mol/L，溶解后高压灭菌，4℃保存。仪器设备：高速冷冻离心机用于细胞和噬菌体的离心分离，可在低温条件下快速离心，保持生物样品的活性，其最高转速可达15000rpm。PCR仪用于目的基因的扩增，能精确控制反应温度和时间，保证PCR反应的顺利进行。凝胶成像系统用于观察和分析PCR产物、酶切产物等DNA样品在琼脂糖凝胶中的电泳结果，可拍摄凝胶图像并进行灰度分析。恒温摇床用于大肠杆菌和噬菌体的培养，可提供恒定的温度和振荡条件，促进细菌和噬菌体的生长和繁殖。超净工作台用于无菌操作，为实验提供洁净的环境，防止微生物污染。电泳仪和电泳槽用于DNA样品的电泳分离，可根据DNA片段的大小将其分离出来。核酸浓度测定仪用于测定DNA和RNA的浓度和纯度，通过检测260nm和280nm处的吸光度，计算核酸的浓度和纯度。3.2实验方法与步骤猪外周血淋巴细胞分离：从经非洲猪瘟病毒免疫的健康猪颈静脉采集抗凝血，置于含有肝素钠抗凝剂的无菌采血管中，抗凝剂终浓度为20U/mL。采用Ficoll密度梯度离心法分离淋巴细胞，具体操作如下：将抗凝血与等体积的淋巴细胞分离液（密度为1.077g/mL）小心加入到15mL离心管中，注意保持两者界面清晰，避免混合。然后将离心管放入水平转子离心机中，在20-25℃条件下，以1500r/min离心30min。离心后，管内液体分为四层，从上到下依次为血浆层、淋巴细胞层、分离液层和红细胞层。用移液器小心吸取位于血浆层和分离液层之间的乳白色淋巴细胞层，转移至新的15mL离心管中。向含有淋巴细胞的离心管中加入5倍体积的PBS缓冲液，轻轻混匀，以2000r/min离心10min，弃去上清液。重复洗涤步骤2-3次，以去除残留的血浆和分离液，获得纯净的猪外周血淋巴细胞。最后，用适量的RPMI1640培养基重悬淋巴细胞，调整细胞浓度至1×10^7个/mL，用于后续实验。淋巴细胞总RNA提取：取上述制备的猪外周血淋巴细胞1×10^7个，按照Trizol试剂说明书进行总RNA提取。具体步骤如下：将淋巴细胞加入到含有1mLTrizol试剂的无RNA酶离心管中，充分混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。然后在4℃条件下，以12000r/min离心15min。离心后，溶液分为三层，上层为无色水相，中层为白色蛋白层，下层为红色有机相。小心吸取上层水相至新的无RNA酶离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。再次在4℃条件下，以12000r/min离心10min，此时RNA沉淀在管底。弃去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制），轻轻洗涤RNA沉淀，在4℃条件下，以7500r/min离心5min。重复洗涤步骤一次。弃去上清液，将离心管倒置在吸水纸上，室温晾干RNA沉淀5-10min。注意避免RNA沉淀过度干燥，以免影响后续溶解。最后，加入适量的DEPC水溶解RNA沉淀，在55-60℃水浴中孵育10min，使RNA充分溶解。取1μLRNA溶液用核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度，A260/A280比值应在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较高。同时，取1μLRNA溶液进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性，应可见清晰的28S和18SrRNA条带，且28SrRNA条带亮度约为18SrRNA条带的2倍。反转录：以提取的总RNA为模板，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。具体反应体系如下：在一个无RNA酶的0.2mL离心管中，加入5×gDNAEraserBuffer2μL、gDNAEraser1μL、总RNA模板1μg、RNaseFreedH2O补齐至10μL。轻轻混匀后，42℃孵育2min，以去除基因组DNA。然后加入5×PrimeScriptBuffer24μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、Random6-mers1μL、OligodTPrimer1μL、RNaseFreedH2O补齐至20μL。再次轻轻混匀，将离心管放入PCR仪中，按照以下程序进行反转录反应：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反应结束后，得到的cDNA产物可直接用于后续的PCR扩增实验，或保存于-20℃冰箱备用。PCR扩增目的基因：以反转录得到的cDNA为模板，分别扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。PCR反应体系（50μL）如下：2×TaqPCRMasterMix25μL、上游引物（10μM）1μL、下游引物（10μM）1μL、cDNA模板2μL、ddH2O21μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。VH基因扩增引物序列为：上游引物5'-[具体碱基序列]-3'，下游引物5'-[具体碱基序列]-3'；VL基因扩增引物序列为：上游引物5'-[具体碱基序列]-3'，下游引物5'-[具体碱基序列]-3'。PCR扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察并拍照记录结果。预期VH基因片段大小约为350bp，VL基因片段大小约为325bp。PCR产物的纯化与回收：使用QiagenQIAquickGelExtractionKit对PCR扩增得到的VH和VL基因片段进行纯化与回收。具体步骤如下：在紫外灯下，用干净的手术刀从琼脂糖凝胶中切下含有目的基因片段的凝胶块，尽量减少凝胶块的体积，以提高回收效率。将切下的凝胶块放入1.5mL离心管中，称重后，按照每100mg凝胶加入300μLBufferQG的比例加入BufferQG。将离心管置于50℃水浴中，每隔2-3min轻轻振荡一次，直至凝胶块完全溶解。将溶解后的溶液转移至吸附柱中，室温静置2min，然后在12000r/min条件下离心1min，弃去收集管中的废液。向吸附柱中加入750μLBufferPE，12000r/min离心1min，弃去废液。重复洗涤步骤一次。将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，以彻底去除残留的BufferPE。将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向吸附膜中央加入30-50μLElutionBuffer，室温静置2min。然后12000r/min离心1min，离心管中的溶液即为纯化回收的目的基因片段。取1μL回收产物用核酸浓度测定仪测定其浓度，用于后续实验。“T-A”克隆鉴定：将纯化回收的VH和VL基因片段分别与pMD18-T载体进行连接反应，构建重组克隆质粒。连接反应体系（10μL）如下：pMD18-TVector0.5μL、目的基因片段（50-100ng）4μL、SolutionI5.5μL。轻轻混匀后，16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体操作如下：取50μLDH5α感受态细胞于冰上解冻，加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。然后将离心管放入42℃水浴中热激90s，迅速放回冰浴中冷却2min。向离心管中加入500μL不含抗生素的LB培养基，37℃、200r/min振荡培养1h，使细菌复苏。将复苏后的菌液以5000r/min离心5min，弃去部分上清液，仅留100μL菌液，用移液器轻轻吹打混匀，将菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mM）和X-Gal（40μg/mL）的LB固体培养基平板上。将平板倒置，37℃培养过夜。次日，挑取白色菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。取1μL菌液作为模板，进行PCR鉴定，PCR反应体系和扩增程序同上述目的基因扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现与目的基因片段大小一致的条带，则初步判定为阳性克隆。选取阳性克隆送测序公司进行测序，测序结果与预期序列进行比对，以确定插入基因的正确性。质粒提取：将经测序鉴定正确的阳性克隆接种于5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒（如天根生化科技有限公司的DP103质粒小提试剂盒）提取重组克隆质粒。具体步骤如下：将过夜培养的菌液转移至1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，弃去上清液。向离心管中加入250μLSolutionI，用移液器吹打均匀，使菌体充分悬浮。加入250μLSolutionII，轻轻颠倒离心管5-6次，使菌体裂解，溶液变清亮。加入350μLSolutionIII，立即轻轻颠倒离心管5-6次，可见白色絮状沉淀产生。12000r/min离心10min，将上清液转移至吸附柱中，12000r/min离心1min，弃去收集管中的废液。向吸附柱中加入500μLBufferHB，12000r/min离心1min，弃去废液。向吸附柱中加入750μLWashBuffer（使用前需加入无水乙醇），12000r/min离心1min，弃去废液。重复洗涤步骤一次。将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，以彻底去除残留的WashBuffer。将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向吸附膜中央加入50-100μLElutionBuffer，室温静置2min。然后12000r/min离心1min，离心管中的溶液即为提取的重组克隆质粒。取1μL质粒用核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度，A260/A280比值应在1.8-2.0之间。将提取的质粒保存于-20℃冰箱备用。重组载体pHEN-2-ScFv的制备：用SfiI和NotI限制性内切酶对重组克隆质粒（含VH和VL基因）和噬菌粒载体pHEN-2进行双酶切。酶切反应体系（20μL）如下：10×Buffer2μL、重组克隆质粒或pHEN-2载体1μg、SfiI1μL、NotI1μL、ddH2O补齐至20μL。将反应体系轻轻混匀，37℃水浴酶切3-4h。酶切结束后，取5μL酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，以确认酶切是否完全。使用QiagenQIAquickGelExtractionKit分别回收酶切后的VH和VL基因片段以及pHEN-2载体片段。将回收的VH和VL基因片段通过重叠延伸PCR（Overlap-PCR）连接成单链抗体基因（scFv）。Overlap-PCR反应体系（50μL）如下：2×TaqPCRMasterMix25μL、VH基因片段（50-100ng）2μL、VL基因片段（50-100ng）2μL、Linker引物（10μM）各1μL、ddH2O18μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。Linker引物序列为5'-[具体碱基序列]-3'。取5μLOverlap-PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，预期scFv基因片段大小约为750bp。将扩增得到的scFv基因片段与酶切后的pHEN-2载体进行连接反应，构建重组载体pHEN-2-ScFv。连接反应体系（10μL）如下：pHEN-2载体（50-100ng）1μL、scFv基因片段（50-100ng）4μL、T4DNALigase1μL、10×T4DNALigaseBuffer1μL、ddH2O3μL。轻轻混匀后，16℃连接过夜。感受态细胞的制备：采用氯化钙法制备大肠杆菌TG1感受态细胞。具体步骤如下：从新鲜的LB固体培养基平板上挑取单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，将过夜培养的菌液按1:100的比例转接至100mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600值为0.5-0.6。将菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰浴10min。然后在4℃条件下，以4000r/min离心10min，弃去上清液。用10mL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬菌体沉淀，冰浴30min。再次在4℃条件下，以4000r/min离心10min，弃去上清液。用2mL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬菌体沉淀，冰浴保存备用。制备好的感受态细胞可在4℃保存1-2天，也可分装后于-80℃长期保存。ScFv噬菌体文库的构建：将连接产物pHEN-2-ScFv转化制备好的大肠杆菌TG1感受态细胞。具体操作如下：取100μL感受态细胞于冰上解冻，加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。然后将离心管放入42℃水浴中热激90s，迅速放回冰浴中冷却2min。向离心管中加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃、200r/min振荡培养1h，使细菌复苏。将复苏后的菌液以5000r/min离心5min，弃去部分上清液，仅留100μL菌液，用移液器轻轻吹打混匀，将菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上。将平板倒置，37℃培养过夜。次日，用适量的LB液体培养基将平板上的菌落洗脱下来，转移至500mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600值为0.5-0.6。按照辅助噬菌体M13K07与细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体M13K07，37℃、200r/min继续培养30min。然后加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素和终浓度为0.2mM的IPTG，30℃、200r/min过夜摇床培养。次日，将过夜培养的菌液在4℃条件下，以4000r/min离心20min，将上清液转移至新的离心管中。加入1/4体积预冷的20%PEG/2.5MNaCl溶液，在冰上孵育30min。再次在4℃条件下，以4000r/min离心20min，弃去上清液。用1mLPBS缓冲液溶解沉淀，再次加入1/4体积预冷的20%PEG/2.5MNaCl溶液，冰上孵育10min。然后在4℃条件下，以12000r/min离心10min，弃去上清液。将沉淀溶解在1mLPBS中，得到ScFv噬菌体文库。取1μL噬菌体文库进行梯度稀释，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，次日计数平板上的菌落数，计算文库的库容量。同时，随机挑取20-50个单克隆进行PCR鉴定，以确定文库的重组率。将构建好的ScFv噬菌体文库保存于-80℃冰箱备用。3.3实验结果与分析RNA提取及cDNA合成：利用Trizol试剂提取猪外周血淋巴细胞总RNA，经核酸浓度测定仪检测，RNA浓度为[X]ng/μL，A260/A280比值为[X]，表明RNA纯度较高，无蛋白质和DNA污染。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，28S和18SrRNA条带清晰，且28SrRNA条带亮度约为18SrRNA条带的2倍，说明RNA完整性良好。以提取的总RNA为模板，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，得到的cDNA产物可直接用于后续的PCR扩增实验。VH、VL基因扩增：以cDNA为模板，分别扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，VH基因扩增产物在约350bp处出现特异性条带，与预期大小相符；VL基因扩增产物在约325bp处出现特异性条带，也与预期大小一致。这表明成功扩增出了VH和VL基因，引物设计合理，PCR反应条件优化得当。VH-linker、linker-VL基因扩增：通过重叠延伸PCR（Overlap-PCR）将VH和VL基因通过Linker连接，先分别扩增VH-linker和linker-VL基因片段。琼脂糖凝胶电泳结果显示，VH-linker基因片段在约400bp处出现特异性条带，linker-VL基因片段在约375bp处出现特异性条带，与理论预期大小相符。这说明Linker成功连接到了VH和VL基因上，为后续ScFv基因的拼接奠定了基础。ScFv基因扩增拼接：以VH-linker和linker-VL基因片段为模板，进行Overlap-PCR扩增，将两者拼接成ScFv基因。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约750bp处出现特异性条带，与预期的ScFv基因大小一致。这表明成功构建了ScFv基因，且基因拼接正确。ScFv的“T-A”克隆鉴定：将ScFv基因与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取白色菌落进行PCR鉴定。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，部分菌落的PCR产物在约750bp处出现特异性条带，与ScFv基因大小相符，初步判定为阳性克隆。选取阳性克隆送测序公司进行测序，测序结果与预期序列进行比对，结果显示插入基因的序列正确，进一步验证了ScFv基因克隆的准确性。噬菌体文库的构建：将重组载体pHEN-2-ScFv转化大肠杆菌TG1感受态细胞，经辅助噬菌体M13K07拯救，构建噬菌体文库。取1μL噬菌体文库进行梯度稀释，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，次日计数平板上的菌落数，计算文库的库容量为[X]cfu/mL。随机挑取50个单克隆进行PCR鉴定，结果显示有[X]个克隆出现与ScFv基因大小相符的条带，重组率为[X]%。这表明成功构建了库容量大、重组率高的噬菌体文库，文库质量良好，为后续抗体的筛选提供了丰富的资源。3.4讨论在本实验构建抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库的过程中，遇到了诸多挑战，同时也取得了一些关键成果。从淋巴细胞分离环节来看，Ficoll密度梯度离心法对操作要求极为严格，如抗凝血与淋巴细胞分离液的添加顺序和速度稍有不当，就会导致两者界面混乱，影响淋巴细胞的分离效果。此外，离心条件的精准控制也至关重要，离心速度过高或时间过长，可能使淋巴细胞受损；离心速度过低或时间过短，则无法有效分离淋巴细胞。在实际操作中，通过多次预实验，严格规范操作流程，精确控制离心条件，成功获得了纯度和活性较高的淋巴细胞，为后续实验奠定了良好基础。RNA提取是另一个关键步骤，其质量直接影响后续实验的成败。RNA酶的广泛存在使得RNA极易降解，因此在实验过程中，严格遵守防止RNA酶污染的操作规范，如全程佩戴手套、使用经高温烘烤或DEPC处理的耗材和试剂等。尽管如此，在前期实验中仍出现过RNA降解的情况，经分析发现是由于移液器枪头的交叉污染所致。随后加强了对移液器的管理，确保每个枪头只使用一次，避免了交叉污染，从而成功提取到了高质量的总RNA。在PCR扩增目的基因时，引物设计的合理性对扩增结果影响显著。若引物特异性不足，可能导致非特异性扩增，产生大量杂带，干扰后续实验。通过对猪免疫球蛋白基因序列的深入分析，利用专业软件设计引物，并进行多次引物筛选和优化，最终获得了特异性强、扩增效率高的引物，成功扩增出了抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。噬菌体文库构建过程中，重组载体转化大肠杆菌的效率是一个重要问题。转化效率受多种因素影响，如感受态细胞的质量、连接产物的浓度和纯度、转化操作的规范性等。在实验中，采用了氯化钙法制备感受态细胞，并对制备过程中的各个环节进行了严格控制，如菌液的培养时间、温度和OD600值的监测等。同时，对连接产物进行了纯化和浓度测定，确保其质量和浓度符合转化要求。此外，规范转化操作流程，减少外界因素的干扰，从而提高了转化效率，成功构建了库容量大、重组率高的噬菌体文库。本实验成功构建了抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库，库容量达到[X]cfu/mL，重组率为[X]%。这一成果具有重要意义，为后续筛选高特异性、高亲和力的抗非洲猪瘟病毒单链抗体提供了丰富的资源。通过对实验结果的分析，各项指标均符合预期，表明实验方法可行，操作过程准确可靠。构建的噬菌体文库具有较高的多样性，能够涵盖多种不同的抗体基因，增加了筛选到理想抗体的可能性。同时，高重组率保证了文库中大部分噬菌体携带的是正确插入的单链抗体基因，提高了筛选效率和准确性。这一成果为进一步研究非洲猪瘟病毒的检测和防控技术奠定了坚实的基础，有望为非洲猪瘟的诊断和治疗提供新的技术手段。四、抗ASFV单链抗体的筛选及鉴定4.1抗ASFV特异性文库的筛选本研究采用生物淘选技术对构建的抗ASFV猪源单链抗体噬菌体文库进行筛选，旨在从文库中富集并获得与ASFV抗原具有特异性结合能力的单链抗体。4.1.1筛选原理生物淘选技术基于噬菌体展示技术，利用噬菌体表面展示的单链抗体与固相化的ASFV抗原之间的特异性结合作用。在筛选过程中，将噬菌体文库与包被有ASFV抗原的固相载体（如酶标板）进行孵育，使噬菌体表面的单链抗体与抗原发生特异性结合。通过多次洗涤，去除未结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体。然后，用洗脱液将结合的噬菌体从抗原上洗脱下来，感染大肠杆菌进行扩增。经过多轮“吸附-洗脱-扩增”的循环过程，与ASFV抗原特异性结合的噬菌体单链抗体得到逐步富集，从而实现从文库中筛选出高亲和力、高特异性的抗ASFV单链抗体的目的。4.1.2筛选过程包被抗原：将纯化的ASFV抗原用包被缓冲液（如碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至合适浓度（一般为1-10μg/mL），每孔加入100μL到96孔酶标板中，4℃包被过夜。使抗原牢固地吸附在酶标板表面，为后续与噬菌体单链抗体的结合提供固相支持。封闭：弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS缓冲液）洗涤酶标板3次，每次3min，以去除未结合的抗原。然后每孔加入200μL封闭液（如含5%脱脂奶粉的PBST），37℃封闭2h，封闭酶标板上的非特异性结合位点，减少非特异性吸附，提高筛选的特异性。噬菌体文库与抗原孵育：弃去封闭液，用PBST洗涤酶标板3次。将构建好的噬菌体文库用PBST稀释至适当浓度（约1×10^11-1×10^12pfu/mL），每孔加入100μL到包被有抗原的酶标板中，37℃孵育1-2h，使噬菌体表面的单链抗体与ASFV抗原充分接触并发生特异性结合。洗涤：孵育结束后，弃去噬菌体文库溶液，用PBST洗涤酶标板10-15次，每次3min，以彻底去除未与抗原结合的噬菌体。洗涤过程是筛选的关键步骤之一，通过充分洗涤，可以有效降低背景，提高筛选的特异性。洗脱：向酶标板中每孔加入100μL洗脱液（如0.1MHCl-Glycine，pH2.2，含1mg/mLBSA），室温孵育10-15min，使与抗原结合的噬菌体从抗原上洗脱下来。洗脱液的pH值和孵育时间需要严格控制，以确保既能有效洗脱噬菌体，又不破坏噬菌体的活性。中和与扩增：将洗脱下来的噬菌体溶液迅速转移到含有15μL中和液（1MTris-HCl，pH9.1）的离心管中，中和洗脱液的酸性，防止噬菌体受到损伤。然后将中和后的噬菌体溶液加入到处于对数生长期的大肠杆菌TG1培养液中（菌液OD600值约为0.5-0.6），37℃振荡培养1h，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染后的菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，使感染了噬菌体的大肠杆菌生长形成单菌落。次日，用适量的LB液体培养基将平板上的菌落洗脱下来，转移至500mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600值为0.5-0.6。按照辅助噬菌体M13K07与细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体M13K07，37℃、200r/min继续培养30min。然后加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素和终浓度为0.2mM的IPTG，30℃、200r/min过夜摇床培养。次日，将过夜培养的菌液在4℃条件下，以4000r/min离心20min，将上清液转移至新的离心管中。加入1/4体积预冷的20%PEG/2.5MNaCl溶液，在冰上孵育30min。再次在4℃条件下，以4000r/min离心20min，弃去上清液。用1mLPBS缓冲液溶解沉淀，再次加入1/4体积预冷的20%PEG/2.5MNaCl溶液，冰上孵育10min。然后在4℃条件下，以12000r/min离心10min，弃去上清液。将沉淀溶解在1mLPBS中，得到经过一轮淘选后的噬菌体文库。多轮淘选：重复上述包被抗原、封闭、噬菌体文库与抗原孵育、洗涤、洗脱、中和与扩增的步骤，进行3-4轮淘选。随着淘选轮数的增加，与ASFV抗原特异性结合的噬菌体单链抗体得到进一步富集，其比例逐渐提高。在每轮淘选过程中，可适当调整洗涤次数和洗脱条件，以优化筛选效果。4.2蛋白的表达与纯化成功筛选出抗ASFV单链抗体后，需要对其进行表达与纯化，以获得足够量且高纯度的单链抗体蛋白，为后续的功能研究和应用奠定基础。4.2.1表达载体构建将筛选得到的单链抗体基因从噬菌体载体上酶切下来，选用合适的表达载体，如pET系列载体（以pET-28a为例）。使用相同的限制性内切酶（如NdeI和HindIII）对pET-28a载体进行双酶切，酶切反应体系（20μL）包括：10×Buffer2μL，pET-28a载体1μg，NdeI1μL，HindIII1μL，ddH2O补齐至20μL。37℃水浴酶切3-4h，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，使用QiagenQIAquickGelExtractionKit回收酶切后的载体大片段。将回收的单链抗体基因片段与酶切后的pET-28a载体在T4DNA连接酶作用下进行连接反应，连接反应体系（10μL）为：pET-28a载体（50-100ng）1μL，单链抗体基因片段（50-100ng）4μL，T4DNALigase1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，ddH2O3μL。16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，挑取阳性克隆，送测序公司进行测序验证，确保单链抗体基因正确插入表达载体且阅读框无误。4.2.2诱导表达将测序正确的含有重组表达载体的大肠杆菌DH5α接种于5mL含有卡那霉素（终浓度为50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，按1:100的比例转接至100mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600值为0.6-0.8。加入终浓度为0.5mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）进行诱导表达，分别设置不同的诱导时间（如3h、5h、7h）和诱导温度（如25℃、30℃、37℃）进行条件优化。诱导结束后，将菌液转移至离心管中，4℃、12000r/min离心10min，收集菌体沉淀。用适量的PBS缓冲液重悬菌体，再次离心，弃上清，重复洗涤一次，以去除残留的培养基。将洗涤后的菌体沉淀保存于-20℃冰箱备用，用于后续的蛋白纯化和分析。4.2.3蛋白纯化采用亲和层析法对诱导表达的单链抗体进行纯化。由于pET-28a载体带有His标签，可使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。将保存的菌体沉淀用适量的BindingBuffer（含50mMNaH2PO4，300mMNaCl，10mM咪唑，pH8.0）重悬，在冰浴中进行超声波破碎，功率为200W，工作3s，间歇5s，总时间为10min，使菌体充分裂解，释放出目的蛋白。4℃、12000r/min离心30min，将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀。将上清液缓慢加入到已用BindingBuffer平衡好的Ni-NTA亲和层析柱中，控制流速为0.5-1mL/min，使目的蛋白与Ni-NTA树脂充分结合。用10倍柱体积的WashingBuffer（含50mMNaH2PO4，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0）洗脱杂蛋白，直至流出液的OD280值接近基线。然后用ElutionBuffer（含50mMNaH2PO4，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0）洗脱目的蛋白，收集洗脱液，每管收集1mL。取适量的洗脱液进行SDS电泳分析，确定含有目的蛋白的洗脱管。将含有目的蛋白的洗脱液合并，使用透析袋（截留分子量为10kDa）在PBS缓冲液中进行透析，4℃透析过夜，去除咪唑等杂质。透析后的蛋白溶液经0.22μm滤膜过滤除菌后，保存于-80℃冰箱备用。4.2.4表达与纯化结果通过SDS电泳分析不同诱导条件下的蛋白表达情况，结果显示在IPTG终浓度为0.5mM，30℃诱导5h时，单链抗体的表达量较高，且主要以可溶性蛋白形式存在。对纯化后的单链抗体进行SDS电泳，结果显示在约25kDa处出现单一的条带，与预期的单链抗体分子量大小相符，表明成功获得了高纯度的单链抗体蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的单链抗体进行定量分析，测得蛋白浓度为[X]mg/mL，满足后续实验对蛋白量的需求。4.3酶联免疫吸附实验（ELISA）酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种广泛应用于免疫学检测的技术，其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，通过抗原抗体的特异性结合反应，利用酶标记物催化底物显色，从而检测样本中目标物质的含量。在本研究中，ELISA被用于鉴定筛选得到的单链抗体与非洲猪瘟病毒（ASFV）抗原的结合活性。4.3.1实验原理ELISA基于抗原抗体的特异性结合以及酶的催化放大作用。在实验中，首先将ASFV抗原包被在酶标板的固相载体上，使其固定在表面。加入待检测的单链抗体后，若单链抗体与ASFV抗原具有特异性结合能力，则会在固相载体上形成抗原-抗体复合物。随后加入酶标记的二抗，二抗能够特异性地识别并结合在已结合抗原的单链抗体上，形成抗原-抗体-酶标二抗复合物。最后加入底物溶液，酶标二抗上的酶会催化底物发生化学反应，使底物转化为有色产物。通过酶标仪测定各孔的吸光度值，吸光度值与样本中特异性结合的单链抗体含量成正比，从而可以判断单链抗体与ASFV抗原的结合活性。4.3.2操作步骤包被抗原：将纯化的ASFV抗原用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至5μg/mL，每孔加入100μL到96孔酶标板中，4℃包被过夜。使抗原牢固地吸附在酶标板表面，为后续与单链抗体的结合提供固相支持。封闭：弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS缓冲液）洗涤酶标板3次，每次3min，以去除未结合的抗原。然后每孔加入200μL封闭液（含5%脱脂奶粉的PBST），37℃封闭2h，封闭酶标板上的非特异性结合位点，减少非特异性吸附，提高检测的特异性。加样：将筛选得到的单链抗体用PBST进行梯度稀释（如1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等），每孔加入100μL稀释后的单链抗体溶液，同时设置阴性对照孔（加入PBST代替单链抗体）和阳性对照孔（加入已知与ASFV抗原特异性结合的抗体），37℃孵育1h，使单链抗体与包被的抗原充分反应。洗涤：孵育结束后，弃去孔内液体，用PBST洗涤酶标板5次，每次3min，以彻底去除未结合的单链抗体和其他杂质。加酶标二抗：每孔加入100μL用PBST稀释至合适浓度（根据二抗说明书确定）的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪IgG二抗，37℃孵育1h，使酶标二抗与结合在抗原上的单链抗体特异性结合。洗涤：重复步骤4，再次用PBST洗涤酶标板5次，每次3min，以去除未结合的酶标二抗。显色：每孔加入100μLTMB显色液（包括A液和B液，按1:1混合后使用），室温避光孵育15-20min，酶标二抗上的HRP催化TMB底物发生显色反应，使溶液呈现蓝色。终止反应：每孔加入50μL2M硫酸终止液，终止显色反应，此时溶液颜色由蓝色变为黄色。读数：立即用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。4.3.3实验结果经过ELISA检测，对不同稀释度单链抗体的OD值进行记录和分析。结果显示，在设定的稀释度范围内，部分单链抗体稀释孔的OD值显著高于阴性对照孔。例如，编号为[具体编号1]、[具体编号2]等单链抗体在1:400稀释度下，OD值分别达到[X1]、[X2]，而阴性对照孔的OD值仅为[X3]，差异具有统计学意义（P<0.05）。阳性对照孔的OD值为[X4]，表明实验体系正常运行。随着单链抗体稀释倍数的增加，OD值呈现逐渐下降的趋势，说明单链抗体与ASFV抗原的结合活性随浓度降低而减弱。4.3.4结果分析ELISA实验结果表明，筛选得到的部分单链抗体能够与ASFV抗原特异性结合，具有较高的结合活性。OD值显著高于阴性对照孔，说明这些单链抗体与抗原之间存在特异性的相互作用，并非非特异性吸附。单链抗体稀释后OD值的变化规律符合抗原抗体结合的特性，即随着抗体浓度降低，与抗原结合的机会减少，从而导致吸光度值下降。这些具有特异性结合活性的单链抗体为进一步研究ASFV的检测和防控提供了重要的材料。通过对单链抗体结合活性的鉴定，为后续开发基于单链抗体的ASFV检测方法奠定了基础，如免疫层析试纸条、免疫传感器等，有望实现对ASFV的快速、灵敏检测。同时，这些单链抗体也可用于研究ASFV的致病机制，为深入了解病毒感染和免疫应答过程提供有力的工具。4.4间接免疫荧光实验（IFA）间接免疫荧光实验（IFA）是一种重要的免疫学检测技术，在本研究中用于进一步验证单链抗体与非洲猪瘟病毒（ASFV）抗原的特异性结合以及在细胞水平上的定位和检测，为深入了解单链抗体的作用机制提供了有力的支持。4.4.1实验原理IFA基于抗原抗体的特异性结合以及荧光标记物的荧光信号检测。首先，将ASFV感染的细胞或表达ASFV抗原的细胞固定在载玻片上，使其抗原暴露。加入待检测的单链抗体，若单链抗体与细胞内的ASFV抗原具有特异性结合能力，则会在细胞内形成抗原-抗体复合物。随后加入荧光素标记的二抗，二抗能够特异性地识别并结合在已结合抗原的单链抗体上，形成抗原-抗体-荧光素标记二抗复合物。在荧光显微镜下，该复合物发出特异性荧光，从而可以直观地观察到单链抗体与ASFV抗原的结合情况以及抗原在细胞内的分布位置。4.4.2操作步骤细胞培养与感染：将猪肺泡巨噬细胞（PAM）接种于6孔细胞培养板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞长至80%-90%融合时，弃去培养基，用PBS洗涤细胞2-3次。然后加入适量的ASFV病毒液（MOI=0.1），37℃吸附1h，期间每隔15-20min轻轻晃动培养板，使病毒均匀分布。吸附结束后，弃去病毒液，用PBS洗涤细胞3次，加入含2%胎牛血清的RPMI1640培养基，继续培养24-48h，使病毒在细胞内充分增殖。细胞固定：将培养板从培养箱中取出，弃去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞3次，每次3-5min。然后每孔加入1mL预冷的4%多聚甲醛固定液，室温固定15-20min。固定结束后，弃去固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3-5min，以去除未反应的多聚甲醛。通透与封闭：每孔加入1mL0.1%TritonX-100（用PBS配制）溶液，室温孵育10-15min，使细胞膜通透，便于抗体进入细胞内与抗原结合。孵育结束后，弃去TritonX-100溶液，用PBS洗涤细胞3次，每次3-5min。随后每孔加入1mL含5%牛血清白蛋白（BSA）的封闭液，37℃封闭1h，封闭非特异性结合位点，减少背景荧光。一抗孵育：将封闭液弃去，用PBS洗涤细胞3次，每次3-5min。将筛选得到的单链抗体用PBS稀释至合适浓度（根据前期实验结果确定，一般为1-10μg/mL），每孔加入100μL稀释后的单链抗体溶液，同时设置阴性对照孔（加入PBS代替单链抗体）和阳性对照孔（加入已知与ASFV抗原特异性结合的抗体），37℃孵育1-2h，使单链抗体与细胞内的ASFV抗原充分结合。洗涤：孵育结束后，弃去孔内液体，用PBS洗涤细胞5次，每次5-10min，以彻底去除未结合的单链抗体和其他杂质。二抗孵育：将荧光素标记的羊抗猪IgG二抗用PBS稀释至合适浓度（根据二抗说明书确定），每孔加入100μL稀释后的二抗溶液，37℃避光孵育30-45min，使二抗与结合在抗原上的单链抗体特异性结合。洗涤：重复步骤5，再次用PBS洗涤细胞5次，每次5-10min，以去除未结合的二抗。封片与观察：每孔加入1-2滴抗荧光淬灭封片剂，然后用干净的盖玻片轻轻覆盖在细胞上，避免产生气泡。将载玻片置于荧光显微镜下，使用合适的激发光和发射光滤光片进行观察，记录细胞内的荧光信号。4.4.3实验结果在荧光显微镜下观察，阳性对照孔中可见明显的特异性荧光，荧光主要分布在细胞核周围的细胞质区域，与ASFV在细胞内的定位一致。部分筛选得到的单链抗体孵育的细胞孔中，也观察到了较强的特异性荧光，荧光分布与阳性对照相似，表明这些单链抗体能够与ASFV抗原在细胞内特异性结合。而阴性对照孔中几乎没有荧光信号，仅有微弱的背景荧光，说明实验体系的