中国农业科学院博士研究生预防兽医学入学试题近5年考题及答案

中国农业科学院博士研究生预防兽医学入学试题近5年考题及答案一、名词解释（每题3分，共30分）1.病原相关分子模式（PAMPs）2.基因VII型新城疫病毒3.分子流行病学4.布鲁氏菌病5.免疫逃逸6.反向遗传学7.生物安全隔离区8.副黏病毒科9.抗原漂移10.“全健康”理念二、单项选择题（每题2分，共40分）1.预防兽医学研究的核心对象是（）。A.单个患病动物B.动物群体C.兽医临床技术D.实验室仪器设备2.非洲猪瘟病毒（ASFV）属于（）。A.正黏病毒科B.疱疹病毒科C.非洲猪瘟病毒科D.痘病毒科3.细菌的耐药性机制中，最主要且最常见的机制是（）。A.药物外排泵过度表达B.产生灭活酶C.靶位改变D.生物膜形成4.在病毒复制过程中，负责合成病毒负链RNA的酶通常是（）。A.依赖RNA的RNA聚合酶B.依赖DNA的RNA聚合酶C.逆转录酶D.溶菌酶5.下列哪种疾病属于人畜共患病，且主要通过气溶胶传播？（）A.狂犬病B.炭疽C.高致病性禽流感D.钩端螺旋体病6.评价疫苗免疫效果的指标中，最能反映群体抵抗力的指标是（）。A.抗体滴度B.细胞因子水平C.保护率D.存活率7.PCR技术中，引物的Tm值一般设定在（）。A.45-50℃B.55-65℃C.70-75℃D.80-85℃8.口蹄疫病毒具有（）个血清型。A.1B.3C.7D.149.下列关于内毒素的描述，错误的是（）。A.是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖（LPS）B.化学性质稳定，耐热C.免疫原性强，可制备类毒素D.毒性作用主要是引起发热、休克和DIC10.在免疫学中，IgG的主要功能不包括（）。A.通过胎盘B.激活补体经典途径C.介导ADCC作用D.黏膜局部免疫11.猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒主要侵害猪的（）。A.呼吸系统和消化系统B.生殖系统和呼吸系统C.神经系统和消化系统D.皮肤和肾脏12.建立无特定病原体（SPF）动物群的主要目的是（）。A.降低饲养成本B.提高生长速度C.排除干扰实验的背景感染D.方便管理13.下列哪种技术常用于检测病毒抗原？（）A.ELISAB.PCRC.SouthernBlotD.测序14.禽流感病毒的血凝素（HA）蛋白在病毒入侵过程中的作用是（）。A.介导病毒释放B.介导病毒吸附C.激活补体D.抑制干扰素15.某猪场出现仔猪下痢，剖检见肠壁透明菲薄，内容物呈黄色浆液性。最可能的诊断是（）。A.猪瘟B.猪传染性胃肠炎C.猪肺疫D.猪丹毒16.在兽医公共卫生中，评价食品安全风险的首要步骤是（）。A.风险管理B.风险交流C.危害识别D.暴露评估17.现代分子生物学技术中，CRISPR/Cas9系统的主要功能是（）。A.基因扩增B.基因编辑C.蛋白质印迹D.细胞融合18.下列关于细菌毒素的叙述，正确的是（）。A.外毒素主要由革兰氏阳性菌产生，但革兰氏阴性菌也能产生B.内毒素毒性比外毒素强C.外毒素耐热，经高压蒸汽处理不失活D.外毒素主要由细菌细胞壁成分组成19.用于检测牛结核病的经典变态反应试验是（）。A.琼脂扩散试验B.补体结合试验C.结核菌素皮内试验D.ELISA20.在病毒纯化中，利用颗粒大小差异进行分离的方法是（）。A.密度梯度离心B.差速离心C.层析技术D.电泳技术三、判断题（每题1.5分，共15分）1.所有病毒都含有核酸和蛋白质，但必须含有脂质囊膜才能存活。（）2.抗生素后效应（PAE）是指细菌与抗生素短暂接触后，当抗生素浓度低于最低抑菌浓度时，细菌生长仍受到持续抑制的效应。（）3.猪瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属的成员，只有一个血清型。（）4.灭活疫苗通常比弱毒疫苗产生免疫力更快，免疫效果更好。（）5.所有的人畜共患病都可以通过接种疫苗进行有效预防。（）6.实时荧光定量PCR只能进行定性检测，不能进行定量分析。（）7.细菌的生物被膜是其产生耐药性的重要机制之一，也是导致慢性感染难以治愈的原因。（）8.宿主的MHC分子在抗原提呈过程中起关键作用，且具有高度多态性。（）9.弓形虫的终末宿主是猫和猫科，中间宿主范围很广，包括人。（）10.兽医诊断中，血清学阳性即代表动物正在发病，必须立即扑杀。（）四、简答题（每题10分，共60分）1.简述细菌耐药性的主要传播机制。2.试比较灭活疫苗与弱毒疫苗的优缺点。3.简述高致病性禽流感（HPAI）的临床诊断要点和紧急防控措施。4.什么是“反向疫苗学”？它与传统疫苗研发相比有何优势？5.简述病毒受体结合蛋白与宿主细胞受体相互作用的分子机制及其在抗病毒药物设计中的应用。6.列举预防兽医学研究中常用的分子生物学技术，并简述其中两种技术的原理。五、论述题（每题25分，共75分）1.结合非洲猪瘟（ASF）的流行现状，论述其病毒学特性、致病机理以及当前防控中存在的难点和未来研究方向。2.当前，细菌多重耐药性（MDR）已成为全球公共卫生的重大威胁。请从“全健康”视角，论述兽用抗生素耐药性的产生、传播链条及综合治理策略。3.试述口蹄疫病毒（FMDV）的分子生物学特征（基因组结构、蛋白功能）及其对疫苗设计（如多价疫苗、标记疫苗）的影响。六、实验设计题（共30分）某养殖场疑似暴发了一种新的病毒性传染病，请设计一套完整的实验方案，包括病料采集、病毒分离鉴定、全基因组测序及进化树分析，以确定该病毒的种属及来源。参考答案与详细解析一、名词解释1.病原相关分子模式（PAMPs）：是指病原微生物表面共有的、高度保守的某些分子结构，如革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）、革兰氏阳性菌的肽聚糖、病毒的双链RNA等。这些结构能被宿主先天免疫细胞的模式识别受体（PRRs）识别，从而启动免疫应答。2.基因VII型新城疫病毒：是新城疫病毒（NDV）的一种基因型，主要流行于亚洲地区，特别是中国。该基因型毒株通常对水禽的致病性增强，且其F蛋白裂解位点氨基酸序列多具有强毒株特征，是当前我国新城疫防控的主要对象。3.分子流行病学：是应用分子生物学技术（如PCR、测序、基因分型等）来研究病原体在人群、动物群或环境中的分布、传播规律、变异特征以及与疾病发生发展关系的学科。它比传统流行病学能更精确地追踪传染源和传播途径。4.布鲁氏菌病：是由布鲁氏菌引起的一种世界性重要人畜共患病。主要感染牛、羊、猪等家畜，引起生殖系统炎症（如流产、睾丸炎）。人类通过接触患病动物或其产品（如奶、肉）感染，表现为波状热、多汗、关节痛等，严重危害人类健康和畜牧业发展。5.免疫逃逸：是指病原体（病毒、细菌、寄生虫等）通过抗原变异、潜伏感染、抑制免疫细胞功能、阻断抗原提呈或干扰细胞因子作用等机制，逃避宿主免疫系统识别和清除的过程。免疫逃逸是病原体得以在宿主体内长期存活和致病的重要原因。6.反向遗传学：是在获得生物体基因组核苷酸序列的基础上，通过构建感染性克隆或定点突变技术，人为改造基因组序列，并拯救出具有特定性状的突变病毒或细菌，从而在基因水平上研究基因组结构与功能相互关系的学科。7.生物安全隔离区：是指对同一生物安全管理体系下的、具有特定卫生状况的动物亚群体及其环境进行定义和管理的区域。它突破了行政区划的限制，通过采取生物安全措施，防止病原体传入、传出和扩散，是OIE推崇的动物疫病区域化管理模式。8.副黏病毒科：是一类具有囊膜的单股负链RNA病毒。病毒粒子通常呈球形或多形性，囊膜表面有血凝素（H）和/或神经氨酸酶（N）刺突。该科包含多种重要动物致病病毒，如新城疫病毒、副流感病毒、犬瘟热病毒等。9.抗原漂移：主要发生于流感病毒等RNA病毒中，是指病毒基因组在复制过程中由于RNA聚合酶缺乏校对功能，导致基因点突变逐渐积累，引起编码蛋白（主要是血凝素HA和神经氨酸酶NA）的氨基酸序列发生微小改变，从而逃避免疫系统的识别。这是流感病毒每年发生季节性流行的主要原因。10.“全健康”理念：是指认识到人类健康、动物健康和环境健康是密不可分的整体。该理念强调通过跨学科、跨部门（医疗、兽医、环境等）的协作，共同应对新发传染病、食品安全问题、抗生素耐药性等全球性健康挑战，实现最佳的健康成果。二、单项选择题1.B。解析：预防兽医学侧重于动物群体的疾病预防、控制与消灭，以及公共卫生。2.C。解析：ASFV是唯一已知的DNA虫媒病毒，也是非洲猪瘟病毒科的唯一成员。3.B。解析：产生灭活酶（如β-内酰胺酶）是细菌耐药最常见、最主要的机制。4.A。解析：RNA病毒通常依赖自身的RNA依赖RNA聚合酶进行复制。5.C。解析：高致病性禽流感（如H5N1、H7N9）可通过呼吸道气溶胶传播，且致死率高。6.C。解析：保护率是评价疫苗在群体中预防发病效果的最直接指标，抗体滴度是间接指标。7.B。解析：引物Tm值通常设定在55-65℃之间，以保证退火时的特异性。8.C。解析：口蹄疫病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1共7个血清型。9.C。解析：内毒素是脂多糖，免疫原性较弱，不能制备类毒素；类毒素是由外毒素脱毒制备的。10.D。解析：黏膜局部免疫主要由分泌型IgA（sIgA）介导，IgG主要存在于血清和组织液中。11.B。解析：PRRSV主要侵害母猪的繁殖系统（流产、死胎）和各年龄猪的呼吸系统。12.C。解析：SPF动物排除了特定病原体的隐性感染，保证了实验结果的准确性和可重复性。13.A。解析：ELISA常用于检测抗原或抗体；PCR检测核酸。14.B。解析：HA蛋白介导病毒吸附宿主细胞表面的唾液酸受体；NA蛋白介导病毒释放。15.B。解析：猪传染性胃肠炎病毒主要引起仔猪呕吐、水样腹泻，肠壁变薄是典型病变。16.C。解析：风险评估的步骤包括：危害识别、危害特征描述、暴露评估、风险特征描述。危害识别是第一步。17.B。解析：CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑工具，用于对基因组DNA进行定点修饰。18.A。解析：外毒素主要由革兰氏阳性菌产生，但部分革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、霍乱弧菌）也能产生。19.C。解析：牛结核病诊断的标准方法是结核菌素皮内变态反应试验（PPD试验）。20.B。解析：差速离心利用颗粒大小和沉降速度差异分离；密度梯度离心利用颗粒密度差异分离。三、判断题1.×。解析：并非所有病毒都有囊膜，如禽腺病毒、细小病毒等无囊膜病毒。2.√。解析：这是抗生素后效应（PAE）的正确定义。3.√。解析：猪瘟病毒抗原性相对稳定，目前公认只有一个血清型，但毒力强弱有差异。4.×。解析：弱毒疫苗通常免疫产生快、免疫力强、持续时间长；灭活疫苗产生免疫力较慢，通常需要多次免疫。5.×。解析：许多人畜共患病尚无有效疫苗，且疫苗并非万能，还需结合生物安全等综合措施。6.×。解析：实时荧光定量PCR不仅可以定性，还可以通过Ct值对模板进行精确定量。7.√。解析：生物被膜能有效阻挡抗生素渗透，是导致耐药和慢性感染的重要原因。8.√。解析：MHC分子具有高度多态性，这是不同个体对疾病易感性差异的基础。9.√。解析：猫科动物是弓形虫的终末宿主（有性生殖阶段），人和其他温血动物是中间宿主（无性生殖阶段）。10.×。解析：血清学阳性仅表示动物曾感染或接种过疫苗，不一定代表正在发病，需结合临床症状和病原学检测判定。四、简答题1.简述细菌耐药性的主要传播机制。细菌耐药性的传播机制主要包括遗传机制和传播途径两方面：（1）遗传机制：水平基因转移（HGT）：这是耐药性传播的主要方式，包括：转化：摄取游离DNA。转导：通过噬菌体介导。接合：通过性菌毛传递质粒（这是R质粒传播最主要的机制）。垂直传播：耐药菌通过分裂将耐药基因传给子代。（2）传播途径：克隆传播：耐药菌株在动物、人、环境间直接传播。移动遗传元件传播：质粒、转座子、整合子等携带耐药基因在不同菌种间穿梭。食物链传播：通过动物性食品将耐药菌或耐药基因传播给人类。环境传播：通过粪便、污水、土壤将耐药因子扩散到环境中。2.试比较灭活疫苗与弱毒疫苗的优缺点。灭活疫苗：优点：安全，无返毒风险；稳定性好，易于保存和运输；免疫原性通常较弱，常需佐剂；免疫产生较慢。缺点：免疫途径单一（多为注射）；不能诱导细胞免疫和黏膜免疫；需多次免疫；接种量大，成本较高。弱毒疫苗：优点：免疫原性强，免疫产生快，持续时间长；用量小，成本低；可诱导体液免疫、细胞免疫甚至黏膜免疫；可通过自然感染途径（如饮水、滴鼻）接种。缺点：存在毒力返强风险；对免疫缺陷动物可能有危险；稳定性较差，需冷链运输；不同疫苗间可能产生干扰。3.简述高致病性禽流感（HPAI）的临床诊断要点和紧急防控措施。临床诊断要点：流行病学：发病急、传播快、发病率高、死亡率高。症状：体温升高，精神沉郁，鸡冠发紫，脚鳞出血；头面部水肿，流泪；产蛋量急剧下降。病理变化：全身浆膜、黏膜出血（心冠脂肪、胰腺边缘、腺胃乳头出血等）；脚部鳞片出血；产蛋鸡卵黄性腹膜炎。紧急防控措施：疫情报告：立即上报兽医主管部门。隔离封锁：划定疫点、疫区、受威胁区。扑杀和无害化处理：对病禽及同群禽全部扑杀，尸体进行深埋或焚烧等无害化处理。消毒：对禽舍、场地、车辆、工具进行彻底消毒。紧急免疫：对受威胁区禽只进行紧急疫苗接种。禁止移动：疫区内禽类及其产品严禁调运。4.什么是“反向疫苗学”？它与传统疫苗研发相比有何优势？定义：反向疫苗学是指首先对病原微生物的全基因组进行测序，利用生物信息学技术分析预测所有可能的抗原蛋白（特别是表面暴露蛋白），然后通过高通量筛选技术（如克隆表达、免疫原性测试）筛选出具有保护作用的抗原，进而设计疫苗的方法。优势：不依赖培养：无需培养病原体，适用于无法体外培养的病原（如梅毒螺旋体）。筛选范围广：可筛选全基因组编码的所有抗原，不遗漏潜在的保护性抗原。安全性高：可选择非毒力成分或特定抗原表位，避免疫苗毒力返强风险。针对性强：可针对特定致病机制（如黏附素、毒素）设计疫苗。速度快：结合基因组学和蛋白质组学，可加速新发传染病疫苗的研发进程。5.简述病毒受体结合蛋白与宿主细胞受体相互作用的分子机制及其在抗病毒药物设计中的应用。分子机制：特异性识别：病毒受体结合蛋白（如流感病毒的HA、HIV的gp120）通过其特定构象与宿主细胞表面的受体分子（如唾液酸、CD4）发生高亲和力的特异性结合。构象改变：结合后，病毒蛋白或病毒粒子发生构象变化，介导病毒囊膜与细胞膜融合（包膜病毒）或病毒核酸进入细胞。组织嗜性决定：受体的分布决定了病毒感染的宿主范围和组织特异性。在抗病毒药物设计中的应用：受体阻断剂：设计可溶性受体类似物或小分子药物，竞争性结合病毒蛋白，阻断病毒吸附。融合抑制剂：针对病毒蛋白介导膜融合的构象变化过程，设计多肽抑制剂（如HIV的T20），阻止病毒进入细胞。单克隆抗体：研发针对病毒受体结合区的中和性单抗，阻断病毒与受体结合。6.列举预防兽医学研究中常用的分子生物学技术，并简述其中两种技术的原理。常用技术：PCR、实时荧光定量PCR、基因克隆、核酸测序、WesternBlot、（免疫）组织化学技术、基因芯片、CRISPR/Cas9基因编辑、ELISA（酶联免疫吸附试验）等。PCR原理：利用DNA在高温下变性、低温下复性、中温下延伸的特性，通过设计特异性引物，在TaqDNA聚合酶的催化下，体外扩增特定的DNA片段。经过20-30个循环，将微量DNA扩增数百万倍。实时荧光定量PCR原理：在PCR反应体系中加入荧光基团（如TaqMan探针或SYBRGreen），利用荧光信号积累实时监测扩增过程。通过检测荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（Ct值），与初始模板浓度呈负相关，从而对模板进行定量分析。五、论述题1.结合非洲猪瘟（ASF）的流行现状，论述其病毒学特性、致病机理以及当前防控中存在的难点和未来研究方向。流行现状：自2018年传入中国以来，ASF已对养猪业造成巨大打击。虽然疫情通过生物安全措施得到一定控制，但病毒已在部分区域定殖，呈现常态化流行趋势，且出现了基因II型低毒力变异株，增加了防控难度。病毒学特性：分类：ASFV是Asfarviridae科Asfivirus属的唯一成员，是大型双链DNA病毒（约170-190kb）。结构：有囊膜，二十面体对称，基因组庞大，编码150-200种蛋白，结构复杂。抵抗力：对环境抵抗力强，耐酸、耐碱，耐低温，在肉制品中能存活数周甚至数月。抗原型：血清型单一，但基因型多样（至少24个基因型），目前流行主要为基因II型。致病机理：靶细胞：主要感染单核巨噬细胞系统，诱导细胞凋亡。免疫逃逸：ASFV编码多种蛋白抑制宿主免疫应答，如抑制I型干扰素产生、调节MHC分子表达，导致严重的免疫抑制。病理变化：引起高热、血管内皮损伤（导致广泛出血）、淋巴结出血、脾脏肿大梗死等。防控难点：无有效商品化疫苗：灭活疫苗无效，弱毒疫苗存在安全性（毒力返强、慢性带毒）和副作用（残留毒力）问题。传播途径多样：可通过直接接触、污染物（车辆、饲料）、软蜱传播，难以彻底切断。早期诊断困难：特别是低毒力变异株感染后症状不典型，容易漏检。流行毒株变异：自然变异株的出现导致现有诊断方法漏检或疫苗效力下降。未来研究方向：新型疫苗研发：重点研发基因缺失疫苗（删除毒力基因）、亚单位疫苗、病毒载体疫苗等，平衡安全性与有效性。诊断技术升级：开发针对变异株的特异性鉴别诊断方法，提高检测灵敏度。抗病毒药物筛选：筛选能抑制ASFV复制的药物。生物安全体系优化：建立区域化生物安全隔离区，强化饲料、运输及虫媒控制。病毒致病机制研究：深入解析毒力基因功能及免疫逃逸机制。2.当前，细菌多重耐药性（MDR）已成为全球公共卫生的重大威胁。请从“全健康”视角，论述兽用抗生素耐药性的产生、传播链条及综合治理策略。“全健康”视角：人类、动物、环境健康是一个整体，耐药性问题在其中循环传播。产生原因：抗生素滥用：兽医临床治疗中盲目使用大剂量、广谱抗生素；饲料中长期添加促生长抗生素。选择压力：抗生素在动物体内和环境中持续存在，筛选出耐药菌株。耐药基因富集：养殖场环境（粪便、土壤、水体）成为耐药基因的巨大储存库。传播链条：动物-动物：耐药菌通过直接接触、空气、饲料在养殖场内及场间传播。动物-人：兽医、养殖人员通过直接接触感染；消费者通过食用被污染的肉、蛋、奶感染（食源性疾病）。动物-环境-人：动物粪便排放到环境（土壤、水源），耐药基因进入环境微生物，再通过农作物、水源或气溶胶进入人体。人-动物：人源耐药菌（如MRSA）也可能传播给宠物或家畜。综合治理策略：“减抗、禁抗”行动：严格执行国家农业农村部发布的促生长类药物饲料添加剂退出计划；规范兽医临床用药，推行处方药制度。改善养殖管理：加强生物安全，改善动物福利，提高动物自身免疫力，减少疾病发生，从而减少用药需求。环境治理：对养殖废弃物进行无害化处理（如堆肥发酵、沼气发酵），减少耐药菌和基因向环境排放。监测与预警：建立动物源细菌耐药性监测网络，定期发布耐药性监测报告，指导临床用药。替代疗法研发：积极推广疫苗免疫、中兽药、益生菌、噬菌体疗法等抗生素替代品。宣传教育：加强对养殖户、兽医和公众的科普教育，提高合理用药意识。国际合作：耐药性无国界，需加强与国际组织（OIE、WHO、FAO）的合作，共同应对。3.试述口蹄疫病毒（FMDV）的分子生物学特征（基因组结构、蛋白功能）及其对疫苗设计（如多价疫苗、标记疫苗）的影响。分子生物学特征：分类：微RNA病毒科口蹄疫病毒属，单股正链RNA病毒。基因组结构：全长约8.5kb，由5'UTR、开放阅读框（ORF）和3'UTR组成。5'端有VPg蛋白，3'端有Poly(A)尾。ORF翻译产生一个多聚蛋白，随后经病毒编码的蛋白酶（L、2A、2C、3C）裂解为成熟蛋白。蛋白功能：结构蛋白（P1区）：包括VP1、VP2、VP3、VP4。其中VP1、VP2、VP3构成衣壳蛋白，VP1含有主要的抗原位点（G-H环，含141-160位氨基酸），是诱导中和抗体的关键，也是决定血清型特异性的基础。VP4位于内部。非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D等）：参与病毒复制、蛋白酶解、宿主细胞shut-off等功能。其中3D是RNA聚合酶，3C是主要蛋白酶。对疫苗设计的影响：多价疫苗：由于FMDV有7个血清型，型间无交叉免疫保护，且同一型内不同拓扑型抗原性也有差异。因此，疫苗设计必须包含当地流行毒株的抗原成分，常需制备二价甚至三价疫苗。基因组中VP1基因的高变异性要求疫苗毒株必须定期更新以匹配流行毒株。标记疫苗：利用非结构蛋白（NSP）作为鉴别感染动物（DIVA）的标志。原理：传统灭活疫苗制备过程中可能残留NSP，导致免疫动物与自然感染动物难以区分。现代疫苗设计通过基因工程手段构建缺失特定NSP（如3ABC）的病毒作为疫苗，或仅表达VP1等结构蛋白的亚单位疫苗。应用：免疫动物仅产生针对结构蛋白的抗体，不产生针对缺失NSP的抗体；而自然感染动物会产生针对所有NSP的抗体。通过检测针对NSP（如3ABC）的ELISA抗体，即可区分免疫动物和感染动物，这对于疫病净化和国际贸易至关重要。六、实验设计题实验方案：某养殖场疑似新发病毒性传染病的病原学鉴定与溯源分析1.病料采集与处理采样对象：选择临床症状典型（发热、呼吸困难、腹泻等）和处于急性期的发病动物。采样部位：根据疑似症状采集，如呼吸道症状采集鼻拭子、肺组织；消化道症状采集粪便、肠内容物；全身症状采集血液（抗凝血）、脾脏、淋巴结等。保存运输：病料置于无菌容器，低温（4℃）保存，24小时内送检。用于病毒分离的病料需加入含抗生素（青/链霉素）的维持液以抑制细菌。预处理：组织样本研磨成匀浆，反复冻融3次，离心取上清液过滤除菌（0.22μm滤膜）。2.病毒分离细胞系选择：根据宿主和症状选择多种敏感细胞系（如Vero、BHK-21、Marc-145、PK-15、CEF等）进行盲传。培养：将处理好的病料上清液接种至单层细胞，吸附后加入维持液，置于37℃、5%CO2培养箱培养。观察：每日