西医分子生物学真核生物基因表达调控教案

西医分子生物学真核生物基因表达调控教案

教学目的：让学生理解真核生物基因表达调控的复杂性，并掌握在各

水平上的调控机制。

教学重点、难点：染色质结构对基因转录的影响；转录水平的调控。

课时安排：4学时

教学内容：

尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它

具有一些明显的特点。

第一节真核生物基因调控的特点一、真核基因表达调控的环节更多

如前所述，基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白

质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控

的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线

粒体内)，翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更

多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分•<>

真核细胞在分化过程中会发生基因重排(generearrangement),即胚

原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整

抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个

不同的可变区基因经选择、姐合、变化，与恒定区基因一起构成稳定

的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细

胞可能利用几百个抗体基因的片段组合变化而产生能编码达108种

不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。

此外，真核细胞中还会发生基因扩增(geneamplification),即基因组

中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的

成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩

增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然

适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质，需要有大■核糖体。

又如MTX(methotrexate)是叶酸的结构类似物，一些哺乳类细胞会对

含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶

(dihydrofolatereductase,DHFR)基因的DNA区段扩增4CM00倍，使

DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无

疑能够大幅度提高基因表达产物的・，但这种调控机理至今还不清楚。

二、真核基因的转录与染色质的结构变化相关

真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，

染色质的结构、染色质中NA和组蛋白的结构状态都影响转录，至少

有以下现象：

1、染色质结构影响基因转录

细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质

(euchromatin)，松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区

段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间

期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质(heterochromatin),其

中从未见有基因转录表达；原本在常染色质中表达的基因如移到异染

色质内也会停止表达；哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条

变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可见紧密的染

色质结构阻止基因表达。

2、组蛋白的作用

早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，

去除组蛋基因又能够转录。组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与

DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了

转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；染色质中的非组蛋白成

分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻

遇促转录作用。

发现核小体后，进一步观察核小体结构与基因转录的关系，发现活跃

转录的染色质区段，有富含赖氨酸的组蛋白(H1组蛋白)水平降低，

H2AH2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化(acetylation)和

泛素化(ubiquitination),以及H3组蛋白菊基化等现象，这些都是核

小体不稳定或解体的因素或指征。转录活跃的区域也常缺乏核小体的

结构。这些都表明核小体结构影响基因转录。

3、转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加

染色质DNA受DNasel作用通常会被降解成100,400……bp的片

段，反映了完整的核小体规则的重复结构。但活跃进行转录的染色质

区域受DNasel消化常出现100-200bp的DNA片段，旦长短不均

一，说明其DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNasel高敏

感点(hypersensitivesite)。这种高敏感点常出现在转录基因的5'侧区

(5'flankingregion)、3'末端或在基因上，多在调控蛋白结合位点的附

近，分析该区域核小体的结构发生变化，可能有利于调控

蛋白结合而促进转录。

4、DNA拓扑结构变化

天然双链DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时，RNA

聚合酶转录方向前方DNA的构象是正性超螺旋，其后面的DNA为

负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶向前移

动转录；而负性超螺旋则有利于核小体的再形成。

5、DNA碱基修饰变化

真核DNA中的胞噂院约有5%被甲基化为5■甲基胞噂咤(舁

methylcytidine,m5C),而活跃转录的DNA段落中胞唔嚏甲基化程度

常较低。这种甲基化最常发生在某些基因5,侧区的CpG序列中，实

验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转

录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。如果用基因打靶的方

法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡，

可见DNA的甲基化对基因表达调控是重要的。

由此可见，染色质中的基因转录前先要有一个被激活的过程，但目前

对激活机制还缺乏认识。

三、真核基因表达以正性调控为主

真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自身来起始

转录，需要依赖多种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发

现有负性调控元件，但其存在并不普遍；真核基因转录表达的调控蛋

白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的是以激活蛋白的

作用为主。即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要

表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。换言之：真核基因表达以正

性调控为主导。

第二节真核基因转录水平的调控

真核细胞的三种RNA聚合酶(I、II和川)中，只有RNA聚合酶II能转录

生成mRNA,以下主要讨论RNA聚合酶II的转录调控。

一、顺式作用元件(cis・actingelements)

真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响

转录的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件，包

括启动子(promoter)、增强子(enhancer);近年又发现起负性调控作

用的元件如沉默子(silencer)。

1、启动子

与原核启动子的含义相同，是指RNA聚合酶结合并起动转录的DNA

序列。但真核同启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列，而且

单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录，而是需要多种蛋白质

因子的相互协调作用，不同蛋白质因子又能与不同DNA序列相互作

用，不同基因转录起始及其调控所需的蛋白因子也不完全相同，因而

不同启动子序列也很不相同，要比原核更复杂、序列也更长。真核启

动子一般包括转录起始点及其上游约100・200bp序列，包含有若干

具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7-30bpo

启动子中的元件可以分为两种：核心启动子元件

(corepromoterelement)和上游启动子元件

(upstreampromoterelement)(见第五章)。

2、增强子

增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病

毒中发现的长约200bp的一段DNA,可使旁侧的基因转录提高100

倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强

子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本

核心组件常为8・12bp,可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子

的作用有以下特点：

1)增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，

通常可距离1・4kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作

用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

2)增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然

能起作用。而将启动子倒就不能起作用，可见增强子与启动子是很不

相同的。

3)增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不

能表现活性。但增强子对动子没有严格的专一性，同一增强子可以影

响不同类型启动子的转录。例如当含有增强子的病毒基因姐整合入宿

主细胞基因组时，能够增强整合区附近宿主某些基因的转录；当增强

子随某些染色体段落移位时，也能提高移到的新位置周围基因的转录。

使某些癌基因转录表达增强，可能是肿痛发生的因素之一。

4)增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，

必须与特定的蛋白质因结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般

具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性,

是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。

3、沉默子

最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和

重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低

或关闭中起作用的序列研究还不多，但从已有的例子看到：沉寂子的

作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因

的表达起作用。

二、反式作用因子

以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子

(transcriptionfactors,TF)ORNA聚合酶是一种反式作用于转录的蛋白

因子。在真核细胞中RNA聚合酶通常不能单独发挥转录作用，而需

要与其他转录因子共同协作。与RNA聚合酶I、II、川相应的转录因子

分别称为TFkTFIkTFIII，对TFII研究最多。

以前认为与TATA盒结合的蛋白因子是TFII-D,后来发现TFII-D

实际包括两类成分：与TATA盒结合的蛋白是

TBP(TATAboxbindingprotein)，是唯一能识别TATA盒并与其结合的

转录因子，是三种RNA聚合酶转录时都需要的；其他称为TBP相关

因子(TBPassociatedfactorsTAF),至少包括8种能与TBP紧密结合

的因子。转录前先是TFII-D与TATA盒结合；继而TFII-B以其C

端与TBP-DNA复合体结合，其N端则能与RNA聚合酶II亲和结

合，接着由两个亚基组成的TFIJF加入装配，TFII・F能与RNA聚

合酶形成复合体，还具有依赖于ATP供给能■的DNA解旋酶活性,

能解开前方的DNA双螺旋，在转录链延伸中起作用。这样，启动子

序列就与TFII・D、B、F及RNA聚合酶II结合形成一个“最低限度”能

有转录功能基础的转录前起始复合物(preintitiationcomplex,PIC),能

转录mRNAoTFII-H是多亚基蛋白复合体，具有依赖于ATP供给

能■的DNA解旋酶活性，在转录链延伸中发挥作用；TFII-E是两

个亚基组成的四聚体，不直接与DNA结合而可能是与TFII-B联系，

能提高ATP酶的活性；TFII-E和TFII-H的加入就形成完整的转

录复合体，能转录延伸生成长链RNA,TFII-A能稳定TFII-D与

TATA盒的结合，提高转录效率，但不是转录复合体一定需要的。

以上所述是典型的启动子上转录复合体的形成，但有的真核启动子不

含TATA盒或不通过TATA盒开始转录。例如有的无TATA盒的启

动子是靠TFII-1和TFII-D共同组成稳定的转录起始复合体开始转

录的。由此可以看到真核转录起始的复杂性。

不同基因由不同的上游启动子元件组成，能与不同的转录因子结合,

这些转录因子通过与基础的转录复合体作用而影响转录的效率。现在

已经发现有许多不同的转录因子，看到的现象是：同一DNA序列可

被不同的蛋白因子所识别；能直接结合DNA序列的蛋白因子是少数,

但不同的蛋白因子间可以相互作用，因而多数转录因子是通过蛋白质

•蛋白质间作用与DNA序列联系并影响转录效率的。转录因子之间

或转录因子与DNA的结合都会引起构象的变化，从而影响转录的效

率。

作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域:1)

DNA结合域(DNAbindingdomain)，多由60-100个氨基酸残基组织

的几个亚区组成；2)转录激活域(activatingdomain)，常由30・100

氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含

脯氨酸等不同种类，以酸性结构域最多见；3)连接区，即连接上两

个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，

但能通过转录激活域直接或间接作用于转录复合体而影响转录效率。

与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与DNA结合的

功能域常见有以下几种：

1、螺旋・转角・螺旋(116反牝111$6收用丁时及螺旋・环・螺旋(110收・10(^・

helix,HLH)这类结构至少有两个。螺旋，其间由短肽段形成的转角或

环连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于

DNA一个螺距(3.4nm),两个a螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。

2、锌指⑵ncfinger)每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基，锌

以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2